王譯晗，張 霞，張婷慧，張予陽

(沈陽藥科大學生命科學與生物制藥學院，沈陽 110016)

氧化應激是指活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)過量超出了細胞對ROS清除的能力，最終引發(fā)疾?。?］。ROS通過氧化反應破壞脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA等大分子物質(zhì)，也參與炎細胞的激活及其信號的級聯(lián)放大過程，導致細胞損傷甚至死亡，它還介導腦缺血再灌注損傷［2］。腦缺血時，ROS的產(chǎn)生和清除平衡遭到破壞，抗氧化酶與促氧化酶的數(shù)量及功能平衡失調(diào)，它們可做為細胞內(nèi)信號參與細胞死亡信號通路的傳遞，最終導致細胞損傷乃至死 亡。超 氧 化 物歧 化 酶 (superoxygenerized degenerase，SOD)是腦缺血氧化應激中具有抗氧化作用的主要酶之一，它能催化歧化超氧陰離子生成H2O2，而后經(jīng)谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-PX)或過氧化氫酶(catalase，CAT)催化生成水。一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)則可催化NO的生成，后者與超氧陰離子反應形成過氧化亞硝酸鹽，過量的NO和過氧化亞硝酸鹽對缺血腦組織均可造成損害。

應用轉(zhuǎn)基因技術(shù)可獲得基因嵌合小鼠，嵌合小鼠與野生小鼠進行交配產(chǎn)生雜合(+/-)后代，雜合小鼠繁殖可產(chǎn)生純合小鼠(+/+為高表達，-/-為基因敲除)［3］。這些轉(zhuǎn)基因及基因敲除鼠發(fā)育正常，無明顯病理變化，可用于研究缺血性腦損傷的機制及藥物的作用。近年來，轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展使ROS在腦缺血中的致病機制變得更易準確定位。

1 基于轉(zhuǎn)基因鼠對一氧化氮合酶NOS的研究

在哺乳動物腦內(nèi)，NOS有三種亞型，即神經(jīng)型NOS(neuronal NOS，nNOS)、誘導型 NOS(inducible NOS，iNOS)及內(nèi)皮型NOS(endothelial NOS，eNOS)。Ito等［4］利用腦缺血后 nNOS(-/-)小鼠和 eNOS (-/-)小鼠對比發(fā)現(xiàn)，nNOS(-/-)小鼠的腦血流量高于野生型小鼠，eNOS(-/-)小鼠的平均動脈壓高于野生型小鼠，這說明nNOS可能在缺血再灌注過程中對控制腦血流量發(fā)揮著重要作用，由nNOS催化產(chǎn)生的NO與超氧自由基形成過氧化亞硝酸鹽而產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用，并加重缺血性損傷［5］，相反，由eNOS催化產(chǎn)生的NO是維持血管張力和功能［6］及增加腦血流量的重要決定因素。另外，缺血再灌注后，eNOS(-/-)和 nNOS(-/-)小鼠紋狀體處的NO3-水平與野生型小鼠相比顯著減少，這提示在缺血再灌注過程中有些腦區(qū)產(chǎn)生的NO3-與 nNOS和 eNOS二者的活性密切相關(guān)。此外，缺血再灌注后，nNOS(-/-)小鼠腦中NO3-的含量明顯低于eNOS(-/-)小鼠，進一步表明腦缺血后 nNOS催化產(chǎn)生的NO占主導地位［4］。用eNOS(-/-)小鼠制備大腦中動脈閉塞的局灶腦缺血模型，與野生型小鼠相比，可造成較高的死亡率和嚴重的神經(jīng)學癥狀，并降低了動脈生成［7］，提示eNOS可介導缺血大腦的動脈生成，并與中風后的功能恢復密切相關(guān)。

Atochin等［8］發(fā)現(xiàn)，將內(nèi)源性 eNOS的絲氨酸1179位點磷酸化可影響血管的反應性并決定腦梗死范圍的大小，表達絲氨酸 1179磷酸化 eNOS (S1179D)的轉(zhuǎn)基因小鼠與表達絲氨酸1179非磷酸化eNOS(S1179A)的轉(zhuǎn)基因小鼠相比，血管反應性增加，大腦中動脈閉塞后的腦血流量也明顯增加。此外，將eNOS(-/-)小鼠與S1179A和S1179D的轉(zhuǎn)基因小鼠交配，產(chǎn)生以eNOS(-/-)小鼠為背景的S1179D/eNOS敲除小鼠和S1179A/eNOS敲除小鼠，發(fā)現(xiàn) eNOS(-/-)小鼠及 S1179A/eNOS基因敲除小鼠均比野生型小鼠及S1179D/eNOS基因敲除小鼠不能耐受缺血性腦損傷，局灶腦缺血后腦梗死范圍增加，提示eNOS或?qū)NOS修改為S1179D均對腦缺血損傷具有保護作用。Pruss等［9］研究發(fā)現(xiàn)iNOS(-/-)小鼠局灶腦缺血后梗死范圍增加。Luo等［10］利用基因敲除小鼠研究發(fā)現(xiàn)，iNOS是腦缺血后誘導齒狀回細胞形成的重要因素。而nNOS對小鼠腦的細胞形成起著相反作用，抑制nNOS能促進齒狀回細胞形成。

