范維偉，孫慧君，蔡超俊，袁 瑋，韓國柱

(大連醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連 116044)

磷酸肌酸(phosphocreatine，PCr)是人體內(nèi)自有的活性物質(zhì)，具有維持細(xì)胞高能磷酸水平、穩(wěn)定磷脂膜、保護(hù)機(jī)體免受自由基過氧化損害等作用。目前，PCr已能人工合成并作為一種高效低毒的心肌保護(hù)藥, 為英國馬丁代爾大藥典[1]收載。雖然臨床已有將外源性磷酸肌酸作為腦損傷保護(hù)的藥物應(yīng)用,但尚未獲得相關(guān)部門正式批準(zhǔn)，基礎(chǔ)研究報道亦較少見。本文采用動物永久性腦缺血及腦缺血再灌注損傷模型觀察外源性PCr對缺血性腦損傷的保護(hù)作用,以期為臨床應(yīng)用提供相關(guān)實(shí)驗及理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗動物

雄性昆明種小鼠(體重20～24 g)，大連醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗中心提供，許可證號：SCXK(遼)2008-0002。

1.2 藥品及試劑

磷酸肌酸鈉注射用粉針劑：哈爾濱博萊制藥有限公司惠贈 070823；尼莫地平粉劑：天津中央制藥廠 (20100611)；蛋白、MDA、SOD測定試劑盒：南京建成生物工程研究所，20090421；CD14(多克隆)抗體及通用型二抗、DAB顯色試劑盒：武漢博士德生物工程有限公司，20100801；Western Blot試劑及IP細(xì)胞裂解液：碧云天生物技術(shù)研究所；Super ECL Plus超敏發(fā)光液：普利萊基因技術(shù)有限公司；余均為市售分析純。

1.3 主要儀器

CF16RX高速冷凍離心機(jī)：HITACHI,日本；水平電泳儀：大連捷邁科貿(mào)有限公司；Biospectrum AC Chemi HR 410凝膠成像系統(tǒng)：Biospeetrum，美國；754型分光光度計：尤尼可上海儀器有限公司。

1.4 外源性PCr對小鼠全腦永久性缺血損傷的影響

1.4.1 動物分組、給藥及模型制備：小鼠60只，隨機(jī)分為對照組、PCr高劑量組(4.5 g·kg-1)、PCr 低劑量組(1.5 g·kg-1)，每組20只。腹腔注射給藥，容量0.1 mL·10 g-1體重，對照組給予等容量NS。于給藥20 min后用大組織剪沿小鼠雙耳連線下部快速斷頭，制備全腦永久性缺血模型。

1.4.2 標(biāo)本處理及指標(biāo)測定：每組取10只于斷頭即刻記錄張口喘息持續(xù)時間。另10只于動物斷頭20 s取大腦，一側(cè)半球制備10%腦組織勻漿，嚴(yán)格按照試劑盒說明書測定蛋白濃度(考馬斯亮藍(lán)法)、SOD活力(黃嘌呤氧化酶法)及MDA含量(TBA法)。另側(cè)腦半球經(jīng)10%福爾馬林固定，常規(guī)制備石蠟片HE染色。

1.5 外源性PCr對小鼠全腦缺血再灌注(global brain ischemia /reperfusion GBI/R)損傷的影響

1.5.1 實(shí)驗分組、給藥及模型制備：小鼠50只，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、PCr高劑量組(2.0 g·kg-1)、低劑量組(1.0 g·kg-1)組及尼莫地平(Nim)組，每組10只。NS及PGr分別以0.1 mL·10 g-1體重于首次缺血即刻1次尾靜脈注射，Nim組術(shù)前2 d 始灌胃給藥，2次/d，每次100 mg·kg-1體重，手術(shù)當(dāng)天術(shù)前30 min末次給藥。

按文獻(xiàn)[2]方法，小鼠麻醉，雙側(cè)頸總動脈(CCA)完全阻斷血流10 min，復(fù)灌10 min，重復(fù)3次，制備全腦缺血再灌注損傷模型。假手術(shù)組僅暴露CCA，不進(jìn)行缺血再灌操作。不同處理組小鼠分別于末次再灌2 h后斷頭取腦。

1.5.2 標(biāo)本處理及指標(biāo)測定：每組取10只小鼠左側(cè)大腦測定腦組織含水量(干濕重法)

