王建龍 李海濤 蘇丕雄 顧 松 劉 巖 張希濤 顏 鈞 安向光

高 杰2 辛 悅2 蔡 軍2*

(1.北京市普仁醫(yī)院心內(nèi)科，北京100062;2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽(yáng)醫(yī)院心臟中心，北京100020)

DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)的重要機(jī)制之一。DNA甲基化與生長(zhǎng)、發(fā)育等生命活動(dòng)及腫瘤等疾病的形成息息相關(guān)。目前DNA甲基化在腫瘤發(fā)生中的作用仍是研究的一個(gè)熱點(diǎn)，而關(guān)于其在心血管疾病發(fā)生過(guò)程中作用的研究則剛剛起步［1］。本實(shí)驗(yàn)用甲基化芯片篩選的方法分析心衰心肌標(biāo)本和正常心肌標(biāo)本中DNA甲基化的差異。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1)主要試劑：dNTP-mix購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司; Platinum-DNA-Polymerase購(gòu)自美國(guó) Invitrogen公司;Invitrogen凝膠回收試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司; DNA ladder購(gòu)自美國(guó) Invitrogen公司;MethylCodeTMBisulfite Conversion Kit購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;EZ DNA Methylation-Gold Kit購(gòu)自美國(guó)ZYMO Research公司;質(zhì)粒小量提取試劑盒購(gòu)自美國(guó) Axygen公司; pMD18-T購(gòu)自寶生物(大連)有限公司;Takara Total-Prep RNA擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自美國(guó)Illumia公司。

2)主要儀器：離心機(jī)(5810R/5415D)購(gòu)自美國(guó)Eppendorf公司;PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司;電泳儀購(gòu)自美國(guó) Bio-Rad公司;Infinium HumanMethylation27 BeadChip購(gòu)自美國(guó)Illumina公司;HumanHT-12 v4 Expression BeadChip購(gòu)自美國(guó)Illumina公司;實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(48孔)(TC988型)購(gòu)自沈陽(yáng)永鑫益實(shí)驗(yàn)儀器銷售有限公司;Illumina BeadChip Reader掃描儀(HiScanSQ)購(gòu)自美國(guó)Illumina公司;RNase-Free凍存管購(gòu)自美國(guó)Corning公司;海爾－80℃冰箱 (DW-86L386)購(gòu)自青島海爾公司。

3)實(shí)驗(yàn)材料：選取2008年至2009年首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院心臟外科收治的心臟移植患者作為研究對(duì)象，本實(shí)驗(yàn)分正常對(duì)照組和疾病組，其中正常組8例取自心臟移植供體左心室心肌，疾病組14例均取自心臟移植患者自身心臟左心房心肌。所有標(biāo)本采樣時(shí)液氮中速凍后保存于 －80℃ 冰箱中，并使用液氮運(yùn)輸。該實(shí)驗(yàn)通過(guò)相關(guān)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1)DNA甲基化芯片高通量篩選：用美國(guó)EZ DNA Methylation Kit將DNA中未甲基化CG島的C轉(zhuǎn)化為T?；蚪MDNA經(jīng)NaOH變性后，加入含引物的MA2 (multi sample amplification 2 Mix)和含酶的MSM(multi sample amplification master Mix)擴(kuò)增。擴(kuò)增好的DNA中加入FMS(fragmentation solution)，37℃酶切1 h。加入含鹽分溶液PM1和異丙醇，使片段化的DNA沉淀。加入含對(duì)照DNA的RA1于48℃放置1 h，使其充分懸浮后加到芯片(Infinium Human Methylation27 Bead Chip)上，48℃雜交16 h～24 h。洗去未雜交的和非特異雜交的DNA并組裝雜交艙。以雜交在芯片上的DNA為模板，加入TEM(含SBE酶，biotin-dNTP，DNP)和95%甲酰胺/1 mmol·L－1EDTA，去除目標(biāo)DNA，芯片上僅留微珠上的單鏈探針。染色。使用掃描儀通過(guò)雙色激光激發(fā)微珠上的熒光基團(tuán)，掃描得到雜交信號(hào)，采用軟件自動(dòng)分析給出代表甲基化程度的Beta值。

