王慶 楊華 金瑞良 胡忠義 劉忠華

Mtb是引起結核病的病原菌。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，全球結核病發(fā)病率以每年1%的比率上升，約每年新增患者880萬［1］，其中痰涂片陽性的患者不到總數(shù)的1/2?！?000年全國結核病流行病學抽樣調查報告》［2］顯示，我國現(xiàn)有活動性肺結核患者451萬，菌陽肺結核患者僅為196萬。因此，活動性肺結核在常規(guī)檢測（培養(yǎng)和涂片）中檢出率過低是直接導致結核病在我國和全球廣泛流行的根本原因。血清學診斷作為對結核病菌陽及菌陰患者均有效的檢測手段，一直是結核病診斷的研究熱點。

近期國外報道，Mtb基因缺失區(qū)域4（RD4）中蛋白Rv0222用于血清學診斷具有較高的敏感度，同時在卡介苗接種者和非結核病患者中有較好的特異度，尤其對免疫缺陷患者較為敏感［3］。本研究構建了重組蛋白Rv0222，探討其用于結核病血清學診斷的可行性。現(xiàn)將結果報告如下。

材料和方法

一、材料

1.菌種和載體：Mtb H37Rv標準菌株，大腸埃希菌DH5α；BL21（DE3）和p ET30a載體（上海市肺科醫(yī)院保存），p MD18－T載體（購自大連寶生物工程有限公司）。

2.工具酶和試劑：限制性內切酶、T4連接酶、Tap聚合酶、異丙基硫代－β－D－半乳糖苷（IPTG）、純化試劑盒（購自大連寶生物工程有限公司），組氨酸標簽（His－tag）純化試劑盒（購自美國 Novagen公司），辣根過氧化物酶標記的羊抗人免疫球蛋白G（HRP－IgG）（購自美國Sigma公司），引物合成和測序由生工生物工程（上海）有限公司完成。

3.檢測血清樣本：（1）實驗對照血清：2份陰性對照血清為上海市肺科醫(yī)院門診正常體檢確認的健康人血清，2份陽性對照血清來自該院結核科確診的活動性肺結核患者。（2）142份待檢血清：82份按《結核病診斷標準》［4］（主要指標為持續(xù)2周以上低熱、咳嗽；食欲減退、消瘦；X線胸片異常鈣化點；痰涂片或Mtb培養(yǎng)陽性及抗結核診斷3個月后癥狀明顯減輕者）確診為活動性肺結核患者，其中涂片陽性患者為40例，占48.8%；28份非結核肺部疾病患者包括8例肺癌（根據(jù)《原發(fā)性肺癌診療規(guī)范》［5］確診）、15例肺炎和5例肺氣腫患者（肺炎和肺氣腫根據(jù)《社區(qū)獲得性肺炎診斷與治療指南（草案）》［6］確診，肺炎患者主要為肺炎鏈球菌感染者）；32份健康體檢者血清。非結核肺部疾病患者的選取主要因為此類對照有較為明顯的交叉反應，以上血清均來自上海市肺科醫(yī)院。

二、方法

1.基因克隆和鑒定：以H37Rv染色體DNA為模板擴增Rv0222基因片段。PCR反應條件：94℃5 min，94℃30 s，58℃30 s，72℃1.5 min，經過30個循環(huán)，最后72℃10 min。擴增產物經試劑盒處理后，鏈接到p MD18－T載體中；通過鏈接后p MD18－T酶切處理后，再亞克隆到表達載體p ET30a，構建重組質粒p ET30a－Rv0222，挑選重組克隆送生工生物工程（上海）有限公司測序。

