華正宇，張春蕾

(1.大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 病理科，遼寧 大連116011； 2.大連大學(xué) 附屬中山醫(yī)院 中心實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116001)

腦缺血再灌注損傷是一個(gè)復(fù)雜的病理生理過(guò)程，近幾年來(lái)許多臨床研究報(bào)告肯定了亞低溫的腦保護(hù)作用[1]。研究發(fā)現(xiàn)亞低溫腦保護(hù)作用的機(jī)制，可能涉及到損傷級(jí)聯(lián)中的多個(gè)事件，從多個(gè)環(huán)節(jié)影響基因、蛋白質(zhì)的表達(dá)[2]。熱休克蛋白70(heat shock protein 70, HSP70)是所有原核細(xì)胞和真核細(xì)胞在高溫或應(yīng)激情況下所產(chǎn)生的一組具有高度保守性的蛋白質(zhì)。HSP70在腦缺血再灌注損傷中的表達(dá)研究報(bào)道較多，但亞低溫對(duì)腦缺血再灌注損傷中HSP70表達(dá)影響的研究報(bào)道較少。本研究通過(guò)亞低溫對(duì)缺血再灌注腦組織HSP70表達(dá)和細(xì)胞凋亡的影響，探討亞低溫對(duì)腦缺血再灌注保護(hù)作用的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

健康SD雄性大鼠56只，體重(200～230)g，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(黑)20020002]，標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下飼養(yǎng)(常溫自由進(jìn)食飲水)。將大鼠隨機(jī)分為4組(正常組、假手術(shù)組、常溫缺血組和亞低溫缺血組)，正常組和假手術(shù)組每組4只，常溫缺血組和亞低溫缺血組每組24只，兩缺血組分別分為再灌注3、6、12、24、72 h和7 d組，每組4只。

1.2 動(dòng)物模型的制備

采用改良的Longa線拴法建立大鼠局灶腦缺血再灌注損傷模型。假手術(shù)組大鼠除不栓塞大腦中動(dòng)脈外，余處理同缺血組。亞低溫組大鼠于腦缺血后13 min左右采用可調(diào)控亞低溫儀[哈爾濱工業(yè)大學(xué)熱工教研室研制，專利號(hào)：ZL98236936.0]誘導(dǎo)頭部亞低溫，使大鼠于腦缺血后30 min時(shí)病灶側(cè)腦組織溫度控制在32～33℃。參照Longa等[3]的評(píng)分法，0分：無(wú)神經(jīng)缺損癥狀；1分：右前肢屈曲；2分：向右旋轉(zhuǎn)；3分：向右傾倒；4分：不能行走或昏迷。1～4分為有效模型，納入實(shí)驗(yàn)分組。出血較多，梗死灶不明顯或提前死亡的大鼠均剔除。

1.3 HE染色觀察神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變

各組大鼠于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)戊巴比妥鈉過(guò)量麻醉，用10%的甲醛溶液行心臟灌流固定后斷頭取腦，自視交叉向前后各取2.5 mm左右的冠狀腦片，充分固定脫水透明后石蠟包埋，連續(xù)切片作HE染色。

1.4 免疫組化染色檢測(cè)腦組織HSP70表達(dá)

按照HSP70免疫組化試劑盒(購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司)說(shuō)明進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。光鏡下神經(jīng)元胞漿中有棕黃色顆粒的為陽(yáng)性細(xì)胞。每張切片于梗死灶周圍選擇10個(gè)表達(dá)最強(qiáng)的高倍視野計(jì)數(shù)。

1.5 細(xì)胞凋亡的檢測(cè)

TUNEL試劑盒購(gòu)自Roche公司，步驟同說(shuō)明書(shū)。光鏡下神經(jīng)元胞核中有棕黃色顆粒的為陽(yáng)性細(xì)胞。每張切片于梗死灶周圍選擇10個(gè)表達(dá)最強(qiáng)的高倍視野計(jì)數(shù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 病理形態(tài)學(xué)觀察

