富巖，馬金玲，孫麗，杜杰，張延林，徐楠楠，孫云霞，于在林

Issacs 和 Lindeman 于 1957 年首先報道用滅活流感病毒攻擊人網(wǎng)狀內皮細胞和淋巴細胞后產生一種新的分子量在 20 000 ～ 30 000 D 的非特異性可溶的小分子糖蛋白，其是在機體免疫應答過程中產生的，被命名為干擾素（interferon，IFN）[1]。其后的研究表明這是一類多功能的細胞因子，當機體受病毒攻擊后分泌，并與細胞受體結合，可誘導機體產生特異的蛋白質和酶類，來抑制病毒基因的轉錄和降解病毒 RNA 來控制病毒的生長繁殖及發(fā)揮抗腫瘤的活性。重組人干擾素 α（recombinant human interferon alpha，rhIFNα）的應用就成為病毒性疾病和腫瘤疾病治療的重要手段。臨床上它是慢性病毒性肝炎的特效藥，對伴有 HBV-DNA、DNA多聚酶陽性或 HBeAg 陽性等病毒復制標志的成年慢性活動性乙型肝炎、伴有 HCV 抗體陽性和谷丙轉氨酶（ALT）增高，但不伴有肝功能代償失調（Child 分類 A）的成年急慢性丙型肝炎、以及尖銳濕疣、帶狀皰疹、小兒病毒性肺炎及上呼吸道感染、慢性宮頸炎、丁型肝炎等的治療具有顯著療效[2]；對腫瘤疾病，如毛狀細胞白血病、多發(fā)性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、慢性白血病以及卡波濟肉瘤、腎癌、喉乳頭狀瘤、黑色素瘤、蕈樣肉芽腫、膀胱癌、基底細胞癌等重大疾病具有明確的治療作用[3]。重組干擾素的體內半衰期約為 3.5 h，患者需要每天或隔天注射給藥 1 次，治療期長達 6 個月至 1 年，患者依從度低，嚴重影響治療效果。為此亟需研發(fā)長效的重組干擾素。PEG 化重組干擾素是在成品重組干擾素的基礎上進行化學修飾，達到每周給藥 1 次的良好效果，但是生產成本高，患者的治療費用極高。我們研發(fā)了一系列低成本的重組人血清白蛋白與治療用細胞因子融合蛋白長效新藥，目的是在保持細胞因子（包括干擾素）治療作用的同時，大大延長重組蛋白質藥物的體內半衰期，用于多種重大疾病的治療，并已進入了臨床試驗階段。新藥在臨床使用中將降低給藥頻率，減少患者痛苦，提高治療的順應性和依存度，相比市場上現(xiàn)有的蛋白質藥物將有更長的血液半衰期，更顯著的經濟和社會效益[4-6]。

2002 年，Osborn 等報道了重組人血清白蛋白/干擾素 α2b 融合蛋白在小鼠和大鼠中的毒理學研究以及食蟹猴中的藥代動力學的初步研究結果[7-8]，隨后開展了臨床試驗 I 期[9]、II 期[10]和 III期[11]研究和對其成藥性研究的綜述[12]。臨床試驗結果表明其每 2 周給藥 1 次不遜于 PEG-rhIFNα2a每周給藥 1 次的臨床試驗結果[13]。干擾素 α2b 與干擾素 α2a 雖然僅第 23 位氨基酸不同，但國內外作為兩個不同的藥物研發(fā)和在臨床上應用。重組人血清白蛋白/干擾素 α2a 融合蛋白（rHSA/IFNα2a）則是首次以新藥研發(fā)為目的開展臨床前研究。為此結合國家有關新藥注冊法規(guī)規(guī)定及生物（基因工程）制品的特點，作者開展了極為完整和詳盡的系統(tǒng)藥理學、毒理學安全性評價以及藥效學和藥代/毒代研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 昆明小鼠（SPF 級）170 只、Beagle 狗 12 只（普通級）、Wistar 大鼠（SPF 級）405 只、食蟹猴（普通級）47 只分別購自于中國藥品生物制品檢定所實驗動物中心、福州振和實驗動物技術開發(fā)有限公司、中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所以及廣西新豐源生物科技有限公司。本實驗涉及的所有動物處理內容均遵從實驗動物實驗管理和動物福利相關條例和法規(guī)，并由北京昭衍新藥研究中心有限公司的動物倫理委員會批準和監(jiān)督執(zhí)行。研究者已努力做到最大可能地減少實驗動物的使用數(shù)量。

1.1.2 供試品、試劑及檢測試劑盒 注射用重組人血清白蛋白/干擾素 α2a 融合蛋白凍干粉針劑由天津林達生物科技有限公司生產，批號為9213/20090101，規(guī)格為每支 1.5 mg/ml；批號為9213/20090102 和 9213/20090201，規(guī)格均為每支2 mg/ml；陽性對照藥聚乙二醇干擾素 α2a 注射液（派羅欣，Pegasys）由 Roche Pharma（Schweiz）Ltd. 生產，上海羅氏制藥有限公司分裝，批號為B1129，規(guī)格為 1.80 × 105IU/支，每支 0.5 ml。其他試劑為藥用級、分析級純度。HBsAg 和 HBeAg ELISA 檢測試劑盒，國藥準字 S10960066，尚柏生物醫(yī)學技術（北京）有限公司生產；乙型肝炎病毒（HBV）核酸擴增（PCR）熒光定量檢測試劑盒，國藥準字：S20020033，深圳匹基生物工程有限公司生產；Human IFN-α ELISA 試劑盒 Cat#BMS216，Bender MedSystems 生產；2-5oas（2'-5' 寡腺苷酸合成酶）試劑盒，貨號 I-AP75，由 Eiken Chemical Co., Ltd 生產。