2.重組蛋白純化和復性：挑重組菌于含50μg/ml卡那霉素50 ml的LB肉湯培養(yǎng)基（簡稱“LB培養(yǎng)基”）中過夜培養(yǎng)（18 h以上），以1∶100體積接種到1 L含有50μg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至A600＝0.6～0.8，加入異丙基－β－D－硫代半乳糖苷（IPTG）至終濃度為1 mmol/L，37℃培養(yǎng)4～6 h，集菌后溶于60 ml緩沖液A（含8 mol尿素，10 mmol咪唑，p H 8.0）中重懸超聲破菌（功率400 W，超聲破菌5 s，靜止5 s，連續(xù)進行30 min），18 110×g離心10 min后；經漂洗緩沖液B（8 mol尿素，20 mmol咪唑，p H 8.0）漂洗；洗脫緩沖液C（8 mol尿素，250 mmol咪唑，p H 8.0）洗脫目的蛋白（重組蛋白），通過鎳柱純化流速＜3 ml/min。純化后重組蛋白放入半透膜中，在4℃的環(huán)境下，置于磷酸緩沖液（PBS）中4 h或過夜緩慢多次透析，透析后取樣進行十二烷基硫酸鈉（SDS）－聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）。各步均留樣進行SDS－PAGE電泳。

3.重組蛋白免疫印跡（Western blot）鑒定：純化蛋白經SDS－PAGE電泳后全濕轉印（350 m A，45 min）。將轉印后的硝酸纖維素膜用含5%小牛血清的PBS封閉1 h后，用1∶200含5%小牛血清的PBS稀釋的結核病患者血清反應1 h，使用0.1%吐溫80的PBS充分洗滌（PBST，即PBS加入吐溫）后，與1∶10 000含5%小牛血清的PBST稀釋辣根過氧化物酶（HRP）－IgG溶液反應2 h，再次PBST洗滌后加入四甲基聯(lián)本胺（TMB）底物及雙氧水反應顯色。

4.重組蛋白檢測血清樣本：根據(jù)棋盤滴定法選擇最佳的包被濃度、血清稀釋度（1∶200）和HRPIgG稀釋度。通過考馬斯亮藍G250染色法測定Rv0222蛋白濃度，包被Rv0222蛋白抗原濃度為100 ng/ml，每孔100μl包板，4℃過夜，用PBST洗滌后，用含1%牛血清白蛋白封閉1 h，加100μl（1∶200）PBS稀釋的血清樣品，37℃溫育1 h，PBST洗滌，加1∶20 000稀釋的 HRP－IgG溶液，37℃溫育1 h，加TMB室溫顯色10 min，終止反應后酶標儀（型號mk3，美國熱電公司生產）波長450 nm檢測吸光度（A）值。每次實驗設陰性對照、陽性對照及空白對照，所有樣本均檢測2遍，不一致樣本需再次重復2遍，穩(wěn)定后方可入組統(tǒng)計，檢測時對照樣品均設復孔。

5.統(tǒng)計方法：以健康對照組血清樣本A值的均值加2倍標準差（±2s）作為陽性判斷標準。利用MedCalc 11.5.0軟件對結核病患者、非結核病患者和健康對照者進行完全隨機統(tǒng)計學分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、重組蛋白Rv0222的構建和純化

以Mtb參考株H37Rv為模板擴增Rv0222基因，構建重組質粒p ET30a－Rv0222，測序后與H37Rv比對顯示：重組蛋白Rv0222編碼基因與H37Rv上基因99.9%一致。對重組菌誘導后，經超聲破菌溶解后流過His－tag柱，得到純度超過95%以上的重組蛋白，相對分子質量約為27 000（圖1），圖中條帶4即為表達蛋白，雖然表達量不高，但為通過構建的6個連續(xù)的組氨酸標簽獲得的高純度重組蛋白（條帶6），表達重組蛋白主要以難溶的包涵體形式存在于離心沉淀中（條帶3和4）。

圖1 重組蛋白Rv0222誘導表達及純化的SDS－PAGE分析

二、重組蛋白的免疫印跡分析

純化重組蛋白轉膜后與結核病患者和健康體檢者血清作用，與結核病患者血清反應后可見相對分子質量約27 000處被相應抗體所捕獲，而健康體檢者相應位置卻未見條帶，顯示重組抗原與結核病患者的血清抗體具有特異的免疫反應性（圖2）。

