南 楠 金澤寧* 楊 澤

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院心血管內(nèi)科，北京市心肺血管疾病研究所，北京100029; 2.衛(wèi)生部北京醫(yī)院，老年醫(yī)學(xué)研究所遺傳室，北京100730)

根據(jù)美國心臟病協(xié)會(American Heart Associa- tion，AHA)2010年的報(bào)告［1］，由于積極地進(jìn)行危險(xiǎn)因素的干預(yù)，心血管事件的發(fā)生率在過去的20年間降低了50%左右，但盡管如此，2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)患者中冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(coronary artery disease，CAD，以下簡稱冠心病)的發(fā)生率和病死率的絕對危險(xiǎn)度仍然是非2型糖尿病者的2倍左右［發(fā)病率的風(fēng)險(xiǎn)比(hazard ratio，HR)女性為2.5，男性為2.4，女性患者病死率的HR為2.2，男性為1.7］［1-3］。白種人ADIPOQ基因多態(tài)性與2型糖尿病合并冠心病關(guān)聯(lián)［4-7］。但白種人與中國人有遺傳異質(zhì)性。本研究探討ADIPOQ基因多態(tài)性在中國2型糖尿病人群中與冠心病的關(guān)聯(lián)。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2007年2月至2009年5月北京安貞醫(yī)院心內(nèi)科住院患者，冠狀動脈造影結(jié)果顯示左主干、左前降支、左回旋支、右冠狀動脈至少1支狹窄≥50%，診斷為冠心病;并且符合1999年WHO糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)［1］，作為2型糖尿病合并冠心病組，共213例。選取2008年1月至2009年10月衛(wèi)生部北京醫(yī)院內(nèi)分泌科門診患者符合1999年WHO糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)［1］且無冠心病病史者，作為2型糖尿病對照組，共467例，獲得所有研究對象知情同意。

1.2 標(biāo)本采集

清晨空腹排空膀胱后測量身高、體質(zhì)量、血壓、靜脈空腹血脂、血糖、糖化血紅蛋白(hemoglobin A1c，HBA1c)、尿酸、肌酐、尿素氮等指標(biāo)，記錄研究對象年齡、性別，留取5 mL EDTA抗凝靜脈血，鹽析法［8］提取DNA。采用Nanodrop ND-1000分光光度計(jì)對dsDNA進(jìn)行質(zhì)量控制，將所有樣本的dsDNA濃度標(biāo)化至70～90 ng/μL之間，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 預(yù)實(shí)驗(yàn)

本研究首先對20例2型糖尿病合并冠心病患者進(jìn)行ADIPOQ基因第2個(gè)外顯子區(qū)域測序，測序引物設(shè)計(jì)應(yīng)用Oligo 7.0軟件(Molecular Biology Insights，Inc.)，上游引物序列：5'-GAAAGAACCAGCCAAGGAGTGAGA-3'，下游引物序列：5'-GGGAATAGGGATGAGGGTGAAGAT-3'，產(chǎn)物片段長度為1 283 bp，由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)50 μL體系為：模板10 μL，dNTP 1 μL，TaqDNA聚合酶2.5 μL，10× Buffer 5 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，加去蒸餾水至50 μL。在PTC-225PCR儀上進(jìn)行PCR，其反應(yīng)條件為：首先95℃預(yù)變性5 min后，95℃變性1 min，64.4℃復(fù)性30 s，72℃延伸1.5 min，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7 min。將1 283 bp目的片段用于測序，由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司進(jìn)行測序。將20例T2DM+ CAD組患者的測序結(jié)果與Human(GRCh37)的ADIPOQ基因的序列，應(yīng)用Megalign軟件的Clustal W方法進(jìn)行序列拼接，將突變頻率大于0.05的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)作為候選基因的SNPs。

1.4 大樣本量復(fù)制研究

將預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選出的候選SNPs在213例2型糖尿病合并冠心病以及467例單純2型糖尿病患者進(jìn)行基因頻率分布的比較?；蚍中突诟叻直媛嗜劢馇€(high resolution melting，HRM)小擴(kuò)增子法。

1)引物設(shè)計(jì)：應(yīng)用LightScanner引物設(shè)計(jì)軟件對rs2241766多態(tài)性進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物序列為：上游引物：5'-CTGGGAGCTGTTCTACTG-3'，下游引物：5'-CT TGAGTCGTGGTTTCCT-3'。高溫內(nèi)參：5'-GCGCGGCC GGCACTGACCCGAGACTCTGAGCGGCTGCTGGAGGTG CGGAAGCGGAGGGGCGGGC-3'，低溫內(nèi)參：5'-TTAAA TTATAAAATATTTATAATATTAATTATATATATATAAA TATAATAC-3'。

2)PCR反應(yīng)體系(10 μL)：DNA模板1 μL，0.01 mmol/L dNTP 0.2 μL，TaqDNA聚合酶1 U，10×PCR緩沖液1.0 μL，0.01 mmol/L擴(kuò)增引物0.2 μL(上游引物和下游引物各0.1 μL)，0.01 mmol/L寡核苷酸內(nèi)參0.2 μL(高溫寡核苷酸內(nèi)參與低溫寡核苷酸內(nèi)參各0.1 μL)，LCGreen飽和熒光染料0.8 μL，去離子水6.4 μL補(bǔ)充至總體積為10 μL。

