王紹美，羅成剛，劉貫山，馮全福，蘇振剛，陳雅瓊，蔣彩虹，孫玉合

（煙草行業(yè)煙草遺傳育種重點實驗室，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266101）

蛋白質(zhì)組學(xué)是后基因組時代功能基因組學(xué)研究的新興學(xué)科和熱點領(lǐng)域。隨著各種新研究技術(shù)漸趨成熟，蛋白質(zhì)組的概念于1994年被提出[1-2]，它是從整體、動態(tài)、網(wǎng)絡(luò)的水平上對蛋白質(zhì)進(jìn)行研究，研究蛋白質(zhì)組是研究認(rèn)識復(fù)雜生命活動的要求。

蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展是隨著蛋白質(zhì)研究技術(shù)的發(fā)展而發(fā)展的。雙向電泳技術(shù)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的核心技術(shù)之一。它先后利用蛋白質(zhì)等電點和分子量的不同在兩個方向上分離蛋白質(zhì)復(fù)雜組分，因分辨率和靈敏度較高，是復(fù)雜蛋白組分檢測和分析強有力的一種生化技術(shù)。目前應(yīng)用的雙向凝膠電泳體系是以 1975年 O’Farrell首創(chuàng)的技術(shù)方案體系[3]為基礎(chǔ)，不斷改進(jìn)應(yīng)用中出現(xiàn)的問題建立起來的[4-5]。該體系克服了載體兩性電解質(zhì)陰極漂移等缺點，建立起非常穩(wěn)定的pH梯度，使雙向凝膠電泳結(jié)果的重復(fù)性和分辨率顯著提高[6]。

雙向電泳技術(shù)最初主要適于分析動物組織和微生物細(xì)胞全蛋白組分。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)的發(fā)展和不斷完善[7]，近年來，植物蛋白質(zhì)組學(xué)研究相繼借鑒動物蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法，改進(jìn)措施減少實驗中的干擾因素展開研究。如擬南芥[8]等模式植物中已廣泛展開；在水稻[9-10]、大豆[11-12]、小麥[13-14]、玉米[15-16]等重要農(nóng)作物的抗性、品質(zhì)等方面的蛋白質(zhì)組研究也取得了一定進(jìn)展，先后見諸報道。關(guān)于煙草蛋白質(zhì)組學(xué)研究可見的英文報道有：Duby 等[17]、Goulet等[18]開展了基礎(chǔ)研究；Pineda等[19]、Razavizadeh等[20]等開展了逆境脅迫研究；Kaida等[21]、Chivasa等[22]和 Millar等[23]開展了代謝調(diào)控研究；在國內(nèi)開展的煙草蛋白質(zhì)組學(xué)研究很少。本實驗的目的在于建立不同發(fā)育時期煙草葉片蛋白質(zhì)組研究適用的雙向電泳實驗體系，為進(jìn)一步開展煙草葉片蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供參考體系。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗選用中國煙草遺傳育種研究（北方）中心保存的干旱敏感型栽培煙草品種中煙100[24-25]和感黑脛病栽培煙草品種小黃金 1025[26]作為實驗品種，2010年9月種植于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所煙草種質(zhì)資源樓三樓溫室。中煙100移栽于裝有相同質(zhì)地、重量營養(yǎng)土的同一規(guī)格白色塑料花盆中，旺長后期取樣；小黃金1025假植后長到5片左右真葉取樣。兩個品種各選取6株長相一致的煙株摘取同一部位煙葉，用鋁薄紙分別包裝、標(biāo)記、裝入小布袋，迅速投入液氮罐中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 蛋白質(zhì)樣品制備與定量

1.2.1 中煙100旺長后期葉片蛋白質(zhì)樣品制備與定量 蛋白質(zhì)的提取參照 Damerval等、Tsugita等及Giavalisco等[27-29]等所記述的TCA/丙酮法稍加改進(jìn)，提取旺長后期煙草葉片總蛋白質(zhì)。

稱取1 g液氮保存的鮮煙葉樣品，按煙葉重量的10%加入PVP，加液氮充分研磨成粉末，轉(zhuǎn)入2 mL離心管。

處理1（除雜質(zhì)1次）：加入1.5 mL -20 ℃預(yù)冷丙酮，輕輕搖勻，冰浴，沉淀1 h，14 000 r/min 4 ℃離心30 min，棄上清；