正常組及假手術(shù)組均未見(jiàn)明顯病理改變。常溫缺血組可見(jiàn)梗死灶主要位于大鼠左側(cè)大腦皮質(zhì)及基底核區(qū)，呈典型的缺血性改變，神經(jīng)氈疏松，組織水腫明顯，神經(jīng)元變性、壞死，胞體縮小，尼氏體消失，胞核固縮、碎裂、溶解，胞漿呈嗜酸性變。病變部位與周圍組織界限較清楚，其中心區(qū)神經(jīng)元數(shù)量明顯減少。亞低溫缺血組較腦缺血組梗死灶明顯減小，梗死灶內(nèi)殘存的神經(jīng)元較多，可見(jiàn)輕度缺血性改變，腦水腫明顯減輕(圖1)。

2.2 腦組織HSP70表達(dá)

正常組及假手術(shù)組未見(jiàn)或偶見(jiàn)HSP70陽(yáng)性細(xì)胞；缺血組HSP70陽(yáng)性細(xì)胞較多；亞低溫組在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)均明顯減少(P<0.05)，見(jiàn)表1，圖2。

組別陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(個(gè)/40倍視野)損傷后3h損傷后6h損傷后12h損傷后24h損傷后72h損傷后7d常溫缺血組21.35±1.3618.75±0.6516.80±1.5015.62±1.4013.25±0.9010.22±0.72亞低溫缺血組15.50±1.201)12.75±0.901)10.45±0.851)8.00±1.251)6.95±0.821)6.21±0.761)

1) 與相同時(shí)間點(diǎn)的常溫缺血組比較，P<0.05

圖1 缺血再灌注24 h大鼠腦組織病理形態(tài)(HE染色 ×100)Fig 1 Ischemia/reperfusion 24 h pathological changes in rat brain tissue(hematoxylin and eosin ×100)A. 常溫缺血組梗死灶明顯形成，大量神經(jīng)元壞死消失; B. 亞低溫缺血組梗死灶明顯減小，可見(jiàn)神經(jīng)元固縮

A. Infarction region formed obviously with lots of neurons lost in normothermia ischemia/reperfusion group； B. Infarction region minished obviously with lots of neurons pyknosis in hypothermia ischemia/reperfusion group

圖2 缺血再灌注24 h大鼠腦組織 HSP70表達(dá)(SP法 ×200)Fig 2 Ischemia/reperfusion 24 h HSP70 positive neurons in rat brain tissue (SP ×200)A. 常溫缺血組HSP70陽(yáng)性細(xì)胞較多； B. 亞低溫缺血組HSP70陽(yáng)性細(xì)胞較少

A. The expressions of HSP70 were higher in normothermia ischemia/reperfusion group；B. The expressions of HSP70 were lower in hypothermia ischemia/reperfusion group

2.3 TUNEL結(jié)果

TUNEL主要標(biāo)記神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞。常溫缺血組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)隨再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增多，至72 h達(dá)高峰；亞低溫缺血組各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)明顯減少(P<0.05)，見(jiàn)表2，圖3。

組別陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(個(gè)/40倍視野)損傷后3h損傷后6h損傷后12h損傷后24h損傷后72h損傷后7d常溫缺血組0.80±0.203.50±0.435.23±0.357.00±0.5011.45±0.707.56±0.40亞低溫缺血組0.70±0.101.80±0.351)3.10±0.321)5.20±0.551)9.00±0.811)5.62±0.531)

1)與相同時(shí)間點(diǎn)的常溫缺血組比較，P<0.05

圖3 缺血再灌注72 h大鼠腦組織TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)(×200)Fig 3 Ischemia/reperfusion 72 h TUNEL positive cells in rat brain tissue(×200)A. 常溫缺血組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞較多； B. 亞低溫缺血組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞較少

A. The expressions of TUNEL were higher in normothermia ischemia/reperfusion group； B. The expressions of TUNEL were lower in hypothermia ischemia/reperfusion group