腦含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100

Western Blot法測定CD14蛋白表達(dá)：每組取6只小鼠右側(cè)大腦組織經(jīng)裂解液充分裂解后，4℃離心取上清，BCA試劑盒測定蛋白濃度。12%SDS-PAGE分離膠，5%SDS-PAGE濃縮膠。樣品經(jīng)處理后上樣，電泳、PVDF膜轉(zhuǎn)膜(恒流0.8 mA/cm，室溫，48 min)，5%脫脂奶粉封閉。Rabbit anti-Rat CD14(1∶250)以及β-Actin抗體(1∶1000)孵育過夜(4℃)，二抗(1∶5000) 37℃水浴孵育2 h。ECL暗室顯色，凝膠成像系統(tǒng)拍照后Gel-ProAnalyzer 4.0軟件分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 外源性PCr對小鼠全腦永久性缺血損傷的影響

高劑量PCr可延長小鼠永久性全腦缺血后張口喘息持續(xù)時間、增加腦組織中SOD活力，與對照組比較P<0.05。高、低劑量組小鼠腦組織中MDA含量均明顯低于對照組(P<0.05)，見表1。

Tab 1 The effects of exogenous PCr on gasping time and level of SOD、MDA in brain tissues after permanence ischemia

組別張口喘息時間(s)MDA(nmol/mgprot)SOD(U/mgprot)對照組21.4±2.98.04±3.0437.52±3.82PCr低劑量組20.3±2.15.09±3.481)37.43±4.00PCr高劑量組27.1±3.61)3.46±1.291)44.26±5.291)

1)與對照組比較,P<0.05

2.2 外源性PCr對小鼠GBI/R損傷的影響

2.2.1 外源性PCr對腦含水量的影響：與假手術(shù)組比較，GBI/R模型組腦含水量升高明顯 (P<0.05)；給予外源性PCr及Nim處理后腦含水量低于模型組，差異具有顯著性意義(P<0.05)，見表2。

2.2.2 外源性PCr對腦組織中CD14蛋白表達(dá)的影響：Western Blot法檢測顯示小鼠GBI/R后腦組織CD14蛋白表達(dá)明顯升高。不同劑量PCr處理可明顯降低CD14升高的程度。見表2，圖1。

表2外源性PCr對小鼠GBI/RF損傷后腦含水量及CD14表達(dá)的影響

Tab 2 The effects of exogenous PCr on Brain water content and expression of CD14 in brain tissue after GBI/R in mice

CD14=OD(CD14)/OD(β-Actin)；1)與假手術(shù)組比較，P<0.01； 2)與模型組比較，P<0.05

圖1外源性PCr對小鼠腦組織中CD14蛋白表達(dá)的影響

Fig 1 The effects of exogenous PCr on expression of CD14 in brain tissue after GBI/R in mice

1.模型組；2.假手術(shù)組；3.PCr低劑量組；4.PCr高劑量組；5.Nim組

2.2.3 對腦組織病理變化的影響：經(jīng)組織切片HE染色鏡下觀察，結(jié)果顯示假手術(shù)組神經(jīng)細(xì)胞大小、形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，核大而圓無固縮，間質(zhì)均勻致密；模型組可見大量神經(jīng)細(xì)胞變性，胞核固縮、深染, 細(xì)胞周圍間隙結(jié)構(gòu)松散，出現(xiàn)大量空泡， PCr及Nim給藥組與模型組相比病變程度均明顯減輕。見圖2。

3 討 論

急性腦缺血是臨床上常見的腦血管疾病之一，能量代謝障礙是導(dǎo)致細(xì)胞損傷的觸發(fā)因素，有效提供能量是缺血早期治療，減輕組織損傷的關(guān)鍵。本研究所用小鼠腦缺血性損傷模型具有良好的重現(xiàn)性，損傷指標(biāo)明確。

