吳茂聰，鄭維好

(1.茂名市人民醫(yī)院 骨外科，廣東 茂名 525000; 2.大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第二醫(yī)院 骨外科，遼寧 大連 116027)

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是最常見(jiàn)的一種退行性骨關(guān)節(jié)病，主要以關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)成分逐漸降解、丟失為特征，臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛，關(guān)節(jié)間隙變窄，關(guān)節(jié)功能障礙。近年來(lái)，人們對(duì)軟骨結(jié)構(gòu)、生化組成及代謝變化的認(rèn)識(shí)增多，大量證據(jù)表明Wnt/β-catenin信號(hào)通路的啟動(dòng)在OA軟骨的退變中起著十分重要的作用。本研究用強(qiáng)力霉素(doxycycline，DOX)口服和透明質(zhì)酸鈉(hyaluronic acid，HA)關(guān)節(jié)腔內(nèi)給藥治療兔OA模型，探討其治療價(jià)值及作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物及試劑

成年健康新西蘭白兔(大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)；透明質(zhì)酸鈉注射液(山東博士倫福瑞達(dá)制藥有限公司)；強(qiáng)力霉素(廣東華南制藥廠)；兔β-連環(huán)蛋白酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒(大連晨鈺生化有限公司提供)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及模型的建立

成年健康新西蘭白兔25只，雌雄不限，體重1.7～2.0 kg，分為DOX組、HA組、DOX+ HA組、模型組和正常組，每組5只。除正常組外，所有動(dòng)物均用切斷雙側(cè)膝關(guān)節(jié)前、后交叉韌帶的方法建立OA模型。術(shù)后第9周起，DOX組予強(qiáng)力霉素40 mg/(kg·d)灌胃治療，HA組予透明質(zhì)酸鈉注射液每周5 mg膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射，DOX+HA組予強(qiáng)力霉素40 mg/(kg·d)灌胃+透明質(zhì)酸鈉注射液每周5 mg膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射，模型組和正常組不予任何治療。第17周處死各組動(dòng)物， 觀察比較。

1.3 組織取材

先行膝關(guān)節(jié)大體觀察，按以下原則評(píng)分：關(guān)節(jié)面光整，色澤如常，為0分；關(guān)節(jié)面粗糙，有小的裂隙且色澤灰暗，為1分；關(guān)節(jié)面糜爛，軟骨缺損深達(dá)軟骨表中層，為2分；關(guān)節(jié)面潰瘍形成，缺損深達(dá)軟骨深層，為3分；軟骨剝脫，軟骨下骨質(zhì)暴露，為4分[1]。然后小心用刀片分別將各個(gè)膝關(guān)節(jié)股骨髁及脛骨平臺(tái)負(fù)重區(qū)軟骨削下，放入-80 ℃冰箱，待其僵硬變脆后，取出迅速用碾缽碾成粉末，并轉(zhuǎn)移至干凈試管。每個(gè)膝關(guān)節(jié)算一個(gè)標(biāo)本。每100 mg粉末組織加入2 mL 0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)，試管浸浴于冰水中，用超聲勻漿器勻漿2 min。再將勻漿物以3000 r/min離心5 min后，取上清液分裝于EP管中-20℃保存?zhèn)錂z。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

用ELISA雙抗體夾心法檢測(cè)各組標(biāo)本軟骨細(xì)胞中β-連環(huán)蛋白表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 大體解剖觀察

DOX、HA、DOX+HA三組軟骨改變以糜爛粗糙為主，部位集中在股骨髁部。模型組軟骨改變?nèi)约性诠晒趋陵P(guān)節(jié)面，以潰瘍形成為主，其中2例出現(xiàn)軟骨剝脫。對(duì)照組軟骨表面沒(méi)有明顯改變。表1示16周后大體觀察軟骨不同評(píng)分例數(shù)，給藥組軟骨退變明顯輕于模型組(P<0.01)。

表1 16周后大體觀察軟骨不同評(píng)分

Tab 1 The number of cases of different ratings in the general observation of cartilage after 16 weeks (n)

2.2 各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨中β-連環(huán)蛋白表達(dá)水平的比較

模型組軟骨中β-連環(huán)蛋白表達(dá)比正常組明顯增多(P<0.01)；與模型組相比，DOX組、HA組和DOX+HA組軟骨中β-連環(huán)蛋白表達(dá)均明顯減少(P<0.01)；DOX+HA組β-連環(huán)蛋白表達(dá)低于DOX組和HA組(P<0.01)；DOX組和HA組β-連環(huán)蛋白表達(dá)水平比較差異無(wú)顯著性意義(P>0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨中β-連環(huán)蛋白表達(dá)水平的比較Fig 1 Comparison of β-catenin expression in the rabbit knee cartilage of each group

#：與正常組比較，P<0.01；▲：與模型組比較，P<0.01；★：與DOX+HA組比較，P<0.01

#：Compared with normal group，P<0.01；▲：Compared with model group，P<0.01；★：Compared with DOX+HA group，P<0.01

3 討 論

骨關(guān)節(jié)炎(OA)是一種以關(guān)節(jié)軟骨變性、破壞及骨質(zhì)增生為特征的慢性關(guān)節(jié)病，其臨床表現(xiàn)主要為受累關(guān)節(jié)疼痛、畸形及功能障礙。其發(fā)病與肥胖、創(chuàng)傷、遺傳、內(nèi)分泌、血管病變等因素有關(guān)[2]。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外不少報(bào)道都認(rèn)為Wnt/β-catenin信號(hào)通路在OA的發(fā)病中發(fā)揮著十分重要的作用[3-5]。β-連環(huán)蛋白是Wnt/β-catenin信號(hào)通路的樞紐分子，其在胞質(zhì)內(nèi)的穩(wěn)定和累積是軟骨退變最關(guān)鍵的事件之一。