在缺血預處理階段，nNOS(-/-)小鼠與eNOS (-/-)小鼠均沒有表現(xiàn)出缺血耐受性［11］，然而Cho等［12］利用iNOS(-/-)小鼠進行研究則發(fā)現(xiàn)，iNOS可加強小鼠的缺血耐受性，對隨后的腦缺血損害起到一定保護作用。此外，Kawano等［13］人分別利用缺乏NADPH氧化酶(NOX)的Nox2亞基的小鼠和缺少 iNOS的轉(zhuǎn)基因小鼠進行研究發(fā)現(xiàn)，iNOS催化產(chǎn)生的NO若要在缺血預處理階段發(fā)揮神經(jīng)保護作用，與NADPH氧化酶催化產(chǎn)生的超氧化物所形成的過氧化亞硝酸鹽形成復合物是必要條件，此研究結(jié)果提示，過氧化亞硝酸鹽除了具有眾所周知的加重腦缺血損傷及神經(jīng)退行性病變作用，在缺血預處理階段還能間接起到保護腦缺血的有益作用。

2 基于轉(zhuǎn)基因鼠對超氧化物歧化酶SOD的研究

SOD有三種同功酶，包括胞質(zhì)酶 CuZnSOD (SOD1)、線粒體酶 MnSOD(SOD2)和細胞外酶ECSOD(SOD3)，它們分別存在于細胞的不同部位，為ROS引起的腦缺血損傷提供保護作用。許多研究已證明了它們對腦缺血/再灌注損傷的神經(jīng)保護作用是確切的。

大量研究表明，SOD1轉(zhuǎn)基因小鼠及大鼠具有抵抗腦缺血損傷的能力［14］，純合的SOD1(-/-)小鼠在局灶性腦缺血后，腦梗死范圍增加，腦水腫程度加重［15］，暫時性全腦缺血后，神經(jīng)元死亡數(shù)增加，尤其是海馬CA1區(qū)的神經(jīng)元損傷更明顯［16］。但有文獻報道，在新生小鼠的大腦中，SOD1高度表達卻可使神經(jīng)元死亡數(shù)增加。顯然，在特定情況下，SOD1的作用未必與我們在成年鼠上獲得的結(jié)果相同。而GSH-Px高表達則可對抗新生鼠的腦缺血缺氧損傷［3］。這可能是由于在SOD1轉(zhuǎn)基因鼠腦內(nèi)有較多的H2O2蓄積，而新生鼠的大腦卻沒有足夠的下游酶對抗H2O2的蓄積［3］。該研究進一步表明了中樞神經(jīng)系統(tǒng)中抗氧化體系中各種酶之間相互協(xié)調(diào)的重要性。

此外，SOD1還參與調(diào)節(jié)腦缺血后線粒體功能障礙，并參與調(diào)節(jié)氧化應激狀態(tài)對神經(jīng)元的影響過程。研究發(fā)現(xiàn)，SOD1高表達可減少早期的細胞色素C(cytochrome C，Cyt C)及次生半胱天冬酶線粒體源激活劑 (second mitochondria-derived activator of caspase，Smac)從線粒體向胞質(zhì)釋放，減少caspases-3的激活［17］，并加強凋亡蛋白 X染色質(zhì)聯(lián)結(jié)的凋亡抑制劑(x chromosome-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP)與caspase-9的相互作用，從而抑制內(nèi)源性凋亡caspases通路的啟動［18］，抑制細胞凋亡的線粒體信號途徑，對腦缺血后的神經(jīng)元損傷起到保護作用。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(蛋白激酶 B，PKB，Akt)活化作為防止細胞凋亡的重要因素之一，與暫時性局灶腦缺血后的細胞存活涉及的信號轉(zhuǎn)導途徑有關(guān)。暫時性局灶腦缺血30m in后，加強Akt的磷酸化可減少超氧化物的產(chǎn)生及增加 SOD1的表達，研究結(jié)果顯示，與野生型小鼠相比，SOD1轉(zhuǎn)基因小鼠的尾殼核及缺血皮質(zhì)腦區(qū)中Akt的磷酸化程度有所增加［19］。在腦缺血時，暫時性局灶腦缺血引起的氧化應激可增加NF-κB(nuclear factor-kappa B)的含量，觸發(fā)其相應的細胞信號轉(zhuǎn)導通路，使神經(jīng)元受損，SOD1高表達鼠，氧化應激狀態(tài)減輕，可加強與NF-κB相關(guān)的快速防衛(wèi)機制，從而防止腦缺血誘導的氧化應激所致的大腦損傷［20］。顯然，抗氧化應激作用可通過活化 Akt和抑制 NF-κB相關(guān)的信號通路，減輕神經(jīng)元的受損程度。

