張生萬，李梅，馮彥琳

（1.山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006;2.山西大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，山西 太原 030006）

醇水混合體系中藏花素褪色的動(dòng)力學(xué)反應(yīng)及機(jī)理研究

張生萬1，李梅1，馮彥琳2

（1.山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006;2.山西大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，山西 太原 030006）

從成熟的植物梔子果實(shí)中提取分離得到藏花素（1），采用半合成法制得藏紅花酸二乙酯（2）.利用紫外光譜研究了醇水混合體系中藏花素在紫外光照和自然光照下褪色的動(dòng)力學(xué)反應(yīng)，利用電子自旋共振技術(shù)研究了藏花素褪色過程中的自由基種類，利用氣相色譜／質(zhì)譜聯(lián)用對(duì)藏紅花酸二乙酯的褪色產(chǎn)物進(jìn)行了結(jié)構(gòu)推斷.結(jié)果表明：藏花素的褪色反應(yīng)遵循動(dòng)力學(xué)一級(jí)反應(yīng)，反應(yīng)速率常數(shù)隨醇／水混合體系中乙醇含量的增加而減少，且紫外光照下比自然光照下減小的更快;單線態(tài)氧和超氧陰離子參與了藏花素的褪色反應(yīng).其褪色原因主要是共軛雙鍵被氧化加成和酯鍵水解光催化重排所致.最后，提出了藏花素褪色反應(yīng)的可能途徑.

藏花素;藏紅花酸二乙酯;動(dòng)力學(xué)一級(jí)反應(yīng);褪色機(jī)理;氣－質(zhì)聯(lián)用

藏花素是從茜草科植物梔子（GardeniajasminoidesEllis）果實(shí)中提取出的一種天然色素［1］，是由藏紅花酸與龍膽二糖或葡萄糖以糖苷鍵相連而成的一類水溶性類胡蘿卜素，因具有很好的水溶性、著色力、耐熱性以及受p H值、金屬離子和常用食品添加劑影響小等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于食品與飲料行業(yè)［2－3］.近年研究也表明，藏花素不僅具有抗癌、降血脂、抑制腫瘤、消炎、保護(hù)神經(jīng)中樞的作用，還具有增強(qiáng)免疫力、保護(hù)肝臟、抗氧化等功能［4－6］.但由于其易氧化和耐光性差［2－3］，容易發(fā)生褪色反應(yīng).目前，對(duì)藏花素的研究主要集中在提取、精制、穩(wěn)定性及藥理作用等方面，對(duì)于題示內(nèi)容的研究少見報(bào)導(dǎo).

本實(shí)驗(yàn)從梔子果中分離得到純的藏花素（1），并用半合成法制得藏紅花酸二乙酯（2），合成反應(yīng)式如圖1所示.實(shí)驗(yàn)對(duì)紫外光照和自然光照下水、乙醇和醇水混合體系中藏花素褪色的動(dòng)力學(xué)反應(yīng)進(jìn)行了研究，并以藏紅花酸二乙酯作為藏花素的模型化合物對(duì)其褪色產(chǎn)物進(jìn)行了氣相色譜質(zhì)譜分析，對(duì)藏花素的褪色機(jī)理進(jìn)行了探討，旨在從根本上了解藏花素的褪色原因，為使藏花素的合理使用起到一定的指導(dǎo)作用.

圖1 半合成法制備藏紅花酸二乙酯的合成反應(yīng)式Fig.1 Synthetic reaction of diethyl ester of crocetin prepared by semi-synthesized method

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

Bruker DRX-300 MHz核磁共振儀（德國Bruker公司）;UV 2550紫外可見光譜儀（日本Shimadzu公司）;Nicolet 380傅立葉變換紅外光譜儀（美國Thermo Electron公司）;HP 5890／5988A氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國惠普公司）;Brucker ESR 300E電子自旋共振波譜儀（德國Bruker公司）.

實(shí)驗(yàn)用水為雙蒸餾水，試劑均為分析純.

1.2 儀器測(cè)定條件

1.2.1 UV-Vis測(cè)定條件

被測(cè)樣品在25℃恒溫，掃描速率為600 nm／min，掃描范圍為200～700 nm.