2)mRNA表達(dá)譜芯片高通量篩選：取RNA樣本加入無(wú)RNA酶的水至11 μL，之后與反轉(zhuǎn)錄母液9 μL混合42℃孵育2 h合成第一鏈cDNA，繼續(xù)添加第二鏈反應(yīng)母液80 μL，混合后16℃孵育2 h合成第二鏈cDNA;繼之每個(gè)樣本中加入250 μL cDNA結(jié)合液，cDNA慮柱濾過(guò)，用500 μL洗脫液洗滌，用19 μL 50℃ ～55℃無(wú)RNA酶液洗脫cDNA完成cDNA純化;體外轉(zhuǎn)錄cDNA后cRNA純化。RNA擴(kuò)增所用試劑為Illumia TotalPrep RNA擴(kuò)增試劑盒。純化后的cRNA與芯片雜交干燥后采用掃描儀掃描完成圖像分析。

3)重亞硫酸鹽測(cè)序：22個(gè)基因組DNA樣品各取約500 ng，用MethylCode Bisulfite Conversion Kit(Invitrogen)對(duì)基因組DNA進(jìn)行甲基化處理。用合成好的引物和處理過(guò)的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。凝膠回收PCR產(chǎn)物。將回收的PCR產(chǎn)物與 pMD18-T (Takara)連接，室溫連接2 h。取5 μL連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化100 μL DH5a感受態(tài)細(xì)胞，涂氨芐平板，37℃過(guò)夜孵育。每個(gè)平板挑5個(gè)克隆接種于3 mL LB中，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。用質(zhì)粒小量提取試劑盒(Axygen)提取質(zhì)粒。對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，并分析測(cè)序結(jié)果。

4)定量反轉(zhuǎn)錄PCR(定量RT-PCR)驗(yàn)證：提取總RNA，制備反轉(zhuǎn)錄酶混合反應(yīng)液其總體積20 μL。在PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)：16℃，30 min;42℃，42 min;85℃，5 min。反應(yīng)結(jié)束后，將其放在－20℃保存。將所有cDNA樣品分別配置Real time PCR反應(yīng)體系。置于實(shí)時(shí)PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，繪制熔解曲線，每一個(gè)mRNA的相對(duì)表達(dá)水平通過(guò)與內(nèi)參(U6)對(duì)比進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并根據(jù)熒光曲線圖計(jì)算樣本Ct值。abca4的引物序列：5'-GAATCCTACATTACAGCGACCC-3'，3'-GTGGCAGGTAGAGGGTGAAAT-5';cd200的引物序列：5'-GTCTACCTACAGCCTGGTTTGG-3'，3'-AAGGTGATGGTTGAGTTTTGGA-5'。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 16.0版本統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件進(jìn)行分析，亞硫酸氫鈉測(cè)序PCR測(cè)序分析和熒光定量PCR驗(yàn)證分析結(jié)果均采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)檢測(cè)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

本組實(shí)驗(yàn)將正常組與疾病組芯片上甲基化探針的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，利用t檢驗(yàn)計(jì)算差異是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，將P值經(jīng)取對(duì)數(shù)等處理后命名為DiffScore，按照Diffscore值＞20或＜－20的差異甲基化水平比較篩選2組的基因，共得到差異甲基化基因871條，其中甲基化程度升高的基因位點(diǎn)有352個(gè)，甲基化程度低的基因位點(diǎn)有519個(gè)。結(jié)果詳見圖1。

圖1 人類心力衰竭患者23對(duì)染色體DNA甲基化芯片分析結(jié)果Fig.1 Results of whole genome methylation in heart failure patientsRed part：high methylation locus;Blue part：low methylation locus;.Green part：chromosomal centromere locus.

將差異甲基化對(duì)應(yīng)的基因與mRNA表達(dá)譜分析得到的差異基因取交集，共得到13條基因，詳見表1。

表1 疾病組與正常組差異甲基化與差異基因Tab.1 Differential methylation gene

選取abca4和cd200進(jìn)行亞硫酸氫鈉測(cè)序PCR (bisulfite sequencing PCR，BS-PCR)，并用熒光定量PCR驗(yàn)證對(duì)應(yīng)基因表達(dá)量的改變。疾病組abca4基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化率為85.5%，正常組基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化率為91.2%(圖2);疾病組基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化率比正常組基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化率低5.7%，疾病組cd200基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化率為50.5%，正常組基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化率為57.1%。

