付文卓 吳英婷 張進(jìn)祿

(首都醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)與測(cè)試中心，北京100069)

胰高血糖素樣肽1(glucagon like peptide，GLP-1)是一種腸促胰島素，可以促進(jìn)胰島素分泌、調(diào)節(jié)血糖、保護(hù)胰島β細(xì)胞，刺激其分化。但是活化的GLP-1在體內(nèi)會(huì)迅速被二肽基肽酶降解而失去活性。吡咯烷類二肽基肽酶(dipeptidyl peptidase-Ⅳ，DPP-4)抑制劑是一種細(xì)胞表面的絲氨酸蛋白酶，主要作用是分解體內(nèi)的蛋白質(zhì)，能夠特異地裂解GLP-1的N端末端第2位的脯氨酸或丙氨基殘基［1-2］。

因此DPP-4抑制劑，可以通過抑制DPP-4活性，避免GLP-1快速失活，維持體內(nèi)GLP-1濃度，進(jìn)而促進(jìn)2型糖尿病患者新的β細(xì)胞的生成，促進(jìn)胰島素分泌，達(dá)到降血糖的效果，阻止疾病惡化，是近年來治療2型糖尿病的新方向［3］。

許多DPP-4抑制劑已經(jīng)上市或者進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，而且都顯示了很好的治療效果。大量DPP-4抑制劑的構(gòu)效關(guān)系已經(jīng)被報(bào)道［4］，根據(jù)已知DPP-4抑制劑的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和作用機(jī)制分為底物類似的DPP-4抑制劑和非底物類似的DPP-4抑制劑，通過結(jié)合方式可分為非共價(jià)鍵DPP-4抑制劑和共價(jià)鍵DPP-4抑制劑。對(duì)于目前已經(jīng)報(bào)道的DPP-4抑制劑，均為雜環(huán)小分子化合物，本文就含有吡咯環(huán)烷結(jié)構(gòu)的二肽基肽酶-Ⅳ抑制劑的作用機(jī)制和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)進(jìn)行綜述。

1 吡咯烷衍生物DPP-4抑制劑的作用機(jī)制

人類DPP-4是766個(gè)氨基酸跨膜糖蛋白，包括：胞質(zhì)尾區(qū)(1～6位殘基)，跨膜區(qū)域(7～28位殘基)和胞外區(qū)域(29～766位殘基)［5］。幾個(gè)重要的作用位點(diǎn)有S1口袋(由Tyr 631，Val 656，Trp 659，Tyr662，Tyr 666和Val711的側(cè)鏈組成，疏水性較高，可以高特異性識(shí)別脯氨酸或其衍生物)，N端識(shí)別區(qū)(谷氨酸殘基Glu205/ Glu206和Tyr662的表面負(fù)電荷區(qū)域能與伯胺或仲胺配體形成氫鍵作用)。以脯氨酸為基本結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，即含有吡咯環(huán)烷類DPP-4抑制劑，具有與DPP-4天然底物相似的結(jié)構(gòu)，可以競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合DPP-4活性部位。DPP-4的催化部位包括酶的S1口袋、N端識(shí)別區(qū)S2口袋和絲氨酸殘基的共價(jià)作用［6］。所以吡咯環(huán)烷類DPP-4抑制劑的基本結(jié)構(gòu)特點(diǎn)含有脯氨酸或類似結(jié)構(gòu)，含有堿性的伯胺或仲胺。根據(jù)結(jié)合的方式，吡咯環(huán)烷類DPP-4抑制劑可分為共價(jià)和非共價(jià)2類。

2 共價(jià)鍵結(jié)合吡咯環(huán)烷類DPP-4抑制劑

這是研究最為廣泛，最為深入的一類DPP-4抑制劑，基本結(jié)構(gòu)包括：氰基吡咯環(huán)和含仲胺取代基［7］。諾華公司研發(fā)的1(NVP DPP-728)(IC50=22 nmol/ L)，如圖1，是第1個(gè)含有氰基吡咯環(huán)結(jié)構(gòu)的DPP-4抑制劑，能夠占據(jù)S1口袋，氰基能與受體產(chǎn)生共價(jià)作用。但是氰基容易與堿性氨基發(fā)生分子內(nèi)環(huán)合，失去活性。所以對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，降低分子內(nèi)環(huán)合，大大提高了血漿半衰期［8］。

圖1 NVP-DPP-728結(jié)構(gòu)式Fig.1 NVP-DPP-728

1)N端修飾：諾華公司以NVP DPP-728為先導(dǎo)化合物，在氨基引入了大體積取代基，如金剛烷胺，得到維格他汀(vildagliptin)2(IC50=35 nmol/L)，見圖2，血漿半衰期明顯延長(zhǎng)為3 h，提高了口服生物藥物的利用度(85%)［9］。

圖2 維格列汀Fig.2 Vildagliptin

K-579(IC50=5 nmol/L)，在氨基附近引入2個(gè)雜環(huán)結(jié)構(gòu)，延長(zhǎng)了作用時(shí)間，t1/2=0.144 h，可作為長(zhǎng)效DPP-4抑制劑［10］，見圖3。類似機(jī)制的DPP-4抑制劑ASP4000(IC50=2.25 nmol/L)，目前已進(jìn)入臨床前研究階段［11］，見圖4。