圖2 純化蛋白Rv0222的免疫印跡Western－blot分析

三、重組蛋白的血清學檢測

重組蛋白在驗證其免疫反應性后，檢測142份血清樣本（其中結核病患者82例，非結核病患者28例，健康體檢者32例），經醫(yī)學分析軟件 Med Calc 11.5.0處理，ROC曲線下面積為0.893，最佳陽性判定值為0.12時（健康人群平均值加2個標準差）（95%CI＝0.1085～0.1265，Z＝14.87，P＜0.0001），結核病患者檢測敏感度為69.5%（57/82），檢測非結核病患者（24例檢出陰性）和健康體檢者（30例檢出陰性）的特異度為90.0%［（24＋30）/60］，差異有統(tǒng)計學意義（t＝25.78，P＜0.0001），樣本分布見圖3。結核病患者中Mtb涂片陽性者為40例，抗體檢測陽性者為31例，敏感度為77.5%（31/40）；結核病患者涂片陰性患者42例，抗體檢出26例，敏感度為61.9%（26/42），顯示Rv0222蛋白對菌陰肺結核診斷有意義（χ2＝34.8，P＜0.0001）。

圖3 重組蛋白的酶聯(lián)免疫吸附試驗各種血清樣本吸光度值（A 450）結果

討 論

Rv0222屬于Mtb基因RD4上的編碼基因，可能為Mtb的水合酶。RD4區(qū)是1999年Behr等［7］比較Mtb和卡介苗基因組后發(fā)現(xiàn)的16個缺失區(qū)之一，可能在卡介苗1927—1931年傳代的過程中丟失。RD區(qū)被很多學者認為與Mtb的毒力直接相關［8－9］，是導致卡介苗毒力減弱的主要原因，因此RD區(qū)成為尋找結核病免疫學診斷抗原的方向之一。研究發(fā)現(xiàn)Rv0222基因在多達13種卡介苗亞株中缺失［10］，包括我國正在使用的巴斯德和丹麥株，這種缺失性理論上避免了卡介苗接種者可能產生的交叉反應，對我國排除卡介苗接種者的假陽性檢測較為有利。作為一種新的特異性抗原，Rv0222蛋白是Rosenkrands等［3］通過對RD區(qū)上47個編碼基因篩選后發(fā)現(xiàn)的，初步血清學評價顯示：其與38kD、16kD、A60等［11－14］公認的診斷抗原在血清學診斷方面具有相似的檢出敏感度，同時對HIV陰性和HIV陽性的結核病患者檢測后發(fā)現(xiàn)其抗體檢出保持一致，相對于部分Mtb抗原，因HIV陽性患者免疫功能低下而無法檢出時，Rv0222卻影響較小。

本研究以p ET30a為表達載體，成功構建了重組蛋白Rv0222，雖然重組菌中目的蛋白的表達量不高，但通過融合在Rv0222蛋白C端的連續(xù)6個組氨酸（His）標簽，成功純化出高純度的目的蛋白（圖1）。重組蛋白 Western－blot分析發(fā)現(xiàn)，其與結核病患者的血清抗體發(fā)生反應，說明重組蛋白Rv0222具有特異的免疫反應性，可用于檢測結核病患者的相應抗體。

以Rv0222作為診斷抗原檢測結核病患者血清，目前國內外未見詳細報道，僅Rosenkrands等［3］對其血清學診斷做了小樣本的驗證評價。本研究建立了Rv0222蛋白檢測血清抗體的間接ELISA方法，連續(xù)隨機選擇了142份血清樣本進行初步評估，檢測結核病患者的敏感度為69.5%（57/82），非結核病患者和健康體檢者的特異度為90.0%（54/60），結果顯示結核病患者與對照者（非結核病患者和健康體檢者）差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.0001），其中對菌陰肺結核患者診斷敏感度為61.9%（26/42），結果較為理想。