處理2（除雜質(zhì)2次）：將處理1的沉淀重懸于1.5 mL預(yù)冷丙酮，重復(fù)處理1的操作一次。

沉淀用1.5 mL含10% TCA和1% DTT的丙酮懸浮，混勻，置于-20 ℃冰箱沉淀過夜；14 000 r/min 4 ℃離心30 min，棄上清；加入含0.07% DTT和1 mmol/L PMSF的預(yù)冷丙酮1.5 mL，輕搖懸浮之，冰浴，沉淀30 min，12 000 r/min 4 ℃離心30 min，棄上清；加入90%丙酮，12 000 r/min 4 ℃離心30 min，棄上清，重復(fù)同樣操作，洗滌沉淀一次；室溫晾干沉淀。在沉淀中加入250 μL裂解液[8 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，0.5%（w/v）CHAPS，2%（w/v）兩性電解質(zhì)，1%DTT，1 mmol/L PMSF]，并加入 50 μg/mL DNase I，12 000 r/min 4 ℃離心30 min，取上清用bradford法測定總蛋白質(zhì)濃度[30]，-80 ℃保存準(zhǔn)備雙向電泳分離蛋白質(zhì)。

1.2.2 小黃金 1025苗期葉片蛋白質(zhì)樣品制備與定量 蛋白質(zhì)的提取參照Giavalisco等[29]和Suxia cui等[10]的蛋白質(zhì)分級抽提法，并結(jié)合 Hurkman等[31]的蛋白質(zhì)酚抽提法和丙酮洗滌蛋白質(zhì)沉淀，稍加改進(jìn)，提取苗期煙葉總蛋白質(zhì)。

取4～5 g液氮中保存的苗期煙葉樣品置于研缽中，加液氮研磨至泛白的粉末；將新配制的抽提buffer I [抽提緩沖液Ⅰ儲液4 mL（50 mmol/L pH 7.8的 Tris-HCl、10 %甘油、1 mmol/L EDTANa2混溶于100 ml MilliQ H2O，4 ℃保存）、10 mg/mL PMSF 69.6 μL 和 2% β-巰基乙醇 4 μL]加入研缽，充分研磨后，轉(zhuǎn)入10 mL離心管，輕搖幾下，置4 ℃冰箱30 min；取出于4 ℃，14 000 r/min離心30 min，上清轉(zhuǎn)入新的15 mL離心管4 ℃保存之；沉淀中加入新配制的抽提 buffer Ⅱ [抽提緩沖液Ⅱ儲液2 mL（100 mmol/L pH 7.1的磷酸緩沖液、10%甘油、0.2 mol/L KCl、2 mmol/L MgSO4·7H2O、1 mmol/L EDTANa2溶于 100 mL MilliQ H2O，4 ℃保存）、2%（w/v）CHAPS 40 mg、10 mg/mL PMSF 34.8 μL、2% β-巰基乙醇 2 μL]懸起沉淀，輕輕混勻，靜置幾分鐘，置4 ℃冰箱30 min后取出，按加入抽提buffer Ⅱ的體積為2 mL計算，直接加入7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，30 mmol/L DTT，室溫輕輕搖勻30 min；在18 ℃，14 000 r/min，離心30 min，上清混入抽提buffer I抽提得到4 ℃保存的上清中；混合后的上清液4 ℃，14 000 r/min離心30 min，上清轉(zhuǎn)入新的離心管內(nèi)，并加同上清液等體積的Tris飽和酚，室溫?fù)u床混勻30 min，在4 ℃，14 000 r/min離心30 min，取下層酚相轉(zhuǎn)移入新的50 mL離心管中，并加入5倍體積-20 ℃保存的0.1 mol/L乙酸胺（溶于甲醇），輕輕混勻，置于4 ℃冰箱靜置過夜；第2天在4 ℃，8000 r/min離心30 min，棄上清，用-20 ℃預(yù)冷的冰丙酮2～3 mL（含 150 μL 13 mmol/L DTT）洗滌沉淀，4 ℃，8000 r/min離心15 min，重復(fù)洗滌沉淀一次并離心棄上清；去蓋，封口膜包口，膜上扎若干小孔，于-40 ℃冷凍干燥成蛋白質(zhì)凍干粉，轉(zhuǎn)入2 mL離心管用封口膜密封，-80 ℃保存?zhèn)潆p向電泳使用。