1.2.2 ESR測(cè)定條件

微波功率5.05 m W;微波頻率9.83 GHz;掃場(chǎng)寬度200.0 G;中心磁場(chǎng)3 486.7 G.

1.2.3 GC／MS測(cè)定條件

色譜柱：OV-101毛細(xì)管柱（25 m×0.25 mm，0.25μm）;升溫程序：60℃保持2 min，以5℃／min升至180℃;載氣（He）流速1.2 m L／min;進(jìn)樣口溫度280℃;離子源溫度180℃;電離電壓70 e V;進(jìn)樣量2μL.

1.3 方法

1.3.1 藏花素（1）的提取純化

將干燥的梔子果破碎后，用水浸、加熱至沸后過濾.濾液經(jīng)減壓蒸干水分，殘留物用乙醇提取.蒸干乙醇后，殘留物經(jīng)四氫呋喃進(jìn)一步純化，得黃色粉末.

1.3.2 藏紅花酸二乙酯（2）的制備

取1.3.1適量黃色粉末加水溶解，再加入少量鹽酸，置于58℃水浴中加熱30 min，反應(yīng)液冷卻至室溫后，用二氯甲烷多次萃取，合并有機(jī)相，并蒸干溶劑得黃色粉末.再加入適量無水乙醇，待黃色粉末溶解后加入少量濃硫酸，搖勻后于暗處過夜，用正庚烷多次萃取，合并正庚烷層，蒸干溶劑得黃色結(jié)晶.

1.3.3 藏花素（1）褪色的動(dòng)力學(xué)研究

分別配制乙醇體積分?jǐn)?shù)為0.00、0.28、0.38、0.50的5×10－4mol·dm－3藏花素醇水混合溶液，用NaOH溶液或稀H2SO4調(diào)節(jié)其p H至中性.每份溶液等分3份，1份紫外光照，1份自然光照，1份暗存.按1.2.1條件每隔一段時(shí)間測(cè)定1次溶液的紫外可見光譜.

1.3.4 藏花素（1）褪色的ESR研究

分別加入少量的DMPO和TMP于5×10－5mol·dm－3藏花素水溶液和乙醇溶液中，搖勻后置于距離紫外燈30 cm處進(jìn)行照射.按1.2.2條件每隔一段時(shí)間在Quanta-Ray Nd：YAG脈沖（10 pulses／s）激光系統(tǒng)（λ＝320 nm）下檢測(cè)反應(yīng)液中自旋加合物的ESR信號(hào).

1.3.5 藏花素模型化合物及褪色產(chǎn)物的GC／MS研究

將藏紅花酸二乙酯（2）乙醇／水混合溶液等分成兩份，1份避光存放10 d，另1份紫外光照2 h.蒸干溶劑，殘留物用少量甲醇溶解，按1.2.3條件進(jìn)行分析.

1.3.6 藏花素模型化合物光照前后紫外光譜分析

將藏紅花酸二乙酯（2）乙醇／水混合溶液等分成兩份，按1.2.1條件，1份直接測(cè)定，另1份紫外光照2 h后測(cè)定.

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

2.2 醇水混合體系中藏花素（1）褪色的動(dòng)力學(xué)研究

按1.2.1條件進(jìn)行測(cè)定紫外光照不同時(shí)間的藏花素水溶液和乙醇溶液，結(jié)果如圖2所示.

圖2 25℃時(shí)不同溶劑中藏花素隨紫外光照時(shí)間的紫外可見光譜變化：（a）水溶液（b）乙醇溶液Fig.2 Variation in UV／Vis spectra of crocin with UV irradiation time in different media at 25℃：（a）In water;（b）In ethanol

由圖2a可以看出，隨著紫外光照射時(shí)間的增加，藏花素水溶液在441 nm（λmax）處的吸光度值迅速減小.而由圖2b可以看出藏花素乙醇溶液在431 nm（λmax）處的吸光度值變化較水溶液中慢.

當(dāng)溫度為25℃、p H＝7.0時(shí)，乙醇／水混合體系（乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為0.00、0.28、0.38、0.50）中藏花素在紫外光照下褪色的動(dòng)力學(xué)研究以ln（A0／A）對(duì)紫外光照時(shí)間t作圖，結(jié)果如圖3所示.

