車(chē)治萍，李秀秀，趙西博，曾常茜，張福胤，向 彬

(1.大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院 檢驗(yàn)系，遼寧 大連 116622；2.大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 口腔科，遼寧 大連 116011； 3.大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院 口腔系，遼寧 大連 116622)

頭頸部惡性腫瘤患者術(shù)后放射治療常引起涎腺結(jié)構(gòu)及功能的損傷，導(dǎo)致放射性涎腺炎的發(fā)生，嚴(yán)重影響患者的健康和生活質(zhì)量，甚至阻礙放射治療的完成。苯腎上腺素為α1-腎上腺素受體(α1-adrenergic receptor, α1-AR)激動(dòng)劑，研究表明它可減輕大鼠腮腺放射性損傷[1]，該作用的機(jī)制尚不明確。主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex, MHC)是一組廣泛參與機(jī)體抗原提呈及免疫排斥反應(yīng)的高度多態(tài)性基因群，其中MHCⅠ類(lèi)分子表達(dá)范圍最廣，可提呈內(nèi)源性抗原，啟動(dòng)免疫應(yīng)答，從而殺傷靶細(xì)胞。正常大鼠涎腺腺泡細(xì)胞和導(dǎo)管細(xì)胞均有MHCⅠ類(lèi)分子的表達(dá)[2-3]，然而，放射損傷對(duì)頜下腺M(fèi)HCⅠ類(lèi)分子表達(dá)的影響以及苯腎上腺素對(duì)放射損傷早期頜下腺M(fèi)HCⅠ類(lèi)分子表達(dá)的作用，國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)從蛋白質(zhì)及基因水平研究放射性損傷早期大鼠頜下腺M(fèi)HCⅠ類(lèi)分子分布與表達(dá)的變化，為深入探討α1-AR受體后信號(hào)分子通路在放射性涎腺損傷中的免疫分子機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康成年Wistar大鼠27只，體重230～250 g，雌雄不限，購(gòu)自大連醫(yī)科大學(xué)SPF動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2 主要試劑及儀器

小鼠抗人HLA I單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；生物素標(biāo)記IgG、辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素及濃縮型DAB(3, 3′-diaminobenzidine, DAB)試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)公司；Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，Revert Aid First Stand cDNA Synthesis Kit購(gòu)自美國(guó)Fermentas公司，2×Taq PCR Master Mix購(gòu)自北京天根生化科技有限公司。直線加速器(Varian 23EX，美國(guó))，正置熒光落射顯微鏡(Nikon，日本)，熒光凝膠成像系統(tǒng)(UVP，美國(guó))，PCR儀(Thermo，美國(guó))。

1.3 研究方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理：將27只Wistar大鼠隨機(jī)分為3組(每組各9只)：空白對(duì)照組、單純照射組及照射給藥組(腹腔注射苯腎上腺素5 mg/kg，2次/d，連續(xù)給藥7 d；空白對(duì)照組和單純照射組經(jīng)腹腔注射等液量生理鹽水)。氯胺酮(130 mg/kg)腹腔注射麻醉后，應(yīng)用直線加速器給予單純照射組及照射給藥組大鼠頜下腺區(qū)域X線照射：照射野為3 cm×31 cm，照射靶皮距為100 cm，照射劑量率為5 Gy/min，總劑量為20 Gy。空白對(duì)照組僅腹腔注射氯胺酮，未實(shí)施照射。照射后7 d，常規(guī)麻醉下取大鼠頜下腺組織，分兩部分：一部分多聚甲醛固定，石蠟包埋；另一部分液氮冷凍，-80℃保存。進(jìn)行下列檢測(cè)。

1.3.2 免疫組織化學(xué)(ABC法)染色檢測(cè)各組大鼠頜下腺M(fèi)HCⅠ類(lèi)分子的表達(dá)：石蠟切片脫蠟水化；PBS洗3次，各5 min；3%H2O2甲醇溶液室溫孵育20 min；PBS洗3次，各5 min；微波中火在枸櫞酸鹽溶液中煮沸10 min抗原修復(fù)；PBS洗3次，各5 min；馬血清室溫封閉30 min；滴加一抗MHCⅠ類(lèi)分子(1∶200)，37℃孵育1 h后4℃過(guò)夜；PBS洗3次，各5 min；生物素標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h；PBS洗3次，各5 min；辣根酶標(biāo)記的鏈酶卵白素室溫下孵育30 min；PBS洗3次，各5 min；DAB顯色，蘇木素復(fù)染，封片。陰性對(duì)照使用PBS代替一抗。顯微鏡下觀察陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)情況。

