魏陵博薛銀玲李運(yùn)倫遲立萍鐘志歡吉中強(qiáng)焦華琛

（1.山東省青島市海慈醫(yī)療集團(tuán)，山東青島266033；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東濟(jì)南250355）

成纖維細(xì)胞（CFs）增殖及心肌中纖維性膠原成分不成比例的增多是心肌纖維化病理改變的基礎(chǔ)，導(dǎo)致心室重構(gòu)。血管外膜成纖維細(xì)胞（VAF）的異常增殖及膠原的過度沉積參與了血管纖維化及再狹窄過程［1］。本研究用解毒通絡(luò)方含藥血清干預(yù)新生大鼠主動(dòng)脈成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)，測(cè)定成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物1～4 d 齡新生清潔級(jí)SD大鼠，雌雄不限，購自山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 藥物解毒通絡(luò)方：黃連12 g，大黃3 g，連翹15 g，野葛根30 g，水蛭6 g，地龍12 g，由山東中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院按制備滅菌合劑的常規(guī)方法 制成，每1 mL相當(dāng)于生藥材1 g。

1.3 含藥血清制備取健康Wistar雄性大鼠12只，體質(zhì)量（200±20）g，灌服解毒通絡(luò)方合劑，按2 mL/100 g給藥（大約相當(dāng)于60 kg成人日劑量的15倍）。灌胃前12 h禁食不禁水，每日1次，連續(xù)給藥7 d。于末次給藥2 h后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，無菌條件下腹主動(dòng)脈取血，置無菌試管內(nèi)。待凝固后37℃水浴1 h，3000 r/min，離心15 min，分離血清，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩ＥR用時(shí)，56℃恒溫30 min滅活，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌。含藥血清呈淡黃清亮透明液體。

1.4 試劑與儀器AngⅡ、胰蛋白酶、噻唑蘭（MTT），Sigma公司產(chǎn)品；DMEM培養(yǎng)基，賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司產(chǎn)品；胎牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司產(chǎn)品；波形蛋白單克隆抗體產(chǎn)品、纖維連接蛋白單克隆抗體產(chǎn)品、α-肌動(dòng)蛋白單克隆抗體產(chǎn)品和SABC試劑盒，均為武漢博士德工程有限公司產(chǎn)品。96、24孔平底培養(yǎng)板：丹麥Costar公司。酶標(biāo)儀safire2：瑞士TECAN公司，CO2培養(yǎng)箱（HERAEUS）：美瑞泰克科技北京公司；超凈工作臺(tái)（AIRTECH）：上海力申科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)；XDS-1B型倒置顯微鏡，重慶光電公司產(chǎn)品。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定采用組織貼塊法培養(yǎng)大鼠胸主動(dòng)脈成纖維細(xì)胞，胰蛋白酶消化法作傳代培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡下觀察并作血管成纖維細(xì)胞α-actin和Vimentin免疫細(xì)胞化學(xué)染色進(jìn)行鑒定。血管外膜成纖維細(xì)胞（VAF）為貼壁生長(zhǎng)型細(xì)胞，VAF呈長(zhǎng)梭形或不規(guī)則多角形，細(xì)胞質(zhì)透明，向外伸出2～3個(gè)長(zhǎng)短不一的突起，胞核比較大，細(xì)胞界限較清楚，生長(zhǎng)排列較規(guī)律，多呈放射狀、編織狀或螺旋狀走行。成纖維細(xì)胞α-actin和Vimentin免疫細(xì)胞化學(xué)染色，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞Vimentin單抗染色陽性，胞漿中有棕黃色絲狀網(wǎng)絡(luò)及顆粒，而α-actin單抗染色表達(dá)陰性。結(jié)果 見下圖。