1.3 蛋白質(zhì)雙向電泳及凝膠掃描圖像分析

1.3.1 中煙100旺長后期葉片總蛋白質(zhì)樣品分離及凝膠掃描圖像分析 采用的雙向電泳技術(shù)是在O’Farrell技術(shù)方法[3]的基礎(chǔ)上稍加改進(jìn)。

用Bio-Rad的17 cm IPG預(yù)制膠條、MultiphorⅡ進(jìn)行等電聚焦。樣品定量后吸取含1 mg總蛋白的樣品溶液，用溶脹buffer（8 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，0.5%CHAPS，0.52%兩性電解質(zhì)，0.02%溴酚藍(lán)，1% DTT）稀釋至 170 μL，將溶脹 buffer泡脹好的預(yù)制膠條膠面朝上放入聚焦槽，固定上樣杯，加入蛋白質(zhì)上樣溶液進(jìn)行等電聚焦（表1）。

表1 等電聚焦程序Table 1 Running condition of isoelectric focusing (IEF)

等電聚焦結(jié)束，膠條立即置于水化盤中平衡兩次：在膠條平衡緩沖液母液（50 mmol/L Tris-HCl pH 8.8，6 mol/L尿素，30%甘油，2%SDS，0.02%溴酚藍(lán)，MilliQ H2O）中加入終濃度2% DTT制成平衡緩沖液 I，水平振蕩 15 min，用 MilliQ H2O沖洗膠條；轉(zhuǎn)入由膠條平衡緩沖液母液和終濃度為2.5% IAA制成的平衡緩沖液II，水平振蕩15 min，MilliQ H2O沖洗膠條，進(jìn)行第二向電泳。

平衡后的膠條置于12% SDS-PAGE膠上端，marker放置凝膠一端，用0.5%的瓊脂糖封膠，使用Bio-Rad公司的Protean Ⅱ Xi cell電泳系統(tǒng)，電泳儀設(shè)置：第1步，15 mA/膠，恒流電泳15 min；第2步，250 V，恒壓電泳，待溴酚藍(lán)指示劑達(dá)到底部邊緣時停止電泳。

電泳結(jié)束后，采用膠體考馬斯亮蘭G-250染色法[32]進(jìn)行凝膠染色。先用蒸餾水漂洗 3次，5 min/次，加入染色液（10%硫酸銨、10%磷酸、0.12% G250、20%甲醇）過夜，用脫色固定液（3%冰醋酸溶液、12%的無水乙醇和 MilliQ H2O）脫色多次至背景變成透明，蛋白質(zhì)點變得圓潤，最后換成MilliQ H2O洗滌30 min。

凝膠脫色完全后，用美國UMAX公司生產(chǎn)的PowerLook 2100XL圖像掃描儀掃描獲取.tif格式的凝膠圖像：圖像與原膠尺寸大小一致、透射模式、300 dpi分辨率。凝膠圖像用PDQuest軟件進(jìn)行處理、比對分析，生成比對結(jié)果報告。通過比對結(jié)果報告篩選我們需要的目標(biāo)差異蛋白質(zhì)。

1.3.2 小黃金 1025苗期葉片總蛋白質(zhì)樣品分離及凝膠掃描圖像分析 參照Huang等[33]的蛋白質(zhì)樣品再水化方法。稱取-80 ℃保存的蛋白質(zhì)干粉0.8、1.2、1.5、2.0 mg，分別置于2 mL離心管中，加入480 μL樣品水化液[7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4%（w/v）CHAPS、2‰（w/v）溴芬藍(lán)、40 mmol/L DTT、0.5%（v/v）（pH 4-7）IPG buffer]，室溫下充分溶解，10 000 r/min離心5 min去除未溶雜質(zhì)，取上清液，以 BSA作為標(biāo)準(zhǔn)對照，用Peterson[34]、Cui等[10]的方法定量蛋白質(zhì)。

參照Huang等[33]的方法進(jìn)行等電聚焦。使用Amersham Phamacia Bintech公司的 24 cm（pH 4-7）線性IPG膠條，上樣體積為450 μL，水化盤過夜水化上樣，用GE公司的Ettan IPGphor 3進(jìn)行等電聚焦，儀器運行設(shè)置為恒溫20 ℃（表2）。