圖3 25℃紫外光照下不同乙醇含量的醇／水混合溶劑中藏花素褪色的動(dòng)力學(xué)反應(yīng)圖Fig.3 Kinetic reaction of fading plots for crocin in different ethanol／water mixed media at 25℃ by UV irradiation

由圖3可知，ln（A0／A）對(duì)時(shí)間t作圖得一直線，斜率大于0，由此可知藏花素在紫外光照下的褪色反應(yīng)遵循動(dòng)力學(xué)一級(jí)反應(yīng).藏花素在自然光照和暗存（包括50℃、－10℃）下褪色的動(dòng)力學(xué)反應(yīng)同樣得到良好的線性關(guān)系，說明藏花素在自然光照和暗存下的褪色反應(yīng)也遵循動(dòng)力學(xué)一級(jí)反應(yīng).上述所有條件下藏花素褪色的速率常數(shù)（k）和半衰期（t1／2）見表1.

表1 不同條件下醇／水混合溶劑中藏花素發(fā)生褪色反應(yīng)的速率常數(shù)和半衰期Table 1 Rate constants and half-life periods for crocin fading in various mixed ethanol／water solvents under different conditions

續(xù)表1 不同條件下醇／水混合溶劑中藏花素發(fā)生褪色反應(yīng)的速率常數(shù)和半衰期Continue Table 1 Rate constants and half-life periods for crocin fading in various mixed ethanol／water solvents under different conditions

從表1可以看出，紫外光照下醇／水混合溶劑中藏花素褪色的速率常數(shù)k隨乙醇含量的增加而迅速減小;但自然光照下藏花素的褪色速率比紫外光照下慢得多.同時(shí)，在避光甚至高溫（50℃）環(huán)境下藏花素的褪色速率也相當(dāng)慢.由此說明藏花素的褪色反應(yīng)是一個(gè)典型的光催化反應(yīng).

2.3 藏花素（1）可能的褪色機(jī)理研究

2.3.1 利用ESR技術(shù)研究藏花素（1）光褪色過程中可能產(chǎn)生的自由基種類

實(shí)驗(yàn)1.3.4選擇DMPO和TMP作為兩種自旋捕獲劑，按1.2.2條件考察了藏花素在紫外光照下可能產(chǎn)生的自由基種類.結(jié)果顯示不僅有DMPO－O2·－自旋加合物的強(qiáng)特征信號(hào)［6條超精細(xì)譜線，超精細(xì)耦合常數(shù)αN＝13.627 G（水中），αH＝8.150 G（乙醇中）］，還有TMP－1O2自旋加合物的信號(hào)（3條譜線，αN＝

β16.502 G）.同時(shí)這些信號(hào)隨著紫外光照時(shí)間的增加而增強(qiáng).由此推測(cè)，藏花素在光褪色過程中形成了和1O2.然而，整個(gè)體系中并沒有提供生成1O2所需的光敏劑和能源.一個(gè)可能的解釋是紫外光照下藏花素自身作為光敏劑，吸收光子后躍遷至單重激發(fā)態(tài)1S，然后弛豫到三重激發(fā)態(tài)3S，與氧分子發(fā)生兩種作用：一種是與基態(tài)氧發(fā)生能量轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生1O;另一種是與基態(tài)氧發(fā)生單電子轉(zhuǎn)移，生成超氧陰離子自由基

2

2.3.2 藏花素模型化合物褪色產(chǎn)物的GC／MS分析結(jié)果

按1.3.5節(jié)方法，藏紅花酸二乙酯溶液經(jīng)紫外光照2 h后按1.2.3條件進(jìn)行測(cè)定，所得總離子流色譜（TIC）和質(zhì)譜（MS）（圖4）所示.

圖4 藏紅花酸二乙酯醇／水混合溶液紫外光照2h后降解產(chǎn)物的TIC譜（A）和MS譜（B）圖Fig.4 TIC spectra（A）and MS spectra（B）of diethyl ester of crocetin in the UV irradiation for 2 hours in the ethanol／water mixed media

由圖4A可以看出，保留時(shí)間為11.108 min時(shí)出現(xiàn)了一個(gè)峰，說明該物質(zhì)為藏紅花酸二乙酯的光照褪色產(chǎn)物，同時(shí)由圖4B可知其分子離子（M＋.）峰的m／z為344，主要碎片離子峰的m／z為326、280、252、207及192，經(jīng)質(zhì)譜解析，該物可能的結(jié)構(gòu)式為（3）式，其裂解過程如圖5.