3 討 論

熱休克蛋白是一類在進(jìn)化上高度保守，廣泛存在于原核和真核細(xì)胞內(nèi)的，在高溫、缺血、缺氧、損傷等應(yīng)激情況下誘導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，又稱熱應(yīng)激蛋白。其中HSP70是最保守和最主要的一類，在大多數(shù)生物中含量最高，它發(fā)揮“分子伴侶”的作用而增加細(xì)胞對(duì)應(yīng)激的耐受性，參與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的折疊、裝配、降解、轉(zhuǎn)移和修復(fù)等過(guò)程，以維護(hù)細(xì)胞的蛋白自穩(wěn)系統(tǒng)，在細(xì)胞的信息傳遞、生長(zhǎng)、分化中具有重要的調(diào)控作用。同時(shí)，它又可以作為一種內(nèi)源性保護(hù)物質(zhì)對(duì)細(xì)胞的損傷產(chǎn)生自身保護(hù)作用。研究發(fā)現(xiàn)，缺血、創(chuàng)傷、氧化應(yīng)激等均導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)HSP70的大量表達(dá)，HSP70被認(rèn)為是損傷后腦組織產(chǎn)生的一種重要的內(nèi)源性保護(hù)因子[4]，在缺血早期對(duì)神經(jīng)元具有保護(hù)作用，在缺血后期對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)起著重要作用[5]，其表達(dá)的強(qiáng)度可在一定程度上反映神經(jīng)細(xì)胞的損傷程度及對(duì)缺血損傷的耐受性，是缺血性腦損傷較為敏感的指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，常溫缺血組HSP70陽(yáng)性細(xì)胞較多，亞低溫缺血組在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)較常溫缺血組HSP70陽(yáng)性細(xì)胞均明顯減少，推測(cè)亞低溫可能通過(guò)降低腦組織氧耗量，提高腦組織對(duì)缺血缺氧的耐受性，從而保護(hù)血腦屏障，減少多種有害物質(zhì)產(chǎn)生，提高離子穩(wěn)定性，減少Ca2+內(nèi)流，腦組織缺血性的損傷程度明顯減輕，使HSP70在神經(jīng)細(xì)胞受損時(shí)的保護(hù)性表達(dá)程度降低，提示亞低溫治療腦缺血再灌注損傷不是通過(guò)誘導(dǎo)HSP70的表達(dá)而起保護(hù)作用。張秀洲等[6]通過(guò)制作右側(cè)大腦中動(dòng)脈阻塞(MCAO)模型，觀察缺血2 h再灌注48 h后大鼠腦組織學(xué)改變和HSP70及膠質(zhì)纖維酸性蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，常溫組可見(jiàn)大量HSP70陽(yáng)性細(xì)胞，胞漿呈棕黃色，染色較深，亞低溫組HSP70陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比常溫組少，而且染色較淺，這與本研究結(jié)果相符。

腦缺血再灌注損傷的病理生理是一個(gè)多環(huán)節(jié)、多因素、多途徑損傷的酶促級(jí)聯(lián)反應(yīng)，其機(jī)制與氧自由基損傷、興奮性氨基酸毒性、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、凋亡、炎癥反應(yīng)等多種因素有關(guān)[7]。亞低溫對(duì)缺血性腦損傷的保護(hù)作用也是多因素相互作用共同完成的，如①降低腦組織氧耗量，減輕腦組織酸中毒[8]；②保護(hù)血腦屏障，減輕缺血再灌注損傷[9]；③減緩腦細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，減輕神經(jīng)元損傷以及腦水腫程度[10]；④降低氨基酸遞質(zhì)的釋放，減輕興奮性毒性腦損傷[11]；⑤抑制氧自由基的生成[12]；⑥抑制炎癥介質(zhì)的釋放及炎性反應(yīng)[13]；⑦抑制一氧化氮合酶活性[14]；⑧抑制神經(jīng)元凋亡[15]等。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)病理形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)常溫缺血組腦組織梗死灶明顯，呈典型的缺血性改變，神經(jīng)氈疏松，組織水腫明顯，神經(jīng)元變性、壞死，胞體縮小，尼氏體消失，胞核固縮、碎裂、溶解，胞漿呈嗜酸性變。亞低溫缺血組較常溫缺血組梗死灶明顯減小，梗死灶內(nèi)殘存的神經(jīng)元較多，可見(jiàn)神經(jīng)元固縮和輕度缺血性改變，腦水腫明顯減輕，說(shuō)明亞低溫可以減輕缺血再灌注后腦組織的損傷。發(fā)生損傷性缺血再灌注后，腦組織中產(chǎn)生大量的自由基、興奮性氨基酸及NO，這些物質(zhì)除了自身對(duì)細(xì)胞的直接毒性作用外，還下調(diào)參與應(yīng)激保護(hù)的生物活性物質(zhì)，下調(diào)Bcl-2等基因的表達(dá)等，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[16]。本實(shí)驗(yàn)凋亡細(xì)胞的檢測(cè)結(jié)果顯示，常溫缺血組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)隨再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增多，至72 h達(dá)高峰；亞低溫缺血組各時(shí)間點(diǎn)TUNEL的表達(dá)較常溫缺血組明顯減少，說(shuō)明亞低溫可以抑制神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞凋亡。