1.3.3 RT-PCR檢測(cè)各組大鼠頜下腺M(fèi)HCⅠmRNA的表達(dá)：取各組大鼠頜下腺組織約100 mg，Trizol法提取總RNA。取5 μg RNA進(jìn)行RT-PCR。引物根據(jù)文獻(xiàn)[2]報(bào)道并由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成(表1)。PCR擴(kuò)增循環(huán)：94℃ 30 s，54℃ 60 s和72℃ 60 s；35個(gè)循環(huán)后72℃ 5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，DNA green結(jié)合后于紫外燈下觀察。UVP BioChemi System熒光凝膠成像系統(tǒng)拍照，Quantity One 4.6.2軟件對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行光密度掃描和分析。

表1 RT-PCR引物序列及產(chǎn)物大小Tab 1 Primers’ sequence and production size used for RT-PCR

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

定量數(shù)據(jù)使用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析，兩組間差異顯著性比較采用t檢驗(yàn)，多組資料分析采用單因素方差檢驗(yàn)(One-way ANOVA)。

2 結(jié) 果

2.1 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

大鼠頜下腺腺泡及導(dǎo)管細(xì)胞的胞漿和胞膜中棕黃色顆粒為MHCⅠ類(lèi)分子陽(yáng)性染色(圖1D)。單純照射組大鼠頜下腺腺泡及導(dǎo)管細(xì)胞的胞漿和胞膜中MHC Ⅰ類(lèi)分子染色較空白對(duì)照組明顯增加，以胞膜和細(xì)胞間質(zhì)的表達(dá)增多尤為顯著(圖1E)。照射給藥組MHCⅠ類(lèi)分子在腺泡細(xì)胞胞膜以及細(xì)胞間質(zhì)中的表達(dá)較單純照射組顯著減少(圖1F)。

圖1 苯腎上腺素對(duì)放射損傷后大鼠頜下腺M(fèi)HCⅠ類(lèi)分子定位與表達(dá)的影響Fig 1 Effect of phenylephrine on the distribution and expression of MHC class Ⅰ in rat submandibular glands after irradiationA：腺泡細(xì)胞；D：導(dǎo)管細(xì)胞 A，D：空白對(duì)照組；B，E：?jiǎn)渭冋丈浣M；C，F(xiàn) ：照射給藥組。A 、B和C： HE染色 ×200； D、E和F：DAB染色 ×200

2.2 RT-PCR結(jié)果

單純照射組MHCⅠ類(lèi)分子 mRNA的表達(dá)較空白對(duì)照組增加了45.85%(P<0.05)；照射給藥組MHCⅠ類(lèi)分子 mRNA的表達(dá)較單純照射組減少了33.88%(P<0.05)(圖2)。

3 討 論

涎腺由于其解剖位置的特殊性及對(duì)放射線的敏感性，在頭頸部惡性腫瘤術(shù)后放療過(guò)程中常不可避免地受到損傷，導(dǎo)致放射性涎腺炎的發(fā)生。組織病理學(xué)主要表現(xiàn)為腺泡細(xì)胞變性萎縮、細(xì)胞水腫和空泡化，導(dǎo)管擴(kuò)張，間質(zhì)纖維化和血管內(nèi)皮細(xì)胞改變，單核細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)等[4-8]。研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用苯腎上腺素可顯著減輕X線照射后早期和晚期大鼠腮腺損傷，并可維持腮腺的體積、重量和分泌功能與未照射的腺體相似[1]。然而，苯腎上腺素發(fā)揮保護(hù)涎腺抵御放射損傷的免疫機(jī)制國(guó)內(nèi)外尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。

圖2苯腎上腺素對(duì)放射損傷后大鼠頜下腺M(fèi)HCⅠmRNA表達(dá)的影響

Fig 2 Effect of phenylephrine on the expression of MHCⅠmRNA in rat submandibular glands after irradiation

Control：空白對(duì)照組；IR：?jiǎn)渭冋丈浣M；IR+PE：照射給藥組

*與空白對(duì)照組比較，P<0.05；#與單純照射組比較，P<0.05。

苯腎上腺素在臨床主要用于升高血壓、減慢心率、抗休克及陣發(fā)性室上性心動(dòng)過(guò)速的治療。然而，其在涎腺中卻起不同的作用。在涎腺的生理狀態(tài)下，α1-AR通路活化，能夠介導(dǎo)涎液中水分的主動(dòng)運(yùn)輸[9]。近年的研究發(fā)現(xiàn)，苯腎上腺素對(duì)應(yīng)激狀態(tài)下涎腺具有兩方面作用：涎液分泌促進(jìn)作用及細(xì)胞保護(hù)作用[10]。在自體血管化移植家兔頜下腺，苯腎上腺素可上調(diào)Bcl-2的表達(dá)、下調(diào)Bax的表達(dá)，抑制caspase-3和p38 MAPK的活化，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡，減輕移植頜下腺細(xì)胞缺血再灌注損傷，保護(hù)移植家兔頜下腺[11]。最近的研究還表明，苯腎上腺素激活α1-AR信號(hào)通路參與了炎癥的自主免疫調(diào)節(jié)，例如在脂多糖誘導(dǎo)的單核細(xì)胞炎癥反應(yīng)中，IL-1β表達(dá)降低，而苯腎上腺素可以使IL-1β表達(dá)增加，該作用可以被PKC抑制劑所阻斷[12]。本課題組前期研究已發(fā)現(xiàn)苯腎上腺素可以減輕放射損傷導(dǎo)致的大鼠頜下腺細(xì)胞萎縮，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討此作用是否與α1-AR信號(hào)通路激活的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制相關(guān)。