1.1.3 儀器 Bayer Advia 2120 全自動血球分析儀為美國 Bayer 公司產品；MP150 多導生理記錄儀為美國 Biopac 公司產品；ep Mastercycler 2 實時熒光定量 PCR 儀為德國 Eppendorf 公司的產品；TBA-120FR 型全自動生化分析儀為日本東芝公司產品；Easylyte 型全自動電解質分析儀為美國Medica 公司的產品；高效液相色譜儀 Shimadzu LC-10AT 為日本島津公司產品；TSK G3000 SWxl 300 A，10 μm，7.8 mm × 300 mm 的凝膠柱購自日本 Tosoh 公司；酶標儀為美國 Bio-Rad 公司或Thermo 公司的 Multiskan MK3 酶標儀。

1.2 方法

1.2.1 藥效學研究

1.2.1.1 對 HepG2 2.2.15 細胞的體外毒性及抗HBV 活性檢測 取生長狀態(tài)良好的 HepG2 2.2.15細胞，經 0.25% 胰酶消化后配制成 5 × 104個/ml的細胞懸液，接種 96 孔細胞培養(yǎng)板，每孔 100 μl，37 ℃、5% CO2培養(yǎng) 48 h，然后吸去上清液，加入梯度稀釋后不同濃度的藥物。設培養(yǎng)液陰性對照組、陽性藥物對照組，各組均至少 3 個復孔。將受試藥物用含 10% 胎牛血清的 MEM 培養(yǎng)液配制成 1:4 溶液，2 倍稀釋加入 96 孔細胞培養(yǎng)板，每天換同濃度藥液，置于 37 ℃ 培養(yǎng)箱連續(xù)培養(yǎng) 72 h。每孔加入 PBS 配制的 5 mg/ml MTT 溶液 20 μl，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h。吸棄培養(yǎng)液上清，每孔加150 μl DMSO 溶液，振蕩 10 min，使結晶充分溶解，A570nm 比色，測定 OD 值。細胞生長抑制率（IR%）=（對照組 OD 值 － 給藥組 OD 值）/對照組 OD 值 × 100%。采用 Logit 法計算半數(shù)抑制濃度（IC50）值，并與陽性藥物進行比較。

HBV DNA 拷貝數(shù)的熒光定量 PCR 檢測、乙肝病毒表面抗原（s）和核心抗原（e）的檢測分別按試劑盒生產廠商提供的方法開展檢測，并對曲線的準確度、精密度、重復性和線性指標進行驗證。線性標準要求標準曲線的擴增效率在 0.8 ～ 1.2 之間，相關系數(shù) r2大于 0.99，精密度和重復性要求各重復孔間標準差小于 1.0，準確度要求檢出值偏差小于 20%；計算不同時間點的藥物相對抑制率。供試品與陽性對照藥相同濃度的抑制率相差小于20% 時判為無差異。

1.2.1.2 rHSA/IFNα2a 在食蟹猴體內的藥效學及藥效動力學研究 試驗方法參見文獻[6]描述。取20 只食蟹猴，雌雄各半。注射用重組人血清白蛋白/干擾素 α2a 融合蛋白分為低（10 μg/kg）、中（40 μg/kg）、高（160 μg/kg）劑量組，靜脈給藥組（40 μg/kg）以及派羅欣對照組（10 μg/kg)，每組4 只，雌雄各半。其中低劑量組兼做連續(xù)給藥組，每 2 周給藥 1 次，共給藥 4 次。同時檢測低、高劑量組給藥后血清中 2-5oas 濃度的變化情況。各組血漿藥物濃度由經驗證的 ELISA 方法進行測定，方法定量的下限在 0.156 ng/ml。同時采用 RIA法測定低、高劑量組藥后血清中 2-5oas 的濃度，方法靈敏度在 10 pmol/dl。

1.2.2 藥代動力學研究

1.2.2.1125I-rHSA/IFNα2a 在小鼠體內的藥物代謝動力學研究 試驗方法見文獻[6]。用小鼠考察藥物在體內的分布，采用三氯醋酸（TCA）沉淀蛋白的方法結合分子排阻色譜（SHPLC）對經同位素（Na125I）標記的 rHSA/IFNα2a 在小動物體內的分布、排泄過程及血漿蛋白結合等方面進行研究，方法的定量下限在 0.01 ng-當量（放射性）。125I-rHSA/IFNα2a 的給藥劑量小鼠為 2 μg/只。

1.2.2.2125I-rHSA/IFNα2a 在大鼠體內的藥物代謝動力學研究 方法同 1.2.2.1，125I-rHSA/IFNα2a的給藥劑量大鼠為 10 μg/只。

1.2.3 安全性評價

1.2.3.1 安全藥理學研究

⑴ rHSA/IFNα2a 單次皮下注射對正常小鼠中樞神經系統(tǒng)的影響：試驗方法見文獻[6]。設 100、300、600 μg/kg 劑量組及生理鹽水陰性對照組，每組 10 只小鼠，均 5 雄 5 雌。分別于給藥后 6、24 h 進行自主活動試驗，給藥后 6 小時 10 分鐘、給藥后 24 小時 10 分鐘進行攀網(wǎng)試驗，給藥后6 h 進行戊巴比妥鈉閾下催眠試驗。

⑵ rHSA/IFNα2a 單次皮下注射對犬心血管和呼吸系統(tǒng)功能的影響：試驗方法見文獻[6]。設 50、200 μg/kg 劑量組及生理鹽水陰性對照組，每組6 只動物，均 3雄 3 雌。對照組動物試驗結束后，間隔 7 ～ 8 d 消除期后用于低劑量組試驗。單次皮下注射給予犬，觀察對其心血管和呼吸系統(tǒng)的各項參數(shù)的變化。