眾所周知，腦缺血后的再灌注階段尤其易引發(fā)氧化應激性損傷，而 SOD1高表達能降低神經(jīng)元對此過程中各種有害因子的敏感性。與維持細胞存活的信號途徑相反，局灶性腦缺血后促凋亡基因p53上調(diào)，SOD1高表達后這種上調(diào)受到抑制［21］。此外，p53上調(diào)細胞凋亡調(diào)控因子(the p53upregulated modulator of apoptosis，PUMA)也受 p53誘導，產(chǎn)生后與 Bcl-2凋亡調(diào)控家族相互作用，致Cyt C向胞質(zhì)釋放增多［22］，然而暫時性全腦缺血后PUMA的上調(diào)，在 SOD1高表達動物中卻明顯受到抑制［23］。這些基于轉(zhuǎn)基因動物的研究結(jié)果提示，SOD1可通過多種相互關(guān)聯(lián)的細胞信號途徑，抑制腦缺血或缺血再灌注中ROS對組織細胞的有害作用。

O2-主要來源于線粒體呼吸過程，而SOD2作為一種線粒體酶，在正常生理狀態(tài)下與O2-的水平密切相關(guān)，SOD2轉(zhuǎn)基因鼠的研究在腦缺血氧化應激的作用機制探討中具有重要價值。有報道，SOD2(-/-)小鼠與野生型小鼠相比，腦缺血后，線粒體功能紊亂、腦梗死范圍、腦水腫及O2-的產(chǎn)生均有增加［1］，線粒體Cyt C向胞質(zhì)的釋放、caspase-9的激活也有所增加［24］。攜帶人類 SOD2基因的雜合 SOD2轉(zhuǎn)基因小鼠，局灶性腦缺血后，腦組織損傷減輕，血管內(nèi)皮細胞死亡減少，研究還發(fā)現(xiàn)，信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄 激 活 子-3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)是一種 SOD2基因表達的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，參與SOD2的神經(jīng)保護過程，顯然此發(fā)現(xiàn)為腦缺血再灌注損傷的治療提供了新靶點［25］。

SOD3是一種細胞外超氧化物歧化酶，相對于前述兩種超氧化物歧化酶亞型而言，其含量較低，但因其所在的細胞外空間較大，使得它在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)具有相對較高的水平。SOD3高表達小鼠在暫時性全腦缺血后，神經(jīng)元死亡有所減少［26］。與此相反，純合的SOD3(-/-)小鼠，局灶性腦缺血后腦梗死范圍有所增加［27］。顯然，在腦缺血損傷研究中，SOD3轉(zhuǎn)基因鼠具有與SOD2轉(zhuǎn)基因鼠同樣重要的意義。

轉(zhuǎn)基因和基因敲除鼠為腦缺血的機制研究及治療腦缺血的藥物研究提供了重要條件。目前，多種模擬SOD的化合物和被修飾的SOD化合物已經(jīng)不同程度的得到開發(fā)研究，進一步的數(shù)據(jù)也已證實，它們對腦缺血損傷具有明顯的保護作用。今后，在深入研究三種同功酶的協(xié)同作用時，可嘗試將兩種或三種超氧化物歧化酶亞型同時在實驗動物腦中高表達或敲除，從而更清晰的建立其相互作用及協(xié)同作用模式，為深入探討這種相互作用或協(xié)同作用的精細機制提供必要條件。