3 討論

DNA甲基化是通過(guò)將S2腺苷甲硫氨酸作為甲基供體，并在 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase，DNMT)的催化下，CpG二核苷酸中的胞嘧啶環(huán)上5'位置的氫被活性甲基所取代，從而轉(zhuǎn)變成52甲基胞嘧啶。DNA甲基化具有多方面的生理意義，正常的甲基化對(duì)于維持機(jī)體的功能是必需的，如基因印記、X染色體失活、細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育等［2］。DNA甲基化異常包括基因組DNA甲基化水平降低和局部CpG島甲基化程度升高，即低甲基化和高甲基化。DNA甲基化異常主要指DNA高甲基化［3］。一般情況下，基因啟動(dòng)子區(qū)的CpG島為非甲基化狀態(tài)，當(dāng)發(fā)生甲基化時(shí)，常導(dǎo)致基因表達(dá)減少或缺失。特定基因啟動(dòng)子區(qū)的異常高甲基化往往與腫瘤的形成和發(fā)展有關(guān)［2］。而癌基因低甲基化則會(huì)使相關(guān)基因高表達(dá)從而造成正常細(xì)胞生長(zhǎng)分化調(diào)控失常［4-5］。而導(dǎo)致這些基因表達(dá)量改變的DNA甲基化的變化可能很輕微。有研究［6］顯示小腦和大腦組織中rassf1基因甲基化6%的差異會(huì)導(dǎo)致基因表達(dá)量不同。Barrès R等［4］也報(bào)道pgc1a基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化2% ～5%的不同會(huì)導(dǎo)致Ⅱ型糖尿病人股外側(cè)肌中pgc1α基因表達(dá)量3.5倍的差異。乳腺癌患者中，atm基因甲基化8%的不同導(dǎo)致基因表達(dá)量1.5～3.5倍的差異［5］。

Movassagh M等［1］研究認(rèn)為心力衰竭時(shí)同樣存在著DNA甲基化的異常，并且他們發(fā)現(xiàn)不同的甲基化狀態(tài)對(duì)應(yīng)著基因的不同表達(dá)，pecam1基因5'區(qū)高甲基化基因本身則低表達(dá);arhgap24基因的高甲基化其本身則高表達(dá)，而amotl2基因的低甲基化其本身則低表達(dá)，這可能與心力衰竭發(fā)生過(guò)程的細(xì)胞凋亡、鈣離子信號(hào)失調(diào)，及心肌收縮異常、G蛋白受體表達(dá)下調(diào)和血管發(fā)生過(guò)程異常等病理過(guò)程有關(guān)。本課題組應(yīng)用甲基化的方法高通量篩選心力衰竭組與正常對(duì)照組的基因組甲基化異常并與基因表達(dá)譜芯片篩選的疾病組和對(duì)照組間的差異基因取交集得到了13條異常的基因，選取abc4和cd200進(jìn)行研究，從功能分析，abca4基因?qū)儆谀まD(zhuǎn)運(yùn)蛋白ATP-結(jié)合盒(ATP-binding cassette，ABC)家族轉(zhuǎn)運(yùn)體中A族的第4個(gè)成員，由47個(gè)外顯子組成，基因位于染色體1p22上，該基因表達(dá)產(chǎn)物可能參與觀光細(xì)胞中一種特殊分子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)［7］。有研究［8］顯示，在眼底黃色斑點(diǎn)癥患者中存在abca4基因突變。同時(shí)，這一突變可能與視網(wǎng)膜色素變性19基因［9］(retinitis pigmentosa-19)和老年黃斑變性2基因［10-13］(macular degeneration age-related 2)有關(guān)。但是，目前認(rèn)為abca4基因僅在視網(wǎng)膜感光細(xì)胞中表達(dá)，尚未在心肌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)abca4基因的編碼蛋白［14］。cd200基因編碼蛋白是一種Ⅰ-型膜糖蛋白，由6個(gè)外顯子組成，基因位于染色體3q12-q13上［15］，胞膜外區(qū)有兩個(gè)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域，屬于免疫球蛋白超家族，廣泛地表達(dá)在組織中［16］，在多種B細(xì)胞來(lái)源的血液腫瘤中高表達(dá)［17］，并與雄激素性脫發(fā)患者毛囊細(xì)胞成熟過(guò)程有關(guān)［18］。cd200具有介導(dǎo)T細(xì)胞共刺激信號(hào)、促進(jìn)T細(xì)胞增生、使Ⅰ-型細(xì)胞因子減少、2型細(xì)胞因子增加的作用。cd200蛋白在免疫疾病、抑制排斥反應(yīng)及腫瘤生長(zhǎng)過(guò)程中作為一種免疫耐受信號(hào)［15］，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)的作用［19］。

總之，本課題組的研究表明心衰時(shí)DNA啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)會(huì)發(fā)生改變，本課題組的研究只是初步揭示了DNA甲基化在心力衰竭時(shí)的改變，而DNA甲基化究竟如何在心力衰竭的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起作用，及究竟哪些基因位點(diǎn)發(fā)生了甲基化目前還不清楚，尚待期待著進(jìn)一步的研究來(lái)揭示這一奧秘。

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