1.2.3.2 單次給藥的毒性研究

⑴ rHSA/IFNα2a 單次肌肉和靜脈注射給予小鼠的毒性試驗：試驗方法見文獻[6]，試驗用昆明小鼠 60 只，設 3 組，分別是靜脈注射對照組、肌肉注射給藥組和靜脈注射給藥組，每組20 只，雌雄各半。給藥容量為 0.5 ml/只，給藥劑量為 50 000 μg/kg 體重，對照組靜脈注射給予等容量的生理鹽水。藥后連續(xù)觀察 14 d。

⑵ rHSA/IFNα2a 單次皮下和靜脈注射給予食蟹猴的毒性試驗：試驗方法見文獻[6]。試驗用食蟹猴 3 只，皮下注射重組人血清白蛋白/干擾素α2a 融合蛋白 10 mg/kg體重，給藥容量為 5 ml/kg體重，給藥后連續(xù)觀察 14 d。試驗中進行一般生理指標的觀察、體溫、體重、心電圖、血細胞計數(shù)、血凝指標、血液生化等指標的檢測，對死亡動物和安樂死動物進行解剖檢查，異常改變進行組織病理學檢查。

1.2.3.3 反復給藥的毒性研究

⑴ rHSA/IFNα2a 反復皮下注射給予大鼠13 周的毒性試驗：試驗方法見文獻[6]。試驗選用160 只 Wistar 大鼠，分性別按體重隨機分為 4 組，每組 40 只，雌雄各半，分別為生理鹽水對照組、rHSA/IFNα2a 100、300 和 1000 μg/kg 劑量組，皮下注射給藥，每周 1 次，連續(xù)給藥 13 周。在給藥 4 周（雌雄各 5 只）和末次給藥后（雌雄各10 只）將部分動物進行安樂死，剩余動物于末次給藥 4 周后進行安樂死。試驗期間，對動物進行臨床觀察，體重、食量、體溫、血細胞計數(shù)、凝血功能、血液生化、骨髓涂片、眼科、T 淋巴細胞亞群分布和特異性抗體等指標的檢查，對安樂死動物進行大體解剖，主要臟器稱重，并對 40 多種組織器官進行組織病理學檢查。另外將血清樣品稀釋后，用 Wish 細胞-VSV/MTT 比色法測定生物學活性來檢測動物體內產生的抗體是否具有中和藥物活性的作用。

⑵ rHSA/IFNα2a 反復皮下注射給予食蟹猴13 周的毒性試驗：試驗方法見文獻[6]。試驗選用24 只食蟹猴，按性別隨機區(qū)段法分成 4 組，每組6 只，雌雄各半，分別為生理鹽水對照組，rHSA/IFNα2a 的 50、150 和 500 μg/kg 劑量組。皮下注射給藥，每周給藥 1 次，連續(xù)給藥 13 周，共給藥 14 次。末次給藥后次日每組安樂死 4 只動物（雌雄各半）；將剩余動物恢復 4 周后安樂死。試驗期間進行了一般臨床觀察、體重、體溫、心電圖、血液學、血液生化、骨髓涂片、尿液、眼科、T 淋巴細胞亞群分布和抗體等指標檢查，同時進行毒代動力學指標的檢測。動物安樂死后進行大體解剖、主要臟器稱重，并對 40 多種器官組織進行病理組織學檢查。中和抗體檢查同 1.2.3.3 ⑴。

1.2.3.4 rHSA/IFNα2a 的大鼠 II 段生殖毒性試驗 Wistar 雌性受孕大鼠分為 4 組，每組 30 只。供試品設低劑量組（20 μg/kg）、中劑量組（200 μg/kg）和高劑量組（1000 μg/kg），同時設生理鹽水對照組，皮下注射給藥，孕鼠于妊娠第 6 天開始給藥，每3 天給藥 1 次，每只孕鼠共給藥 3 次。在妊娠第20 天對孕鼠實施安樂死。試驗中進行一般觀察，對體重、食量、孕鼠生殖能力、胎仔骨骼內臟進行檢查。

2 結果

2.1 藥效學研究

干擾素在藥效學試驗上并沒有一個適當和穩(wěn)定重復可供使用的動物模型。在重組干擾素和 PEG化重組干擾素的藥效學研究中，使用體外抗病毒的效果來觀察供試品干擾素的藥效，同時測定受試動物體內的 2-5oas 的活性，給出抗病毒的藥效反應水平。重組人血清白蛋白/干擾素 α2a 融合蛋白（rHSA/IFNα2a，分子量為 85.7 kD）對病毒病的治療作用、主要藥效學試驗也按重組干擾素和長效的PEG 化重組干擾素 α2a（派羅欣，分子量約 40 kD）的藥效評價方法進行體外抗病毒實驗，并與之相比較，以期為進一步的臨床前藥效和安全性評價及臨床試驗提供研究基礎。

2.1.1 對 HepG2 2.2.15 細胞的體外毒性及藥物的抗 HBV 活性檢測 藥效學試驗中的陽性對照品是聚乙二醇與重組干擾素 α2a 結合形成的長效干擾素 Pegasys，具有非聚乙二醇結合的 α-干擾素的體外抗病毒和抗增殖活性。因此，試驗中選擇其作為陽性對照品。陰性對照品為生理鹽水（0.9% 氯化鈉注射液）。體外抗病毒試驗選擇能夠分泌干擾素的乙型肝炎病毒 HBV 顆粒的 HepG2 2.2.15 細胞。兩次重復試驗結果可見：供試品 rHSA/IFNα2a在濃度為 3.13 × 103IU/ml 時，對細胞無毒性作用，此濃度為最大無毒濃度，其半數(shù)抑制濃度為 7.3 ×104IU/ml。陽性對照派羅欣的最大無毒濃度小于3.13 × 103IU/ml，其半數(shù)抑制濃度為 5.7 × 104IU/ml。另外，系統(tǒng)控制采用化藥順鉑作為系統(tǒng)對照組。試驗中系統(tǒng)對照組的抑制作用呈梯度，重復性好，表明整個試驗過程無異常。