研究中也存在幾點不足：（1）雖然有臨床診斷及涂片、培養(yǎng)作為對照，但未設置與其他蛋白的平行對照，未能反映出與38 000、16 000等優(yōu)勢抗原的優(yōu)劣；（2）所檢測結核病患者中菌陽比例較高，也直接導致了敏感度較高；（3）特異性方面，對照樣本中非結核病患者數(shù)量不多，而疾病對照的特異度僅為85.7%（24/28），如果對照中疾病患者比例增多，那總的特異度會進一步降低。針對以上問題，大樣本、多種類的協(xié)同作用檢測抗體，在后續(xù)的研究中會重點考慮。

綜上，成功構建重組蛋白Rv0222工程菌，初步評估其抗體診斷的價值，雖然結果并不全面，但仍有一定的參考價值，Rv0222蛋白所具有的免疫反應性有可能成為診斷和預防結核病的候選抗原之一。

［1］World Health Organization.Global Tuberculosis Control：Surveillance，Planning，F(xiàn)inancing：WHO Report 2005.Gengeva：World Health Organization，2005.

［2］全國結核病流行病學抽樣調查技術指導組.2000年全國結核病流行病學抽樣調查報告.中國防癆雜志，2002，24（2）：65－108.

［3］Rosenkrands I，Aagaard C，Weldingh K，et al.Identification of Rv0222 from RD4 as a novel serodiagnostic target for tuberculosis.Tuberculosis（Edinb），2008，88（4）：335－343.

［4］中華人民共和國衛(wèi)生部.WS 288—2008肺結核診斷標準.北京：人民衛(wèi)生出版社，2008.

［5］中華人民共和國衛(wèi)生部.原發(fā)性肺癌診療規(guī)范（2011年版）.北京：中華人民共和國衛(wèi)生部，2011.

［6］中華醫(yī)學會呼吸病學分會.社區(qū)獲得性肺炎診斷與治療指南（草案）.中華結核和呼吸雜志，1999，22（4）：199－201.

［7］Behr MA，Wilson MA，Gill WP，et al.Comparative genomics of BCG vaccines by whole－genome DNA microarray.Science，1999，284（5419）：1520－1523.

［8］Pym AS，Brodin P，Brosch R，et al.Loss of RD1 contributed to the attenuation of the live tuberculosis vaccines Mycobacterium bovis BCG and Mycobacterium microti.Mol Microbiol，2002，46（3）：709－717.

［9］Gagneux S，DeRiemer K，Van T，et al.Variable host－pathogen compatibility in Mycobacterium tuberculosis.Proc Natl Acad Sci U S A，2006，103（8）：2869－2873.

［10］Mattow J，Junqblut PR，Schaible UE，et al.Identfication of proteins from Mycobacterium tuberculosis missing in attenuated Mycobacterium bovis BCG strains.Electrophoresis，2001，22（14）：2936－2946.

［11］Andersen AB，Hansen EB.Structure and mapping of antigenic domains of protein antigen b，a 38，000－molecular－weight protein of Mycobacterium tuberculosis.Infect Immun，1989，57（8）：2481－2488.

［12］Verbon A，Hartskeerl RA，Moreno C，et al.Characterization of B cell epitopes on the 16 K antigen of Mycobacterium tuberculosis.Clin Exp Immunol，1992，89（3）：395－401.

［13］Cocito C，Vanlinden F.Preparation and properties of antigen 60 from Mycobacterium bovis BCG.Clin Exp Immunol，1986，66（2）：262－272.

［14］劉忠華，丁元生，畢愛笑，等.結核分枝桿菌38 k D－16 k D融合蛋白克隆表達及血清學診斷價值.中國防癆雜志，2009，31（10）：564－568.