磷酸肌酸(phosphocreatine，PCr)是體內(nèi)高能磷酸化合物的儲存形式，其分子中含高能量的氨基磷酸鍵，在細(xì)胞中水解可產(chǎn)生超過12000 kal/mol能量，是細(xì)胞的重要能源物質(zhì)[3]。在組織大量消耗ATP，導(dǎo)致ADP增多時，PCr可將其磷酸鍵轉(zhuǎn)移給ADP生成ATP以補(bǔ)充能量的供應(yīng)，在生理及應(yīng)激條件下通過此反應(yīng)維持機(jī)體能量代謝的動態(tài)平衡[4-5]同時具有穩(wěn)定磷脂膜、保護(hù)細(xì)胞免受自由基過氧化損害等作用[6]。近期有研究認(rèn)為,PCr的作用方式可能有以下兩方面:(1)通過PCr分子起作用,其含有的高能磷酸鍵參與能量代謝,使ATP生成增加；(2)通過其體內(nèi)代謝產(chǎn)物肌酸(creatine，Cr)發(fā)揮作用,在這種情況下,PCr作為Cr的一個前體藥物或載體而發(fā)揮作用[7]。

腦缺血時可產(chǎn)生大量氧自由基攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸,引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用，引起細(xì)胞損傷。此過程生成的MDA等脂質(zhì)過氧化物的分解產(chǎn)物亦可造成細(xì)胞損傷。SOD清除超氧陰離子自由基,保護(hù)細(xì)胞免受損傷。將MDA與SOD配合測定，以反映機(jī)體氧化損傷和抗氧化能力是本類研究常用方法。

圖2外源性PCr對小鼠GBI/R腦組織病理形態(tài)學(xué)的影響(HE染色)
Fig 2 The effects of exogenous PCr on pathomorphology changes in brain tissue after GBI/R in mice (H&E Staining)
1. 模型組； 2. 假手術(shù)組； 3.PCr低劑量組； 4.PCr高劑量組； 5.Nim組

諸多研究已證實(shí)，急性腦缺血時因中樞神經(jīng)功能障礙導(dǎo)致植物神經(jīng)功能紊亂，加之機(jī)體發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致腸黏膜屏障功能受損，細(xì)菌移位、大量內(nèi)毒素釋放并誘導(dǎo)細(xì)胞表面受體(CD14)表達(dá)增多，參與并加重組織損傷，甚至觸發(fā)多器官功能障礙綜合征的發(fā)生。

本研究結(jié)果顯示外源性PCr可明顯延長全腦永久性缺血后張口呼吸時間；減輕腦水腫及損傷后腦組織形態(tài)學(xué)改變。顯示外源性PCr可有效緩解腦缺血性損傷，維持腦功能。而降低組織MDA含量、提高SOD活力；抑制損傷后CD14表達(dá)則提示PCr抗腦缺血性損傷作用可能通過增加供能、穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)腺苷酸池，穩(wěn)定磷脂膜等機(jī)制，進(jìn)而提高組織抗氧化性損傷能力及降低繼發(fā)性內(nèi)毒素攻擊、保護(hù)細(xì)胞有關(guān)。

本研究在一定程度上證實(shí)了在腦缺血早期給予外源性PCr可有效減輕腦組織缺血及缺血再灌注損傷，維持腦功能，并有可能減輕腦損傷繼發(fā)的其他組織器官損傷。為臨床用藥提供了實(shí)驗和理論依據(jù)。

[1] The Royal Pharmaceutical Society. Martindale:The Extra Pharmacopoeia[M]. 31st ed. London: Pharmaceutical Press,1996.1695.

[2] Du GH, Qiu Y, Zhang JT. Salvianolic acid B protects the memory functions against transient cerebral ischemia in mice[J]. JNA PR, 2000, 2(2) :145-152.

[3] 秦厲杰.外源性磷酸肌酸治療急性腦梗死的療效觀察[J].中國實(shí)用神經(jīng)疾病雜志,2007,10(3)： 31-32.

[4] Jiang YF，Pan YS，Huang QF，et al.The effect of herbs on cerebral energy metabolism in cerebral ischemia-reperfusion mice[J].Chin Med J，2001，114(8)：881-883.

[5] 張穎，蔣玉鳳，劉智勤，等.丹酚酸B對小鼠腦缺血不同時間腦能量代謝及腦水腫的作用[J].藥學(xué)學(xué)報，2007，42(12)：1250-1253.

[6] 王汝衛(wèi).磷酸肌酸的藥理與臨床應(yīng)用[J].首都醫(yī)藥，1999，6(5)：32.

[7] 鄒玲莉,李秋莎,韓國柱,等.外源性磷酸肌酸在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)和代謝處置[J].藥學(xué)學(xué)報, 2011,46(1):75-80.