2.1.1.1 HBV DNA 拷貝數(shù)的熒光定量 PCR 檢測結果 于給藥后第 1、3、5、7、9 天分別收集各組細胞上清液，熒光定量 PCR 檢測 HBV DNA的拷貝數(shù)，待測樣本處于 5.0 × 102≤ HBV DNA ≤5.0 × 107時的檢測結果有效。陰性對照組 HepG2

2.2.15 細胞上清液中 HBV DNA 拷貝數(shù)隨培養(yǎng)時間延長而增加，培養(yǎng)第 9 天時 HBV DNA 檢測值明顯增加，約為第 1 天的 6 倍。結果表明試驗選用的細胞分泌合成 HBV 正常穩(wěn)定。陽性對照派羅欣組（1.0 × 103IU/ml）中 HBV DNA 拷貝數(shù)隨培養(yǎng)時間延長也略有增加，其相對抑制率則隨培養(yǎng)時間的延長而增加，第 3 天為 27.02%，第 9 天為74.08%，表明派羅欣對 HBV DNA 拷貝數(shù)的抑制作用隨時間的延長而增強。供試品 rHSA/IFNα2a兩個劑量組的 HBV DNA 拷貝數(shù)隨培養(yǎng)時間延長略有增加，高劑量組（1.0 × 103IU/ml與派羅欣試驗劑量相同）的抑制率在培養(yǎng)第 3 天為 41.41%，第9 天則為 69.96%，與派羅欣相同。此結果表明1.0 × 103IU/ml 的 rHSA/IFNα2a 對 HBV DNA 復制的抑制作用隨時間的延長而增強，可以認為供試品 rHSA/IFNα2a 對 HBV DNA 復制的抑制作用與陽性對照派羅欣的作用相似。重復試驗與第一次試驗結果基本一致。

2.1.1.2 乙肝病毒抗原表達檢測 乙肝病毒抗原HBsAg 和 HBeAg 的 ELISA 檢測方法采用常規(guī)試驗操作規(guī)程將標準品倍比稀釋，按照試劑盒說明書步驟操作，得到乙肝病毒抗原 HBsAg 和 HBeAg的標準曲線，其相關系數(shù) r2分別為 0.994 和0.995，均符合要求。

2.1.1.3 乙肝病毒表面抗原 HBsAg 分泌的ELISA 結果 陰性對照組 HepG2 2.2.15 細胞上清液中 HBsAg 分泌隨培養(yǎng)時間延長而增加，培養(yǎng)第9 天為第 1 天的 4 倍左右。供試品 rHSA/IFNα2a組 HBsAg 分泌隨培養(yǎng)時間延長也略有增加，但明顯低于陰性對照組，其相對抑制率（OD450對照組－OD450試驗組）/OD450對照組× 100% 隨培養(yǎng)時間的延長而增加，培養(yǎng)第 7 天為 43.35%，第 9 天為52.53%，表明 rHSA/IFNα2a 對 HBsAg 分泌的抑制作用隨時間的延長而增強。陽性對照派羅欣組HBsAg 分泌隨培養(yǎng)時間延長也略有增加，明顯低于陰性對照組，其相對抑制率隨培養(yǎng)時間的延長而增加，培養(yǎng)第 7 天為 60.10%，第 9 天為 66.34%，表明派羅欣對 HBsAg 分泌的抑制作用隨時間的延長而增強。結果表明由于各時間點供試品 rHSA/IFNα2a 和陽性對照派羅欣的相對抑制率差異不超過 20%，可以認為兩者對 HBsAg 分泌的抑制作用無差異。

2.1.1.4 乙肝病毒 HBeAg 分泌的 ELISA 結果 陰性對照組 HepG2 2.2.15 細胞上清液中HBeAg 分泌隨培養(yǎng)時間延長而增加，培養(yǎng)第7 天為第 1 天的 5 倍左右，第 9 和第 7 天的表達量無明顯變化。供試品 rHSA/IFNα2a 組 HBeAg 分泌隨培養(yǎng)時間延長也略有增加，但明顯低于陰性對照組，其相對抑制率隨培養(yǎng)時間的延長而增加，培養(yǎng)第 7 天為 49.26%，而第 9 天為 30.15%，表明rHSA/IFNα2a 對 HBeAg 分泌的抑制作用隨時間的延長而增強，第 7 天時抑制作用最強。陽性對照派羅欣組 HBeAg 分泌隨培養(yǎng)時間延長也略有增加，明顯低于陰性對照組，其相對抑制率隨培養(yǎng)時間的延長而增加，培養(yǎng)第 7 天為 60.22%，第9 天為 50.99%，表明派羅欣對 HBeAg 分泌的抑制作用隨時間的延長而增強，至第 7 天時抑制作用最強。除培養(yǎng)第 9 天陽性對照派羅欣的相對抑制率高于供試品 rHSA/IFNα2a 組外（差異為40.87% ＞ 20%），其余各時間點兩組的差異不超過20%，第 7 天為抑制最強而第 9 天抑制作用減弱，可以認為兩者對 HBeAg 分泌的抑制作用基本無差異。在本項目的試驗條件下，供試品 rHSA/IFNα2a 的最大無毒濃度為 3.13 × 103IU/ml，陽性對照派羅欣的最大無毒濃度低于 3.13 × 103IU/ml。rHSA/IFNα2a 在濃度 1.0 × 103IU/ml 時，具有在體外抑制 HBsAg、HBeAg 分泌以及 HBV DNA 復制的作用，隨著時間的延長抑制 HBV 復制活性的作用增強，其作用與長效化的 PEG-干擾素——派羅欣相似。