Cho T P等［13］在氨基端引入［3.3.0］雙環(huán)辛烷，合成了一系列含有雙環(huán)辛烷的衍生物，其中化合物(R1=OMe，R2=H)(IC50=0.008 μmol/L)并體現(xiàn)了對(duì)DPP-4較好的選擇性［12］，見圖5。Cho T P等［13］以［3.3.0］雙環(huán)辛烷衍生物為基礎(chǔ)，繼續(xù)合成了一系列［3.3.0］雙環(huán)辛烷衍生物DPP-4抑制劑(IC50=0.009 μmol/L)，見圖6。其中取代基為N(CH3)2時(shí)，并體現(xiàn)了更好的DPP-4的選擇性。目前已經(jīng)進(jìn)入到一期臨床研究階段。

2)C端修飾：在氰基附近引入大體積基團(tuán)也可以提高氰基吡咯烷類化合物的穩(wěn)定性，如bristol-myers squibb公司在維格他汀結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，在氰基吡咯環(huán)上引入環(huán)丙基，沙格列汀(saxagliptin，IC50=3.37 nmol/l)，增加了穩(wěn)定性，2009年7月被美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市，生物口服利用度為75%，t1/2=2.1 h［14］，見圖7。另一個(gè)化合物二脯氨酰氰類化合物(IC50= 0.25 nmol/L)，C端引入環(huán)丙烷基礎(chǔ)上，在P2上以4位取代的脯氨酸基團(tuán)取代，見圖8。通過構(gòu)效分析，引入5環(huán)的氨基酸可以提高氰基吡咯烷類DPP-4抑制劑的活性，要優(yōu)于4環(huán)或者6環(huán)取代化合物。L-環(huán)氨基酸可以立體異構(gòu)性地與酶的S2口袋結(jié)合［15］。

通過實(shí)驗(yàn)［22］表明在吡咯烷環(huán)C-4位單氟取代，可以提高穩(wěn)定性，如Glenmark pharmaceuticals Ltd公司的化合物美羅利汀(melogliptin，IC50=1.61 nmol/ L)，目前已經(jīng)進(jìn)入到臨床Ⅱ期實(shí)驗(yàn)階段［16］。Glaxosmithkline公司研發(fā)的地那列汀(denagliptin，IC50=22 nmol/ L)，見圖10，其中結(jié)構(gòu)特征為氟取代吡咯烷環(huán)，在N端引入(S)-2-氨基-3，3-二-(4-氟苯基)丙酸，雙氟苯取代基團(tuán)可以與Phe357和Tyr547殘基的芳環(huán)相互作用，已經(jīng)進(jìn)入到臨床Ⅲ期實(shí)驗(yàn)階段［17］。另外由Taisho公司研發(fā)的TS-021(IC50=5.0 nmol/L)，目前處于臨床Ⅰ期的實(shí)驗(yàn)階段［18］，見圖11。

雅培公司研發(fā)的ABT-279引入乙炔基，見圖12，表現(xiàn)了很好的活性和選擇性〔Ki=1.0 nmol/L(DPP-4)，＞30 mol/L(DPP-8)，＞30 mol/L(DPP-9)，＞30 mol/L(DPP-7)〕，同時(shí)也具有很好的臨床前藥理安全性［CYP3A4，CYP2D6，CYP2C9(IC50＞30 mol/L)］和毒理研究，給予鼠和狗4周每天大于1 000 mg/kg，均不見其產(chǎn)生明顯的不良反應(yīng)［19］。

3 非共價(jià)鍵結(jié)合吡咯環(huán)烷類DPP-4抑制劑

在上述氰基吡咯烷類化合物去掉親電子基團(tuán)氰基，可以直接減少環(huán)化的概率，提高穩(wěn)定性。所以合理設(shè)計(jì)合成一系列無氰基的吡咯環(huán)類DPP-4抑制劑。由于缺少和絲氨酸的共價(jià)作用，所以活性中等。如苯基丙氨酸衍生物結(jié)構(gòu)式(IC50=110 nmol/L)，見圖13［20］。

圖13 苯基丙氨酸衍生物Fig.13 Phenylalanine based derivative

(s)-環(huán)己烷甘氨酸類化合物(IC50=320 nmol/ L)［21］，不含氰基的吡咯環(huán)類抑制劑，后來多以環(huán)己烷甘氨酸類化合物為先導(dǎo)化合物，進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，獲得更優(yōu)秀的DPP-4抑制劑。以磺胺基團(tuán)修飾后磺胺基團(tuán)取代化合物(IC50=88 nmol/L)，活性和選擇性都提高了［22］，見圖14。

Tsai T Y等［23］合成了一系列2-(吡咯烷-1-羰基)取代的酰胺類化合物，其中活性最好的是2-(吡咯烷-1-羰基)取代的酰胺類化合物(IC50=0.050 μmol/ L)，通過 LC-MS該化合物在水中表現(xiàn)了很好的穩(wěn)定性。