組成MHC的基因傳統(tǒng)上分為Ⅰ類(lèi)、Ⅱ類(lèi)和Ⅲ類(lèi)分子，近年來(lái)傾向于分為兩類(lèi)：一是經(jīng)典的MHCⅠ類(lèi)和Ⅱ類(lèi)基因，它們的產(chǎn)物具有抗原提呈功能，直接參與T細(xì)胞的激活和分化，調(diào)控特異性免疫應(yīng)答；二是免疫功能相關(guān)基因，包括傳統(tǒng)的Ⅱ類(lèi)基因，以及除經(jīng)典的Ⅰ類(lèi)和Ⅱ類(lèi)基因之外的新近確認(rèn)的多種基因，它們主要參與調(diào)控固有免疫應(yīng)答[13]。MHC Ⅰ類(lèi)分子表達(dá)分布于大部分組織細(xì)胞表面，為α鏈與β2微球蛋白組成的異二聚體，8條反向平行的β折疊鏈及2條平行的α螺旋共同構(gòu)成的抗原結(jié)合槽，其內(nèi)可結(jié)合8～11個(gè)氨基酸殘基的多肽，其化學(xué)成分是糖蛋白或脂蛋白，可通過(guò)與細(xì)胞間共刺激分子的協(xié)同作用，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞對(duì)內(nèi)源性抗原的識(shí)別，從而殺傷靶細(xì)胞。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，20 Gy X射線照射大鼠頜下腺后，MHC Ⅰ類(lèi)分子蛋白質(zhì)在腺泡細(xì)胞及導(dǎo)管細(xì)胞的胞漿和胞膜表達(dá)均增加，尤其以胞膜基底部和細(xì)胞間質(zhì)的表達(dá)增加更為顯著，提示MHC Ⅰ類(lèi)分子可能在頜下腺受到放射損傷后發(fā)揮了抗原提呈的作用；RT-PCR結(jié)果從轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)一步證明了放射線損傷導(dǎo)致大鼠頜下腺M(fèi)HC Ⅰ mRNA表達(dá)豐度明顯增加。從而，從基因和蛋白質(zhì)水平共同首次證明了放射線對(duì)頜下腺的損傷機(jī)制與免疫應(yīng)答相關(guān)。本研究結(jié)果與Reits等[14]應(yīng)用γ射線照射小鼠黑素瘤細(xì)胞及HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠腎細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)MHC Ⅰ類(lèi)分子表達(dá)均增加的結(jié)論相一致。放射線對(duì)頜下腺照射損傷后，連續(xù)給予苯腎上腺素7 d，MHC Ⅰ類(lèi)基因和蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平均發(fā)生了降低，提示苯腎上腺素減輕頜下腺細(xì)胞的放射線損傷的機(jī)制可能與α1-AR信號(hào)分子通路活化后介導(dǎo)的相關(guān)免疫調(diào)節(jié)機(jī)制相關(guān)。在本實(shí)驗(yàn)中，大鼠頜下腺經(jīng)放射線照射后，MHC Ⅰ類(lèi)分子的表達(dá)上調(diào)，可能增強(qiáng)了腺泡細(xì)胞和導(dǎo)管細(xì)胞向TC細(xì)胞提呈抗原的作用，從而促進(jìn)TC細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞的能力；而苯腎上腺素可能是通過(guò)下調(diào)MHC Ⅰ類(lèi)分子的表達(dá)，減弱TC細(xì)胞對(duì)自身頜下腺細(xì)胞的識(shí)別及殺傷作用，從而起到對(duì)放射損傷早期頜下腺細(xì)胞的保護(hù)作用。然而，由于機(jī)體抗原提呈作用的發(fā)揮還需要其他輔助分子如Calnexin、ERp57、Calreticulin和Tapasin等的共同參與，因此，α1-AR活化在涎腺放射損傷中介導(dǎo)的相關(guān)免疫分子機(jī)制還需進(jìn)一步研究。本研究將為從免疫分子水平尋找防治涎腺細(xì)胞放射損傷的新方法奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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