圖5 藏紅花酸二乙酯光照褪色產(chǎn)物的質(zhì)譜裂解行為Fig.5 Mass spectrometric analysis of photofading product of diethyl ester of crocetin

2.3.3 藏花素模型化合物光照前后紫外光譜分析結(jié)果

按1.3.6節(jié)方法，對(duì)藏紅花酸二乙酯溶液光照前后進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果如圖6所示.

由圖6b可知，藏紅花酸二乙酯光照后，400～500 nm處的吸收消失，并在260.5 nm處出現(xiàn)吸收，表明其褪色產(chǎn)物發(fā)色團(tuán)最多只可能有三個(gè)雙鍵共軛.對(duì)結(jié)構(gòu)（3）式用Woodward規(guī)則［9］進(jìn)行計(jì)算，其K帶最大吸收波長為262 nm，紫外光譜計(jì)算結(jié)果與實(shí)驗(yàn)值（260.5 nm）非常吻合，表明紫外光譜測(cè)定藏紅花酸二乙酯光解產(chǎn)物結(jié)構(gòu)得到與質(zhì)譜解析相同的結(jié)論.

2.3.4 藏花素模型化合物避光存放降解產(chǎn)物的GC／MS分析結(jié)果

按1.3.5節(jié)條件，藏紅花酸二乙酯溶液避光存放10 d后，按1.2.3條件測(cè)定，所得總離子流色譜 （TIC）圖和質(zhì)譜數(shù)據(jù)如圖7和表2所示.

圖6 藏紅花酸二乙酯光照前后的吸收光譜：（a）光照前（b）光照后Fig.6 UV-Vis spectra of diethyl ester of crocetin and its fading product：（a）before light;（b）after light

圖7 藏紅花酸二乙酯醇／水混合溶液避光存放10 d的TIC圖Fig.7 TIC spectra of diethyl ester of crocetin without light for 10 days in the ethanol／water mixed media

表2 藏花素模型化合物避光存放10天降解產(chǎn)物的GC／MS分析結(jié)果Table 2 GC／MS spectra results of crocin model compound without light for 10 days in the ethanol／water solvent

由圖7和表2數(shù)據(jù)可知，避光存放主要有4種降解產(chǎn)物，組分1含量最高，其保留時(shí)間為13.554 min，M＋.峰的m／z為400，主要碎片離子m／z為355、327、282、206等.經(jīng)質(zhì)譜解析，該物可能為藏紅花酸二乙酯的氧化加成產(chǎn)物，其氧化加成可能發(fā)生在如（4）式所示的2－3碳的雙鍵上，也可能發(fā)生在4－5碳或者其它雙鍵上;組分2保留時(shí)間為10.609 min，其 M＋.峰的 m／z為342，主要碎片離子 m／z為326、282、206、192等，經(jīng)質(zhì)譜解析，該物可能為組分1水解成二酸后的重排產(chǎn)物，其結(jié)構(gòu)如（5）式所示;組分3保留時(shí)間為8.122 min，其M＋.峰的m／z為282，主要碎片離子m／z為206、142等，經(jīng)質(zhì)譜解析，該物可能為藏紅花酸二乙酯水解成二酸后的脫羧（去一分子羧基）重排產(chǎn)物，其結(jié)構(gòu)如（6）式所示;組分4保留時(shí)間為5.570 min，其M＋.峰的m／z為206，該物可能為藏紅花酸二乙酯水解成二酸后6－7碳雙鍵被氧化分解的產(chǎn)物，其結(jié)構(gòu)如（7）式所示.