3 基于轉(zhuǎn)基因鼠對谷胱甘肽過氧化物酶 GSH-Px的研究

GSH-Px存在于胞質(zhì)中，而 CAT則主要集中于過氧化酶體，顯然，GSH-Px的普遍存在預示了它對調(diào)節(jié)過量 H2O2具有更重要的作用。利用 GSH-Px高表達小鼠或GSH-Px(-/-)小鼠，對局灶腦缺血或腦缺血再灌注損傷進行研究，結(jié)果表明，GSH-Px高表達可減少神經(jīng)元的壞死和凋亡，抑制星型膠質(zhì)細胞的活化及炎細胞的浸潤［28］，相反，GSH-Px敲除可見氧化應激水平增加、腦缺血再灌注損傷明顯加重［29］。對于新生小鼠，GSH-Px的增加具有同樣的保護作用，GSH-Px是一種將H2O2轉(zhuǎn)化為水必不可少的催化酶，因此與野生型小鼠相比，GSH-Px轉(zhuǎn)基因新生小鼠腦內(nèi)蓄積較少的H2O2，GSH-Px高表達使新生小鼠的腦缺血缺氧損傷明顯降低［30］。前已述及與成年鼠不同的是，SOD1高表達對新生鼠腦缺血缺氧損傷無明顯保護作用，NOS抑制劑不能使SOD1對新生鼠腦缺血缺氧損傷產(chǎn)生有益影響，但SOD1和GSH-Px共同高表達則對新生小鼠腦缺血缺氧損傷呈現(xiàn)有益作用，在這種轉(zhuǎn)基因新生小鼠中獲得的神經(jīng)保護作用優(yōu)于單獨SOD1高表達的轉(zhuǎn)基因新生小鼠［30］。GSH-Px(+/+)小鼠的研究表明，GSH-Px對H2O2及過氧化脂質(zhì)造成的氧化應激性腦損傷具有保護作用，依布硒(一種GSH-Px的仿制品)具有神經(jīng)保護作用的報道［3］，進一步支持了GSH-Px對氧化應激性腦損傷具有有益作用的假想。

4 基于轉(zhuǎn)基因鼠對NADPH氧化酶NOX的研究

NOX是大腦中的一種促氧化酶，許多刺激因素可使其活化，它可誘導4種胞質(zhì)亞基向細胞膜易位，并與催化亞基融合形成復合體，這種活化酶復合體可給氧運輸電子，從而生成超氧陰離子(O2-)，因此，NOX在腦缺血和其他與氧化應激相關(guān)的疾病中起有害作用。

夾竹桃麻素是目前應用最廣泛的NOX家族蛋白抑制劑，腦缺血后給予Nox2(-/-)小鼠夾竹桃麻素處理，沒有表現(xiàn)出保護腦缺血損傷及減少腦內(nèi)ROS的作用［31］。腦缺血再灌注導致血腦屏障破壞進而形成腦水腫，ROS可破壞血腦屏障，NADPH氧化酶的Nox2亞基催化活性氧的生成，因此，這種酶的基因缺失或抑制該酶的活性可保護腦缺血再灌注后的血腦屏障功能。Kahles等［32］利用Nox2(-/-)小鼠進行研究發(fā)現(xiàn)，Nox2基因缺失可防止早期血腦屏障功能障礙，預防腦缺血后的腦水腫形成，夾竹桃麻素因抑制NOX的活性從而對維持血腦屏障功能起有益作用。此外，腦缺血再灌注后Nox2(-/-)小鼠及給予夾竹桃麻素處理的小鼠均表現(xiàn)出腦梗死范圍、4-羥基壬烯酸和丙二醛產(chǎn)物、DNA氧化損傷及中性粒細胞浸潤明顯減少［33］，表明了Nox2抑制劑具有延遲細胞死亡過程、減少氧自由基生成和腦組織氧化損傷的作用［34］。Chen等［33］為了進一步研究促氧化酶NOX和抗氧化酶SOD1間的相互作用，將SOD1(-/-)小鼠與野生型小鼠進行對此研究，發(fā)現(xiàn)局灶腦缺血后SOD1(-/-)小鼠腦內(nèi)的Nox2增加了1.8～2.8倍，但 SOD1轉(zhuǎn)基因小鼠比野生型小鼠中的Nox2上調(diào)并不顯著，這表明，NOX的表達受腦組織的氧化還原狀態(tài)調(diào)節(jié)，氧化應激有助于腦組織中NOX的表達上調(diào)。

NOX蛋白家族中的另一種亞基Nox4也是腦缺血后參與氧化應激反應的主要成員，用Nox4(-/-)小鼠制備大腦中動脈閉塞的腦缺血模型進行研究，發(fā)現(xiàn)Nox4(-/-)小鼠與野生型小鼠相比腦梗死范圍明顯減少，整體神經(jīng)功能顯著改善，表現(xiàn)出具有更好的基礎運動功能和協(xié)調(diào)能力。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血后Nox4(-/-)小鼠腦梗死范圍不隨時間而增加，提示Nox4基因缺失對腦缺血的保護作用是持續(xù)的［35］。顯然，這些研究結(jié)果均表明，轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應用使NOX在腦缺血氧化應激中的作用得到了肯定。

5 結(jié)語

上述討論顯示，轉(zhuǎn)基因動物在腦缺血氧化應激相關(guān)研究中可以發(fā)揮重要作用，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，更直接的表達了目標基因在體內(nèi)腦缺血過程中的作用，并可以顯示出目標基因所涉及的相關(guān)機制。然而，目前轉(zhuǎn)基因鼠的應用尚有需要解決的問題，需要經(jīng)過深入研究，使轉(zhuǎn)基因技術(shù)在病理藥理學研究中發(fā)揮更大的作用。

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