2.1.2 對 rHSA/IFNα2a 在食蟹猴體內的藥效學及藥效動力學研究 2-5oas 是 IFN 抗病毒、抗細胞增殖過程中的一個關鍵酶。由它催化合成的 2'-5'寡腺苷酸（2-5a）能激活細胞中的內切核糖核酸酶（RNAse l），它可降解病毒的 mRNA 及細胞的RNA，從而起到抑制病毒復制和抗細胞增殖的作用。該酶可作為一項生化指標用于評價機體 IFN系統(tǒng)的抗病毒藥效作用。本實驗通過測定 2-5oas活性來評價 rHSA/IFNα2a 抗病毒作用。皮下注射給予食蟹猴 rHSA/IFNα2a 后，10 μg/kg 及 160 μg/kg組動物血清中 2-5oas 濃度見表 1 及圖 1。從數(shù)據(jù)上看，10 μg/kg 組動物平均血清 2-5oas 濃度在24 h 達峰，而 160 μg/kg 組則在 144 h 達峰，兩組動物血清 2-5oas 達峰時間均晚于血漿藥物峰濃度時間，但在藥后 2 周，其平均血清 2-5oas 濃度基本回落至藥前水平（但高于藥前值）。證明 rHSA/IFNα2a 維持 2-5oas 酶活性可達 2 周，支持了每2 周給藥的可行性。

表 1 皮下注射后食蟹猴血漿中 2-5oas 含量（± s ，n = 4）Table 1 The content of 2-5oas in cynomolgus monkey serum after subcutaneous injection (±s , n = 4)

注：方法的準確定量下限為 10 pmol/dl；*n = 3。Notes: The lower limitation of quantitative method is 10 pmol/dl; *n = 3.

不同劑量注射后血漿中 2-5oas 含量（pmol/dl）The content of 2-5oas in serum after injection with different doses (pmol/dl)時間（h）Time (h)10 μg/kg 160 μg/kg 0 46.52 ± 26.67 103.55 ± 155.41*10 159.49 ± 152.63* 176.99 ± 100.58 24 440.57 ± 653.69* 180.53 ± 87.87 48 88.80 ± 92.89 218.04 ± 213.87 96 228.41 ± 297.51* 260.26 ± 272.95 144 124.74 ± 132.16 571.75 ± 913.89 192 97.56 ± 79.88 289.63 ± 468.30 264 157.30 ± 185.86 147.98 ± 133.21 336 114.86 ± 116.68 151.55 ± 111.56

圖 1 血漿中 2-5oas 與 rHSA/IFNα2a 含量隨時間變化趨勢對比圖（皮下注射 10 μg/kg，n = 4）Figure 1 The concentration of 2-5oas and rHSA/IFNα2a protein in cynomolgus monkey plasma with different time points after subcutaneous injection (dosage: 10 μg/kg, n = 4)

2.2 藥代動力學研究

2.2.1125I-rHSA/IFNα2a 在小鼠體內的分布排泄研究 皮下注射給予小鼠后，125I-rHSA/IFNα2a 顯示主要分布在膀胱、頜下腺、血清及腎臟等組織/器官。眼球、脂肪及腦分布較少。表明該藥物主要經腎臟排泄，并且藥物不易透過血-腦脊液屏障，其組織分布見圖 2。

2.2.2125I-rHSA/IFNα2a 在大鼠體內的藥物代謝動力學研究 皮下注射給予大鼠 10.0 μg/只后，125I-rHSA/IFNα2a 的 TCA 沉淀放射性的末端半衰期為（44.39 ± 4.45）h，Tmax為（10.33 ± 7.31）h，Cmax為（92.29 ± 24.27）ng-當量/ml，AUC(0-168h)為（3.61 ± 0.50）h·μg-當量/ml；AUCinf為（3.75 ±0.52）h·μg-當量/ml；絕對生物利用度為 42.83%。rHSA/IFNα2a 在大鼠中的主要藥代參數(shù)見表 2；皮下和靜脈給藥后的藥物濃度－時間曲線見圖 3。放射性藥物主要經尿排泄，少量經糞、膽汁排泄，皮下注射后 9 d，可排泄給入放射性總量的（88.85 ±4.09）%。試驗表明本制品在體內的去向清楚，清除基本徹底，無蓄積現(xiàn)象。125I-rHSA/IFNα2a 不與血漿蛋白結合。

圖 2 小鼠皮下注射 125I-rHSA/IFNα2a 后在組織中的分布圖Figure 2 The tissue distribution of mice after subcutaneous injection of 125I-rHSA/IFNα2a

表 2 125I-rHSA/IFNα2a 在大鼠體內代謝動力學參數(shù)比較Table 2 Metabolism kinetic parameters comparison of 125I-rHSA/IFNα2a in rats

圖 3 大鼠經皮下和靜脈給予 125I-rHSA/IFNα2a 后血清放射性的變化Figure 3 The radioactivity in plasma of rats after injection of 125I-rHSA/IFNα2a by s.c. or by i.v.