圖1

1.6 細(xì)胞分組與干預(yù)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期4～8代VAF，0.25%胰酶消化，以含15%FBS的DMEM調(diào)整細(xì)胞濃度為4×104/mL，以每孔200 μL（8×103/孔）接種于96孔板（設(shè)第1列第1孔為不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的空白孔，其他實(shí)驗(yàn)步驟保持一致），37℃、5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng)1～2 d后細(xì)胞長(zhǎng)滿96孔培養(yǎng)板的80%～90%。再將培養(yǎng)液換為含1%FBS的DMEM培養(yǎng)基使細(xì)胞生長(zhǎng)趨于靜止，24 h后按組加入含不同藥物、不同濃度的無血清DMEM，培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h。每孔加入MTT20 μL（15 mg/mL）37℃溫育4 h，然后終止培養(yǎng)，吸棄上清，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，使甲臜結(jié)晶顆粒溶解為均勻的藍(lán)紫色，以空白孔調(diào)零，在酶標(biāo)儀波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定吸光度（OD）值，記錄結(jié)果 。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)以（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析進(jìn)行處理，方差不齊時(shí)采用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 卡托普利干預(yù)劑量的篩選結(jié)果 見表1。鹿燕敏等［2］用1×10-7mol/L劑量AngⅡ刺激24 h后細(xì)胞增殖效應(yīng)明顯，說明一定濃度的AngⅡ能引起血管成纖維細(xì)胞增殖。筆者在預(yù)實(shí)驗(yàn)過程中選取了2×10-7mol/L AngⅡ體外干預(yù)VAF細(xì)胞，引起細(xì)胞增殖，與正常對(duì)照組相比有顯著差異。所以在本實(shí)驗(yàn)中選取AngⅡ濃度為2×10-7mol/L為刺激濃度。然后選擇卡托普利拮抗AngⅡ的最低有效劑量，隨機(jī)分組。（1）DMSO溶媒對(duì)照組：10%FBS的DMEM培養(yǎng)基、1%DMSO，不加特殊處理因素；（2）AngⅡ組：AngⅡ終濃度為2×10-7mol/L、10%FBS的DMEM培養(yǎng)基；（3）卡托普利不同劑量組：AngⅡ濃度為2×10-7mol/L+卡托普利50 μg/mL、AngⅡ濃度為2×10-7mol/L+卡托普利200 μg/mL、AngⅡ濃度為2×10-7mol/L+卡托普利400 μg/mL、AngⅡ濃度為2×10-7mol/L+卡托普利1000 μg/mL。

表1 卡托普利對(duì)AngⅡ刺激下的成纖維細(xì)胞增殖的影響（±s）

表1 卡托普利對(duì)AngⅡ刺激下的成纖維細(xì)胞增殖的影響（±s）

與正常組比較，*P＜0.01；與AngⅡ組比較，△P＜0.01。

OD值正常細(xì)胞組0.64±0.12 AngⅡ組1.02±0.07*卡托普利組0.66±0.05△卡托普利組0.59±0.02△卡托普利組0.48±0.13*△卡托普利組0.16±0.02*△組別劑量—2×10-7mol/L 50 μg/mL 200 μg/mL 400 μg/mL 1000 μg/mL n666666

結(jié)果 表明，AngⅡ組明顯刺激血管成纖維細(xì)胞的增生，卡托普利各組均能拮抗AngⅡ的作用；卡托普利組在400 μg/mL與1000 μg/mL時(shí)與正常組相比有顯著差異，在下面的實(shí)驗(yàn)中選擇卡托普利組400 μg/mL。

2.2 不同濃度含藥血清與卡托普利拮抗AngⅡ刺激作用的比較見表2。（1）DMSO溶媒對(duì)照組：10%FBS的DMEM培養(yǎng)基、1%DMSO，不加特殊處理因素。（2）卡托普利組：AngⅡ濃度為2×10-7mol/L+卡托普利400 mg/mL。（3）含藥血清不同劑量組：AngⅡ濃度為2×10-7mol/L+含藥血清30%、20%、10%、5%。