表2 等電聚焦儀運行參數(shù)Table 2 IEF operation parameters

等電聚焦結(jié)束，取出膠條置于平衡管中立即平衡兩次：平衡緩沖液I含1%（w/v）的DTT；平衡緩沖液II含2.5%（w/v）的IAA外，其他步驟同1.3.1。

參照 Laemmli[35]方法制備 12.5%的第二向SDS-PAGE凝膠，平衡后的IPG膠條置于上端，用1×電極緩沖液配制0.7%的低熔點瓊脂糖（含痕量溴酚藍(lán)）封膠，用GE公司的Ettan DALTsix進(jìn)行第二向電泳，運行設(shè)置恒溫15 ℃（表3）。

表3 第二向垂直板電泳運行參數(shù)Table 3 2 Vertical board electrophoresis operation parameters

電泳結(jié)束后，凝膠用MilliQ H2O漂洗5 min，加考馬斯亮藍(lán) R-250染色液[0.1%（w/v）考馬斯亮藍(lán)R-250、45%甲醇、10%（v/v）冰乙酸]染色3 h；加脫色液[20%（v/v）乙醇、8%（v/v）冰乙酸]脫色，更換2～3次，至背景變白，蛋白質(zhì)斑點清晰鮮明。

凝膠脫色完全后，用ImageScanner Ⅲ掃描儀及ImageScanner Labscan掃描軟件掃描圖像，設(shè)置256階灰度、300 dpi透射掃描，.mel或者.TIFF格式圖像，圖像尺寸與原膠一致。凝膠圖像用軟件ImageMaster 2D Platinum 7.0進(jìn)行分析比對，生成結(jié)果報告，篩選目標(biāo)差異蛋白質(zhì)。

2 結(jié) 果

2.1 中煙100旺長后期葉片總蛋白質(zhì)提取條件的初步優(yōu)化

圖1用pH 3-10膠條對TCA/丙酮法提取煙葉總蛋白質(zhì)進(jìn)行雙向電泳預(yù)實驗。煙葉樣品液氮研磨后，a用預(yù)冷丙酮沉淀一次，雙向電泳圖譜豎條紋較濃，說明提取的總蛋白質(zhì)中雜質(zhì)較多；b用預(yù)冷丙酮沉淀兩次，雙向電泳圖譜豎條紋明顯減弱，背景較清晰。因此，TCA/丙酮法提取煙葉總蛋白質(zhì)時，用預(yù)冷丙酮沉淀研磨后的樣品兩次，可更好的去除樣品中的色素、酚類和醌等次生代謝物，更適合旺長后期煙葉蛋白質(zhì)雙向電泳分析。

圖1 液氮研磨后預(yù)冷丙酮沉淀的雙向電泳圖譜Fig.1 2-DE gel image of cold acetone precipitation after grinding leaves of zhongyan 100 with liquid nitrogen

2.2 中煙100旺長后期葉片總蛋白質(zhì)分離第一向IPG膠條的篩選

圖2中，選擇pH 3-10、pH 3-10 NL、pH 4-7的17 cm IPG膠條，用優(yōu)化的TCA/丙酮法提取總蛋白質(zhì)樣品，上樣量相同，比較雙向電泳凝膠圖譜上得到清晰圓潤蛋白質(zhì)點的數(shù)量。a膠圖清晰圓潤的蛋白質(zhì)點集中分布在pH 4～pH 8，說明集中于這一區(qū)域的蛋白質(zhì)種類和數(shù)量較多，但pH 6～pH 7分子量為66 KD左右的蛋白質(zhì)沒有得到很好的分離，且pH＜4和pH＞8區(qū)域蛋白質(zhì)點很少，輪廓不太清楚，有重疊；b膠圖清晰圓潤的蛋白質(zhì)點分布在pH 4～pH 8的區(qū)域，點的數(shù)量比a大幅減少，而pH 6～pH 7分子量為66 KD左右的蛋白質(zhì)得到了很好的分離，但pH＜4和pH＞8的蛋白質(zhì)點沒有得到分離，聚集在一起；c膠圖清晰圓潤的蛋白質(zhì)點分布在整張圖上，且在 a圖中處于 pH 6～pH 7分子量為66 KD左右沒有分離的蛋白質(zhì)得到了很好的分離，整張圖的蛋白質(zhì)點數(shù)量明顯高于前兩張膠圖。所以，pH 4-7的IPG膠條更適合 TCA/丙酮法提取的煙葉總蛋白質(zhì)雙向電泳分離。