2.2.3 rHSA/IFNα2a 在食蟹猴體內的藥代動力學研究 單次皮下注射食蟹猴給藥后的代謝動力學參數(shù)：低（10 μg/kg）、中（40 μg/kg）、高（160 μg/kg）劑量組的 t1/2分別為（61.20 ± 6.03）、（83.57 ± 6.02）和（75.90 ± 16.35）h；Tmax分別為（13.00 ± 7.39）、（9.00 ± 1.15）和（21.00 ± 12.70）h；Cmax分別為（0.16 ± 0.04）、（0.59 ± 0.05）和（2.51 ± 0.34）μg/ml；AUC（0-336h）分別為（13.85 ± 1.00）、（61.88 ± 3.44）和（277.26 ± 18.69）h·μg/ml；AUCinf分別為（14.04± 1.21）、（62.96 ± 5.32）和（278.44 ± 19.59）h·μg/ml；Vd分別為（63.09 ± 6.88）、（77.00 ± 8.54）和（63.83± 18.47）ml/kg；Cl 分別為（0.72 ± 0.06）、（0.64 ±0.05）和（0.58 ± 0.04）ml/（h·kg）；MRT 分別為（78.60± 9.54）、（91.56 ± 9.80）和（83.23 ± 20.68）h；絕對生物利用度分別為 99.24%，111.25%，123.01%，平均為（111.16 ± 11.89）%。

低、中、高劑量組間的劑量比為 1:4:16；Cmax之比為 1:3.67:15.57；AUCinf之比為 1:4.48:19.83，呈現(xiàn)線性動力學特征。皮下注射給予食蟹猴后，rHSA/IFNα2a 在 10 ～ 160 μg/kg 劑量范圍內呈現(xiàn)非線性動力學特征（圖 4）；在動物體內的末端半衰期較長，為 61.20 ～ 83.57 h；皮下注射給藥的絕對生物利用度平均為（111.16 ± 11.89）%。

圖 4 食蟹猴單次皮下注射各組血漿中 rHSA/IFNα2a 濃度-時間曲線Figure 4 The relationship of protein concentration and time points in plasma after a single injection monkey with different dosage by s.c.

統(tǒng)計分析比較，等劑量（10 μg/kg）的 rHSAIFNα2a 與對照組 Pegasys 比較，除 rHSA/IFNα2a的 t1/2長于對照組，Cmax低于對照組外，其他參數(shù)未見統(tǒng)計差異（表 3）。

與文獻報道的美國 HGSI 公司研發(fā)的 rHSA/IFNα2b（Albuferon）的動物試驗數(shù)據(jù)相比[7-8]，考慮到有試驗差異、動物個體差異、被統(tǒng)計動物試驗數(shù)量差異，以及 rHSA/IFNα2a 與 Albuferon 僅有一個氨基酸（干擾素 α2a 和 2b；K23R）不同等因素，兩者的試驗結果差異不是十分顯著，具有可比性（表 4）。

2.3 安全性評價

2.3.1 安全藥理學研究

2.3.1.1 rHSA/IFNα2a 單次皮下注射對正常小鼠中樞神經系統(tǒng)的影響 給藥后，各劑量組給藥動物一般行為表現(xiàn)、姿勢、步態(tài)等未見異常，各劑量組給藥動物的自主活動數(shù)、攀網(wǎng)能力和戊巴比妥鈉閾下催眠引起的翻正反射消失數(shù)與陰性對照組比較均無顯著差異。因此，認為單次皮下注射重組人血清白蛋白/干擾素 α2a 融合蛋白在 100、300、600 μg/kg. 劑量范圍內對小鼠中樞神經系統(tǒng)無明顯影響，與戊巴比妥鈉無協(xié)同作用。

表 3 等劑量 rHSA/IFNα2a 與 PEG-IFNα2a（派羅欣）代謝動力學參數(shù)比較（10 μg/kg，±s ，n = 4）Table 3 Metabolism kinetic parameters comparison of rHSA/IFNα2a with PEG-IFNα2a (Pegasys)(10 μg/kg,±s , n = 4)

表 3 等劑量 rHSA/IFNα2a 與 PEG-IFNα2a（派羅欣）代謝動力學參數(shù)比較（10 μg/kg，±s ，n = 4）Table 3 Metabolism kinetic parameters comparison of rHSA/IFNα2a with PEG-IFNα2a (Pegasys)(10 μg/kg,±s , n = 4)

注：^派羅欣組 AUC 是 0-192 小時數(shù)據(jù)；#對應于派羅欣的 10 μg/kg，P ≤ 0.05。Notes: ^AUC0-192h, for Pegasys group; #vs. Pegasys 10 μg/kg, P ≤ 0.05.

參數(shù)Parameters單位Unit rHSA/IFNα2a 派羅欣Pegasys t1/2 h 61.20 ± 6.03# 35.81 ± 4.91 Tmax h 13.00 ± 7.39 32.50 ± 18.79 Cmax μg/ml 0.16 ± 0.04# 0.41 ± 0.17 AUC(0-336h)^ h·μg/ml 13.85 ± 1.00 20.05 ± 5.22 AUCinf h·μg/ml 14.04 ± 1.21 20.71 ± 5.39 Vd ml/kg 63.09 ± 6.88# 25.65 ± 4.11 Cl ml/(h·kg) 0.72 ± 0.06# 0.51 ± 0.12 MRT h 78.60 ± 9.54# 52.00 ± 6.63