以氟取代的吡咯環(huán)替代環(huán)己烷甘氨酸類化合物的吡咯環(huán)，設(shè)計(jì)并合成了一系列衍生物，具有同等或者更好的母體化合物。苯基丙氨酸類衍生物二甲氨基取代苯基丙氨酸衍生物具有DPP-4抑制活性和選擇性，見圖17［24］，由于該類化合物的親脂性基團(tuán)(聯(lián)芳基團(tuán))，其與hERG離子通道結(jié)合特性，所以在血漿中IC50值要增加到10倍以上。

圖17 二甲氨基取代苯基丙氨酸衍生物Fig.17 Dimethylamide substituted phenylalanine derivative

用其他雜環(huán)替代二甲氨基取代苯基丙氨酸衍生物中4位氟苯基，得到化合物二甲氨基取代苯基丙氨酸衍生物(IC50=4.3 nmol/L)，與hERG的結(jié)合能力得到了提高(IC50=86 mol/L)，但是因?yàn)榭赡艽嬖诮?jīng)鼠和人的代謝后活化，所以并沒有繼續(xù)深入研究［25］。

圖18 二甲氨基取代苯基丙氨酸衍生物Fig.18 Dimethylamide substituted phenylalanine derivative

用環(huán)己基代替二甲氨基取代苯基丙氨酸衍生物中的苯基，得到的化合物4位氨苯基丙氨酸衍生物(IC50=0.016 μmol/L)，具有很好的抑制活性，相對(duì)于DPP-8，DPP-9具有高度的選擇性，和離子通道hERG結(jié)合性低(IC50＞90 μmol/L)，但是在嚙齒類動(dòng)物中的活性沒有達(dá)到預(yù)期結(jié)果［26］。結(jié)合化合物二甲氨基取代苯基丙氨酸衍生物和4位氨苯基丙氨酸衍生物得到新的一系列4-芳環(huán)己基丙氨酸DPP-4抑制劑，如環(huán)己烷丙氨酸衍生物(IC50=0.0048 μmol/L)，X-射線晶體，環(huán)己烷丙氨酸衍生物的雜環(huán)部分與DPP-4的Arg358活性部位以氫鍵結(jié)合［27］。

4-氨基環(huán)己烷氨基乙酸衍生的 DPP-4抑制劑(IC50=48 nmol/L)，沒有親電子基團(tuán)［28］，活性得到顯著提高，但是同時(shí)氟代吡咯氨基化合物對(duì)DPP-8，DPP-9也有很大的抑制作用DPP-8(IC50=993 nmol/ L)，DPP-9(IC50=2 720 nmol/L)，所以停止了進(jìn)一步的研究，見圖21。

圖21 氟代吡咯氨基化合物Fig.21 Fluoropyrrolidine amides

將圖17中的苯基替代為其他雜環(huán)，通過構(gòu)效關(guān)系研究合成了一系列新的惡唑環(huán)類DPP-4抑制劑，最優(yōu)化的是〔IC50=0.019μmol/L(DPP-4)，＞100μmol/ L(DPP-8)，＞100 μmol/L(DPP-9)〕，并且體現(xiàn)了很好的選擇性［29］，見圖22。通過X射線晶體衍射，二唑基衍生物的伯胺和β－甲基之間有同步性。圖22中的結(jié)合方式不同于苯基丙氨酸類衍生物二甲氨基取代苯基丙氨酸衍生物，二甲氨基取代苯基丙氨酸衍生物，環(huán)已烷丙氨酸衍生物。惡唑環(huán)進(jìn)入到另一個(gè)DPP-4鍵合口袋。但是二唑基衍生物口服半衰期很短，其中鼠的半衰期為 (t1/2=1.3 h)，狗的半衰期為(t1/2=1.75 h)，所以阻礙了進(jìn)一步研究。

圖22 二唑基衍生物Fig.22 Oxadiazole-based derivatives

多氟化的吡咯烷類衍生物已成為新的一類DPP-4抑制劑［30］，代表性的化合物是四氟取代吡咯烷(Ki=81 nmol/L)，表現(xiàn)了較強(qiáng)DPP-4抑制劑活性，見圖23。

圖23 氟代吡咯氮環(huán)丁烷Fig.23 Fluorinated pyrrolidine and azetidine amides

4 結(jié)語

2006年首個(gè)DPP-4抑制劑成功應(yīng)用于臨床后，DPP-4抑制劑就備受關(guān)注，目前已經(jīng)有很多DPP-4抑制劑進(jìn)入了臨床實(shí)驗(yàn)階段。其中吡咯烷類DPP-4抑制劑研究的最為廣泛。通過晶體結(jié)構(gòu)分析，研究了吡咯烷類DPP-4抑制劑的作用機(jī)制，通過構(gòu)效關(guān)系研究，對(duì)吡咯烷類DPP-4抑制劑進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，增加其穩(wěn)定性的同時(shí)提高了DPP-4的抑制活性與選擇性。期望在上述基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究，可以尋找到更高效，更安全的DPP-4抑制劑。

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