2.3.5 藏花素的褪色機(jī)理

綜上所述，根據(jù)藏紅花酸二乙酯褪色產(chǎn)物結(jié)構(gòu)及其介質(zhì)極性增加（乙醇濃度減?。┧馑俾始涌斓膶?shí)驗(yàn)事實(shí)，不難推測(cè)其褪色原因主要是雙鍵被氧化加成和酯鍵水解光催化重排共軛體系受損所致.即分子中雙鍵被1O2或O·－

2氧化加成，形成環(huán)氧加合物，使共軛體系受損而褪色.另外，在醇水體系中，酯鍵也易發(fā)生水解，水解成酸后，在光催化下，極易發(fā)生順－反異構(gòu)化反應(yīng)，重排形成穩(wěn)定的六元環(huán)內(nèi)酯，使其共軛程度減小而褪色.同時(shí)也表明，避光存放褪色主要以氧化加成為主，在非避光情況下，主要以酯鍵水解光催化重排為主.并且，氧化加成可能發(fā)生在水解前也可能發(fā)生在水解后，并可能在共軛體系的任一雙鍵上發(fā)生.

任何有色物質(zhì)的色澤以及褪色行為主要決定于其發(fā)色團(tuán)結(jié)構(gòu)［9－10］.而藏花素與藏紅花酸二乙酯的長鏈共軛二酸（發(fā)色團(tuán)）結(jié)構(gòu)完全相同，故用藏紅花酸二乙酯作為藏花素的模型化合物來研究其褪色行為完全合理.由上述藏紅花酸二乙酯褪色產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)及其行為，可推測(cè)藏花素的褪色機(jī)理如圖8所示.

圖8 藏花素可能的褪色機(jī)理Fig.8 Possible fading mechanism of crocin

3 結(jié)論

在醇水體系中藏花素的褪色反應(yīng)屬于動(dòng)力學(xué)一級(jí)反應(yīng).其褪色原因是共軛雙鍵被氧化加成和酯鍵水解光催化重排所致.參與藏花素褪色反應(yīng)的氧為單線態(tài)氧1O2和超氧陰離子O·－2，由于氧化加成和異構(gòu)化重排反應(yīng)不可逆，故藏花素的褪色反應(yīng)也是不可逆的.另外，乙醇濃度增加能夠降低藏花素的褪色速率，原因可能是水溶液中乙醇含量的增加不僅能減小藏花素的水解速率，還能增加溶液中單線態(tài)氧的壽命.這兩種可能都有助于抑制藏花素的褪色反應(yīng)，故藏花素可作為酒精類飲料的一種很好的著色劑.

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Photofading Kinetics and Mechanism of Crocins in Ethanol／Water Mixed Media

ZHANG Sheng-wan1，LI Mei1，F(xiàn)ENG Yan-lin2
（1.SchoolofLifeScience，ShanxiUniversity，Taiyuan030006，China;2.SchoolofChemistryandChemicalEngineering，ShanxiUniversity，Taiyuan030006，China）

A crocin（1），which is digentiobiosyl ester of crocetin，was extracted and isolated selectively from the matured fruits of Gardenia jasminoides.A diethyl ester of crocetin（2）was prepared by semi-synthesized method.Photofading kinetic reaction of crocin in ethanol／water mixed systems was studied by UV irradiation and natural light vis UV spectra.The radical species of crocin’s fading process was studied by electron spin resonance（ESR）technique.The fading product of diethyl ester of crocetin was studied by gas chromatography-mass spectrometry（GC／MS）.The results showed that fading reaction of crocin was first-order kinetic reaction.The rate constants decreased with the content of ethanol increasing in ethanol aqueous solution.Furthermore，the rate of this reaction became much more rapidly in the condition of UV irradiation compared with natural light.Singlet oxygen and superoxide anion were both trapped by the ESR technique in the process of fading reaction.The fading phenomenon of crocin is mainly caused by oxidative addition happened to conjugated double bond，ester hydrolysis and photocatalyzing cis-trans isomerization rearrangement reaction and the possible pathway of this reaction is analyzed.

crocin;diethyl ester of crocetin;kinetic first-order reaction;photofading mechanism;gas chromatography-mass spectrometry（GC／MS）

TS202. 3;O643

A

0253-2395（2012）02-0410-07＊

2011-12- 06;

2012-02-11

山西省回國留學(xué)人員科研項(xiàng)目（2009002）

張生萬（1955－），男，山西盂縣人，教授，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)、化學(xué)計(jì)量學(xué)、藥物合成.E-mail：zswan＠sxu.edu.cn