2.3.1.2 rHSA/IFNα2a 單次皮下注射對狗心血管和呼吸系統(tǒng)功能的影響 給藥后，各劑量組動物心電圖各參數(shù)值（心率、P-R 間期、P 波電壓、P 波間期、QRS 間期、Q-T 間期）與同一時間點陰性對照組比較均無統(tǒng)計學差別。未見異常心電圖波形，未發(fā)現(xiàn)對心臟傳導有影響。血壓指標考察顯示各給藥組動物的收縮壓、平均動脈壓、舒張壓與同一時間點陰性對照組比較未見明顯差別。呼吸系統(tǒng)指標考察顯示各給藥劑量組動物的呼吸頻率和呼吸幅度與陰性對照組比較未見明顯差別。因此認為單次皮下注射重組人血清白蛋白/干擾素 α2a 融合蛋白在 50、200 μg/kg 劑量范圍內對狗呼吸和心血管系統(tǒng)無明顯影響。

2.3.2 單次給藥的毒性研究

2.3.2.1 rHSA/IFNα2a 單次肌肉和靜脈注射給予小鼠的毒性試驗 rHSA/IFNα2a 單次肌肉和靜脈注射給藥后，所有動物均精神狀態(tài)良好、未出現(xiàn)死亡，給藥后第 14 天，肌肉注射給藥組的雄性動物體重有所降低，未見其他明顯毒性反應。大體解剖觀察各組織臟器未見異常。因此，在本試驗條件下，rHSA/IFNα2a 單次肌肉和靜脈給予小鼠的最大耐受量（MTD）≥ 50 000 μg/kg體重，達到臨床擬用劑量（10 ～ 15/kg，60 kg/人）的 33 00 ～ 5000 倍。

2.3.2.2 rHSA/IFNα2a 單次皮下注射給予食蟹猴的毒性試驗 給藥后 3 只動物精神狀態(tài)良好，活動正常；給藥后 2 h，3 只動物體溫均有所升高；給藥后 1 周，3 只動物體重均有下降的趨勢；3 只動物的 RBC、HCT 和部分動物的 PLT 在藥后有所降低，3 只動物的 ALT 和 AST 在給藥后 1 d和 3 d 均呈現(xiàn)出升高趨勢，給藥后 2 周基本上恢復到了給藥前水平。未見其他明顯毒性反應。大體解剖觀察各動物織臟器未見異常。因此，在本試驗條件下，rHSA/IFNα2a 單次皮下給予食蟹猴的最大耐受量 ≥ 10 mg/kg 體重，為臨床擬用劑量的 600 ～1000 倍。

2.3.3 反復給藥的毒性研究

2.3.3.1 rHSA/IFNα2a 反復皮下注射給予大鼠13 周的毒性試驗 試驗期間沒有動物意外死亡。100 和 1000 μg/kg 劑量組部分動物出現(xiàn)脫毛或被毛稀疏，所有動物未見其他與藥物毒性相關的異常臨床反應。

各給藥組動物的體重、食量、體溫、血液學、血液生化指標、骨髓涂片、眼科檢查、T 淋巴細胞亞群分布、臟器重量和臟器系數(shù)等指標未見有毒理學意義的規(guī)律性改變，給藥局部可見輕微或輕度的刺激性反應，停藥后可恢復，其余組織臟器的組織病理學檢查也未見與藥物相關的改變。

抗體檢測結果顯示，給藥 2 周，動物體內可產生抗 rHSA/IFNα2a 和抗 IFNα2a 抗體，隨著給藥次數(shù)增加，抗體滴度呈升高趨勢，停藥 4 周后，抗體滴度明顯降低，抗體具有中和 rHSA/IFNα2a活性的作用。

表 4 rHSA/IFNα2a 與 rHSA/IFNα2b（Albuferon）的比較Table 4 Metabolism kinetic parameters comparison between rHSA/IFNα2a and rHSA/IFNα2b (Albuferon)

因此，在本試驗條件下，rHSA/IFNα2a 反復皮下注射給予大鼠的基本安全劑量為 1000 μg/kg。

2.3.3.2 rHSA/IFNα2a 反復皮下注射給予食蟹猴13 周的毒性試驗 試驗期間，150 和 500 μg/kg劑量組動物在 2 次給藥后 WBC 明顯降低，首次和 2 次給藥后 Mono 明顯升高，50 和 150 μg/kg劑量組動物在首次給藥后和 2 次給藥后 APPT 明顯延長。各給藥組動物的臨床觀察、體重、體溫、心電圖指標、血液生化指標、骨髓涂片、尿常規(guī)、眼科檢查、T 淋巴細胞亞群分布、臟器重量及病理組織學檢查，均未見與藥物相關的有毒理學意義的明顯改變，給藥局部可見輕微或輕度的刺激性反應，停藥后可恢復。rHSA/IFNα2a 反復皮下注射給予食蟹猴，可產生抗 rHSA/IFNα2a 和抗 IFNα2a的抗體，抗體具有中和 rHSA/IFNα2a 活性的作用。首次給藥后，rHSA/IFNα2a 的各劑量組試驗結果基本呈現(xiàn)線性動力學特征。多次給藥后由于中和抗體的產生，血漿中的抗原量低于檢測限。

因此，在本試驗條件下，rHSA/IFNα2a 反復皮下注射給予食蟹猴的基本安全劑量為 500 μg/kg。中和性抗體屬于正?，F(xiàn)象，因為血清白蛋白在異源動物體內較易產生特異性抗體。

2.3.4 rHSA/IFNα2a 的大鼠 II 段生殖毒性試驗 rHSA/IFNα2a 各劑量下孕鼠未見明顯不良反應，給藥前后觀察注射局部未見異常；對孕鼠體重和食量均未見到明顯的影響，對胎仔未見明顯的毒性。各劑量組窩平均著床數(shù)、窩平均黃體數(shù)、窩平均活胎數(shù)、受孕率、活胎率、吸收胎率、死胎率、胎仔外觀畸形率、胎仔骨骼畸形率與生理鹽水對照組相比均未見明顯異常，胎仔內臟未見畸形。