圖2 用3種pH膠條獲得的雙向電泳圖譜Fig.2 2-DE gel patterns with three immobilized pH gradient strip

2.3 小黃金1025苗期葉片蛋白質(zhì)樣品不同上樣量的比較

分別稱取0.8、1.2、1.5、2.0 mg的小黃金1025總蛋白質(zhì)干粉，選用pH 4-7的IPG膠條，4種蛋白質(zhì)上樣量都獲得清晰的雙向凝膠電泳圖譜，經(jīng)圖像掃描和比對分析，結(jié)果表明：在實驗條件一致的情況下，蛋白質(zhì)上樣量不同導(dǎo)致凝膠圖譜上檢測出的蛋白質(zhì)點數(shù)量有差異。4種不同上樣量檢測出的蛋白質(zhì)點數(shù)量依次為：153、191、228、236個（圖3中a、b、c、d）。隨著蛋白質(zhì)上樣量的增加檢測出的低豐度蛋白質(zhì)數(shù)量也在增加，但是高豐度蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)點易發(fā)生重疊，所以在此實驗條件下，1.5 mg的總蛋白質(zhì)上樣量適合蛋白質(zhì)雙向電泳分離。

3 討 論

蛋白質(zhì)組研究的開展不僅是生命科學(xué)研究進(jìn)入后基因組時代的里程碑，也是后基因組時代生命科學(xué)研究的核心內(nèi)容之一。中國煙草基因組計劃重大專項的實施，栽培煙草的兩個祖先種——絨毛狀煙草和林煙草全基因組序列圖譜的完成，成為煙草科學(xué)發(fā)展的一個重要里程碑，標(biāo)志著煙草研究從此全面進(jìn)入基因組時代。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)將為研究煙草功能基因搭建一個良好平臺，可以為煙草基因組計劃重大專項的基因表達(dá)譜研究和分析提供良好的技術(shù)支撐。

圖3 不同蛋白質(zhì)上樣量的雙向凝膠電泳圖譜Fig.3 2-DE gel patterns with different protein quantities

目前，國內(nèi)外煙草行業(yè)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究尚屬探索階段。煙草葉片中色素、酚類和醌等次生代謝物含量較高，在蛋白質(zhì)樣品提取過程中去除不凈將影響雙向電泳圖譜的效果，因此蛋白質(zhì)樣品制備成為雙向電泳是否成功的限制因素。通過本研究，旺長后期的煙草葉片蛋白質(zhì)樣品用TCA-丙酮法提取，預(yù)冷丙酮沉淀兩次，選用Bio-Rad pH 4-7的17 cm IPG預(yù)制膠條，用Multiphor Ⅱ進(jìn)行等電聚焦，上樣杯上樣，上樣量為1 mg，上樣體積為170 μL，可以得到重復(fù)性較好，蛋白質(zhì)點清晰的雙向電泳圖譜；在此基礎(chǔ)上苗期煙草葉片總蛋白質(zhì)樣品由蛋白質(zhì)分級提取、酚抽提及丙酮洗滌相結(jié)合的方法獲得，選用Amersham Phamacia Bintech公司的24 cm pH 4-7線性IPG膠條，上樣量1.5 mg，上樣體積450 μL，水化盤過夜（12 h以上）水化上樣，同樣可得到重復(fù)性好，背景干凈，蛋白質(zhì)點清晰的雙向電泳圖譜。

蛋白質(zhì)樣品制備提取的方法很多，同一種提取方法對不同物種不同器官或組織的蛋白質(zhì)樣品提取效果不同，不同的實驗室應(yīng)針對自身的實驗需求及研究材料的特殊性，參考文獻(xiàn)中的方法通過大量試驗摸索雙向電泳最適合的條件[36-37]。本研究對煙草葉片蛋白質(zhì)的提取僅嘗試了文獻(xiàn)中的兩種方法，并參考了文獻(xiàn)中的雙向電泳程序，下一步可以對煙草葉片嘗試其它蛋白質(zhì)提取方法，并嘗試對雙向電泳程序在原有實驗的基礎(chǔ)上做進(jìn)一步的優(yōu)化，以建立起煙草葉片蛋白質(zhì)組學(xué)研究的最佳實驗條件。

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