[1] 張同圓，王龍.重型顱腦損傷圍術(shù)期亞低溫治療路徑—循證醫(yī)學(xué)指導(dǎo)下的治療抉擇[J].醫(yī)學(xué)與哲學(xué)(臨床決策論壇版)，2010，31(9)：3-4.

[2] 潘寧, 杜怡峰. 亞低溫腦保護(hù)的分子生物學(xué)機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 中華老年心腦血管病雜志, 2008, 10(7)：555-557.

[3] Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S, et al. Reversible middle cerebral artery: occlusion without craniectomy in rats[J]. Stroke, 1989, 20(1)：84-91.

[4] 馬旭，呂剛.HSP-70與細(xì)胞保護(hù)的研究進(jìn)展[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，29(2):194-197.

[5] 劉耘，史佳巍，袁翔宇.丹星通絡(luò)湯對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠熱休克蛋白70表達(dá)的影響[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2007，16(11)：1463-1465.

[6] 張秀洲，李文華，劉雪平.亞低溫對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后熱休克蛋白70及膠質(zhì)纖維酸性蛋白表達(dá)的影響[J].臨床神經(jīng)病學(xué)雜志，2006，19(2)：112-114.

[7] Ferrer I，Planas AM.Signaling of cell death and cell survival following focal cerebral ischemia：life and death struggle in the penumbra[J].J Neuropathol Exp Neurol，2003，62(4)：329-339.

[8] Erecinska M，Thoresen M，Silver IA，et al.Effects of hypothermia on energy metabolism in Mammalian central nervous system[J].J Cerebr Blood F Met，2003，23(5):513- 530.

[9] Shiozaki T，Nakajima Y，Taneda M，et al.Efficacy of moderate hypothermia in patients with severe head injury and intracranial hypertension refractory to mild hypothermia[J].J Neurosurg，2003，99(1):47-51.

[10] 周峰，鄭豐任.亞低溫對(duì)顱腦損傷后腦細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度及腦水腫影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].創(chuàng)傷外科雜志，2003，5(3):191-194.

[11] Van Hemelrijck A，Vermijlen D，Hachimi-Idrissi S，et al.Effect of resuscitative mild hypothermia on glutamate and dopamine release，apoptosis and ischaemic brain damage in the endothelin-1 rat model for focal cerebral ischaemia[J].J Neurochem，2003，87(1):66-75.

[12] 林淑香，劉亢丁，付鐵娟，等.亞低溫對(duì)大鼠局灶性腦缺血氧自由基和一氧化氮的影響[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2009，13(12):1680-1682.

[13] Wang GJ，Deng HY，Maier CM，et al.Mild hypothermia reduces ICAM-1 expression，neutrophil infiltration and microglia/monocyte accumulation following experimental stroke[J].Neuroscience，2002，114(4):1081-1090.

[14] Karabiyikoglu M，Han HS，Yenari MA，et al.Attenuation of nitric oxide synthase isoform expression by mild hypothermia after focal cerebral ischemia: variations depending on timing of cooling[J].J Neurosurg，2003，98(6):1271-1276.

[15] Wang LM，Yan Y，Zou LJ，et al.Moderate hypothermia prevents neural cell apoptosis following spinal cord ischemia in rabbits[J].Cell Res，2005，15(5):387-393.

[16] 呂鵬，李玲，張麗.大鼠全腦缺血對(duì)再灌注海馬區(qū)NO含量和Bcl-2表達(dá)的影響[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，31(6):649-652.