3 討論

3.1 研究項目選擇的依據(jù)

rHSA/IFNα2a 是重組融合蛋白，其分子結構包含 HSA 和 IFNα2a 兩個部分，設計目的是希望保持 IFNα2a 的體內和體外抗病毒生物學活性，并可維持血液中干擾素的藥物水平；為患者在長達近12 個月的治療過程中，一直維持較高的血藥濃度、達到較高的依從度，獲得較好的治療效果，同時極大降低患者的費用。在發(fā)揮長效治療作用的同時，不帶來新的安全隱患。為評價 rHSA/IFNα2a 是否達到上述研制目標，我們開展了藥理毒理動物試驗研究，試驗選擇的考慮如下：①抗病毒作用和特點：體外抗乙肝病毒（HBV）試驗考察 rHSA/IFNα2a 是否和 PEG-IFNα2a 一樣，具有相似的抗病毒作用，反應出融合蛋白分子設計的合理性。試驗結果驗證了本制品可以與 PEG 化的干擾素相類似的抗病毒生物學活性功能，表明與 HSA 融合蛋白與其他方式（如 PEG）修飾蛋白的長效制劑一致。②長效作用：按照生物制品研究的常規(guī)要求，分別開展了在小鼠和大鼠（嚙齒類）中的代謝試驗：吸收、分布和清除；在非人靈長類（NHP）中的代謝試驗：吸收、生物利用度和清除，并觀察了藥效動力學。③安全性評價：按照法規(guī)要求和本制品的動物敏感性特點開展了系統(tǒng)的安全性評價試驗，獲得安全劑量、毒性反應特點、毒性靶器官的資料。

3.2 對研究結果的分析和評價

3.2.1 有效性評價 ①抗病毒作用：試驗結果顯示，rHSA/IFNα2a 在細胞模型和食蟹猴模型都顯示出顯著的抗病毒作用，且表現(xiàn)出一定的量效關系，在食蟹猴的試驗中量效關系也表現(xiàn)良好，表明rHSA/IFNα2a 具有和 PEG-IFNα2a 相似的生物學作用，在給藥 24 h 后出現(xiàn) 2-5oas 酶的明顯升高，起效快。②有效劑量：在食蟹猴試驗中 10 μg/kg 顯示出顯著升高 2-5oas 酶活性的作用，達到和超過PEG-IFNα2a 的治療作用，也表明猴很敏感。③長效特征：猴的藥效動力學試驗顯示出明顯的長效作用，給藥 1 次，可維持 2-5oas 酶活性水平第 14 天仍略高于模型組（最低點高于陰性對照組）。④作用時間：猴的藥效動力學試驗顯示，較高的劑量可以使 2-5oas 酶活性提高，并滯后出峰（10 μg/kg 劑量組的出峰時間為第 24 小時；160 μg/kg 劑量組的出峰時間為第 144 小時），酶活性測定數(shù)值增加幅度很大。第 15 天（350 h）時各劑量組可檢測到的 2-5oas 酶活性要遠高于給藥前的基數(shù)值。

3.2.2 對 rHSA/IFNα2a 的綜合評價

臨床適應證：臨床前研究結果顯示，rHSA/IFNα2a 顯示出與 rhIFNα 和 PEG 化 IFNα 相似的生物學作用，可以用于治療肝炎病毒引起的病毒病癥，以及其他 rhIFNα 的適應證。

臨床用量：最敏感動物猴的藥效試驗顯示，10 μg/kg 顯示出顯著的療效，該劑量引起的抗病毒2-5oas 酶數(shù)值顯著升高，并在 14 d 以后仍高于藥前值。以該劑量為基礎，推算人用劑量為 600 μg/人次。因此，支持了本項目計劃的臨床試驗起始劑量由 300 μg/人次開始，這看來是安全和合理的爬坡起始劑量。

臨床用藥間隔：建議 14 d 給藥 1 次，理由如下：

⑴猴的藥效動力學試驗結果顯示，14 d 給藥1 次，可以維持抗病毒和抗病毒復制的 2-5oas 酶活性水平高于模型組，并比每周用藥 1 次的陽性對照派羅欣相比要持續(xù)更長的時間（約 2 倍）。

⑵大鼠和猴反復給藥的毒性試驗結果顯示，各劑量的 rHSA/IFNα2a 可以被動物體清除。因此，制品是安全的。在動物體內產生針對 rHSA/IFNα2a的中和抗體也是屬于十分正常的現(xiàn)象。因為異源的血清白蛋白在進入受試體后會快速誘導產生具針對性的血清白蛋白的中和抗體。這些原因也使得進行人體的臨床試驗考察本制品的有效性和安全性顯得尤為必要。同時人源化血清白蛋白和干擾素較不易于在人體中產生明顯的針對性中和抗體。

⑶小鼠、大鼠和猴的生物反應相似，提示在人體的持續(xù)時間可能相近。

考慮到 HSA 和 IFNα 都具有很強的種屬特異性，目前動物安全性評價的手段可能并不能真正暴露本制品的不良反應，故作者將參照國外同類品種的臨床試驗結果，在正在開展的臨床試驗研究中審慎關注本品的不良反應?？傊?，“注射用重組人血清白蛋白/干擾素 α2a 融合蛋白”新藥和作者已完成的“注射用重組人血清白蛋白/干擾素 α2b 融合蛋白”相同動物實驗結果相近，均在動物實驗中表現(xiàn)出了成藥性和長效特征，總體安全性好，安全劑量范圍大，將為慢性病毒性肝炎患者的治療和防治提供新的選擇。

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