表2 不同濃度含藥血清拮抗AngⅡ刺激下的成纖維細(xì)胞增殖的影響（±s）

表2 不同濃度含藥血清拮抗AngⅡ刺激下的成纖維細(xì)胞增殖的影響（±s）

與正常組比較，*P＜0.01；與卡托普利組比較，△P＜0.01。從5%濃度起，隨濃度梯度的增加，OD值的降低有顯著差異。

OD值正常細(xì)胞組0.64±0.12卡托普利組0.48±0.13含藥血清組0.55±0.10△含藥血清組0.34±0.02*△含藥血清組0.25±0.02*△含藥血清組0.13±0.04*△組別劑量—400 μg/mL 5%10%20%30%n666666

結(jié)果 表明，10%以上含藥血清抑制AngⅡ刺激的能力優(yōu)于卡托普利組，并與濃度呈正相關(guān)。

3 討論

人們普遍認(rèn)為，血管損傷后再狹窄是血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）增值內(nèi)遷的結(jié)果 ，造成內(nèi)膜增厚，近來的證據(jù)表明，成纖維細(xì)胞（VAF）是血管新生內(nèi)膜形成、不良血管重塑和血管再狹窄的病理基礎(chǔ)［3］。Scott等［4］對(duì)豬冠狀動(dòng)脈左前降支進(jìn)行了PTCA術(shù)后發(fā)現(xiàn)，損傷處外膜部位首先出現(xiàn)細(xì)胞增殖和合成細(xì)胞生長(zhǎng)因子增多，免疫組織化學(xué)染色顯示成纖維細(xì)胞表型有變化，形成了肌成纖維細(xì)胞（MF）。肌成纖維細(xì)胞是一種具有平滑肌細(xì)胞樣特點(diǎn)的成纖維細(xì)胞，它也能分泌細(xì)胞外基質(zhì)和多種生物活性因子參與組織修復(fù)，一旦創(chuàng)傷愈合，MF迅速回轉(zhuǎn)到成纖維細(xì)胞或進(jìn)入凋亡?；罨腣AF與MF均可釋放更多的膠原和其他細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，促進(jìn)血管重構(gòu)，導(dǎo)致血管腔/壁的比例和幾何形狀的改變，導(dǎo)致再狹窄。MF的形成與缺氧有關(guān)［5］，體外實(shí)驗(yàn)表明［6］，在低氧狀態(tài)下，VAF的增殖反應(yīng)較平滑肌細(xì)胞發(fā)生更早，細(xì)胞表面血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）與AngII受體的表達(dá)均上調(diào)，因二者是低氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）的下游靶位，故抑制ACE與AngII可明顯減輕HIF依賴性成纖維細(xì)胞的增殖反應(yīng)。

本研究證實(shí)，解毒通絡(luò)方含藥血清能夠明顯拮抗血管緊張素Ⅱ的刺激作用，當(dāng)其濃度高于10%以上時(shí)，比卡托普利組400 μg/mL濃度拮抗作用明顯提高，并且與濃度呈正相關(guān)。鹿燕敏等［2］發(fā)現(xiàn)葛根素有明顯的抑制病理狀態(tài)下VAF增殖和膠原合成的作用，并認(rèn)為這是活血化瘀藥物拮抗PCI術(shù)后再狹窄的機(jī)制之一。目前明確拮抗RAS能逆轉(zhuǎn)血管重構(gòu)進(jìn)程，如研究發(fā)現(xiàn)［7］ACEI和血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑可改變心肌纖維化和心衰進(jìn)程。筆者認(rèn)為解毒通絡(luò)方含藥血清通過拮抗RAS系統(tǒng)起到預(yù)防血管損傷后再狹窄的作用，另外既往的研究發(fā)現(xiàn)［8-9］，該方有較好的對(duì)抗炎癥因子的作用，如超敏C反應(yīng)蛋白，白細(xì)胞介素-1β等從而減少炎癥損傷。

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