據(jù)報(bào)道，某些四環(huán)素類抗生素，如強(qiáng)力霉素(DOX)可通過(guò)抗炎、抑制MMPs和NO生成、調(diào)節(jié)細(xì)胞因子和免疫作用等多種途徑抑制軟骨的退變，改善軟骨結(jié)構(gòu)[6-9]。最近，不少研究已證實(shí)軟骨細(xì)胞內(nèi)β-連環(huán)蛋白的增加啟動(dòng)Wnt/β-catenin信號(hào)通路，作用于靶基因，導(dǎo)致MMPs生成增加[10-11]。MMPs是一族結(jié)構(gòu)相似的蛋白水解酶類的總稱，幾乎可以降解全身各組織的細(xì)胞外基質(zhì)，它的增加是導(dǎo)致OA軟骨退變的重要原因之一。本研究DOX組軟骨β-連環(huán)蛋白的表達(dá)水平較模型組明顯降低(P<0.01)，且其膝關(guān)節(jié)囊增厚、滑膜組織充血、關(guān)節(jié)滑液量、髕股關(guān)節(jié)軟骨面及股骨髁負(fù)重面軟骨損傷、軟骨表面潰瘍等病變均較模型組減輕。這說(shuō)明DOX可抑制β-連環(huán)蛋白在軟骨細(xì)胞內(nèi)累積，減少M(fèi)MPs的生成，阻止軟骨基質(zhì)的降解。目前，DOX抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的具體機(jī)理仍有待研究。

透明質(zhì)酸鈉(HA)主要由軟骨細(xì)胞和滑膜B細(xì)胞分泌，是關(guān)節(jié)滑液和軟骨基質(zhì)的重要成分。OA的發(fā)病是以關(guān)節(jié)軟骨退變開(kāi)始，關(guān)節(jié)腔內(nèi)的分解酶加速了HA的分解，從而失去HA對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的保護(hù)作用，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的進(jìn)一步破壞。所以近年來(lái)，以HA為代表的氨基糖類粘彈性物質(zhì)補(bǔ)充療法，在防治OA的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用上取得了良好的效果，為OA治療提供了新的途徑[12]。通過(guò)關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射外源性的HA有下列作用：(1) 提高關(guān)節(jié)滑液中HA含量，使其在軟骨及滑膜表面重新形成屏障，防止軟骨基質(zhì)進(jìn)一步破壞及降解。(2) 改善病理狀態(tài)下滑液的生物學(xué)功能，減輕或消除關(guān)節(jié)摩擦及疼痛，發(fā)揮對(duì)滑膜和軟骨的潤(rùn)滑及保護(hù)作用，改善關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)功能。(3) HA可與已釋放于滑液中的糖蛋白形成聚合物，抑制炎癥反應(yīng)，修復(fù)損傷軟骨。(4) 抑制白細(xì)胞移動(dòng)、趨化作用 ，降低滑膜的通透性，減少關(guān)節(jié)腔滲出液。(5) 覆蓋及保護(hù)痛覺(jué)感受器，與疼痛介質(zhì)結(jié)合，緩解疼痛，使病人膝關(guān)節(jié)活動(dòng)范圍明顯改善[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，HA補(bǔ)充治療兔膝關(guān)節(jié)OA后，關(guān)節(jié)退變較模型組減輕，軟骨中β-連環(huán)蛋白的表達(dá)水平較模型組明顯降低(P<0.01)。因此猜測(cè)補(bǔ)充HA能降低關(guān)節(jié)軟骨中β-連環(huán)蛋白的水平還與其形成的屏障作用有關(guān)：(1)提高了關(guān)節(jié)滑液中HA含量，使其能在軟骨和滑漠表面重新形成屏障，阻斷了軟骨細(xì)胞外的細(xì)胞因子(Wnts)與膜受體Frizzled結(jié)合，避免信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)胞內(nèi)引起β-連環(huán)蛋白的累積。(2)炎癥能抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的拮抗劑DKK-1的表達(dá)，啟動(dòng)Wnt/β-catenin信號(hào)通路，導(dǎo)致軟骨退變[14]，補(bǔ)充的HA可在軟骨表面形成自然屏障，并恢復(fù)關(guān)節(jié)滑液的粘彈性，阻止炎性介質(zhì)的釋放和擴(kuò)散，避免Wnt/β-catenin信號(hào)通路的異常啟動(dòng)。(3) HA使關(guān)節(jié)疼痛緩解，關(guān)節(jié)活動(dòng)度增加，后者又促進(jìn)了滑液的回流、吸收，使局部堆積的炎性介質(zhì)、組織代謝產(chǎn)物得以清除，從而改善了關(guān)節(jié)內(nèi)環(huán)境，緩解和阻斷了關(guān)節(jié)局部病變的惡性循環(huán)。

目前，干擾OA關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)退變進(jìn)程和保持正常關(guān)節(jié)功能已成為OA治療的一種新理念。DOX能減少M(fèi)MPs的生成，阻止軟骨基質(zhì)的降解，阻斷關(guān)節(jié)退變進(jìn)程。HA針對(duì)病變部位給藥，能有效地緩解癥狀，改善關(guān)節(jié)功能，比其他非局部使用的藥物發(fā)揮作用更直接迅速。本研究DOX和HA聯(lián)合應(yīng)用治療OA，療效好于兩藥單獨(dú)應(yīng)用，正符合了治療OA的新理念。隨著對(duì)DOX和HA抗OA作用機(jī)制的進(jìn)一步了解，可能為OA的臨床治療提供一種新的治療方式。

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