3)反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性1 min，58.4℃復(fù)性30 s，延伸6 s，共55個(gè)循環(huán)，72℃總延伸7 min。

4)再進(jìn)行變性復(fù)性處理：95℃30 s，25℃2 min，94℃ 30 s，24℃ 4 min。

5)HRM檢測：LightScanner儀器從45℃開始，以0.3℃/s的斜率采集熔解曲線，至98℃結(jié)束，用LightScanner Call IT 2.0軟件對采集后的曲線進(jìn)行分析，確定基因型。

6)測序驗(yàn)證：對HRM分析的不同基因型進(jìn)行測序驗(yàn)證，以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。rs2241766T/G多態(tài)性的熔解曲線見圖1。

圖1 應(yīng)用高分辨率熔解曲線分析法檢測rs2241766T/G序列突變Fig.1 Genotyping of rs2241766T/G polymorphism by high resolution melting analysisA：shifted melting peaks，the internal temperature calibrators are designed to melt at 60.33℃(low Cal-1)and 92.0℃(high Cal-1);B：normalized melting peaks.The genotypes(TT/TG/GG)could be clearly distinguished.

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以率表示，組間比較用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

20例極端表型病例(2型糖尿病合并冠心病)和 45例參考數(shù)據(jù)庫中國漢族北京人的序列拼接比較，在ADIPOQ基因中發(fā)現(xiàn)5個(gè)SNPs，包括rs17366568G/A、9882205G/A、2241767A/G、1501299G/T、2241766T/ G。以rs2241766T/G多態(tài)性為例，其拼接及測序結(jié)果見圖2、圖3。各個(gè)SNPs位點(diǎn)基因分型結(jié)果，見表1。初步預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)2個(gè)位點(diǎn)與2型糖尿病合并冠心病關(guān)聯(lián)，包括rs2241766T/G多態(tài)性［OR(95%CI)=2.78(1.20～8.65)，P=0.015］和rs9882205G/A多態(tài)性［OR(95%CI)=3.9(1.78～13.61)，P=0.001］。

表1 預(yù)實(shí)驗(yàn)中脂聯(lián)素基因的5個(gè)SNPs分布情況Tab.1 The distributions of 5 SNPs in ADIPOQ gene in pilot study

2.2 基線情況

213例2型糖尿病合并冠心病(病例組)以及467例單純2型糖尿病患者(對照組)臨床基線數(shù)據(jù)見表2。病例組男性患者比例、體質(zhì)量指數(shù)、收縮壓、舒張壓、總膽固醇、糖化血紅蛋白均高于對照組，而高密度脂蛋白膽固醇(HDL)低于對照組。年齡、肌酐、尿酸、空腹血糖以及低密度脂蛋白膽固醇(LDL)在兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 病例組(T2DM+CAD)及對照組(CAD)臨床基線數(shù)據(jù)Tab.2 Clinical baseline of case group(T2DM+CAD)and control group(T2DM)

2.3 大樣本量復(fù)制研究結(jié)果

對rs2241766(+45T＞G)多態(tài)性進(jìn)行擴(kuò)大樣本量的研究。兩組基因型及等位基因分布見表3，2型糖尿病對照組基因型分布觀察值與期望值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，符合Hardy-Weinberg遺傳平衡，說明樣本來自一個(gè)隨機(jī)婚配平衡狀態(tài)的群體，具有代表性。在2型糖尿病患者中，rs2241766多態(tài)性與冠心病風(fēng)險(xiǎn)無關(guān)。

3 討論

糖尿病是冠心病的高危合并癥［9］。一系列遺傳關(guān)聯(lián)研究和家族聚集性研究［10-12］表明糖尿病合并冠心病的易感性50%是遺傳因素導(dǎo)致的。脂肪細(xì)胞大量地分泌脂聯(lián)素，其在2型糖尿病的發(fā)生以及冠心病進(jìn)程中發(fā)揮保護(hù)作用，通過直接激活A(yù)MP激活蛋白酶(AMP kinase，AMPK)通路［13］。脂聯(lián)素在糖代謝中主要的作用是通過AMPK途徑激活PPARα，后者增加葡萄糖的攝取并降低肝糖原的輸出。脂聯(lián)素在CAD中的保護(hù)性效應(yīng)通過激活心肌細(xì)胞AMPK信號通路，并且通過環(huán)氧化酶2(cycloxygenase-2，COX2)產(chǎn)生前列腺素E2［14］。Cao Y等［15］發(fā)現(xiàn)通過干預(yù)直接增加血漿脂聯(lián)素水平，可能改善內(nèi)皮功能，并且降低糖尿病患者心血管合并癥的發(fā)生。Fox C S等［3］發(fā)現(xiàn)在2型糖尿病患者中，合并冠心病患者血漿脂聯(lián)素水平較低。

表3 脂聯(lián)素基因rs2242766(+45T/G)多態(tài)性在病例組與對照組間分布Tab.3 Comparison of distribution of ADIPOQ rs2241766 (+45T/G)polymorphism in case and control groups

脂聯(lián)素(adiponectin，ADIPOQ)基因位于人體第3號染色體3q27區(qū)，包括3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，全長 15.77 kb，編碼區(qū)為 4.599 kb。 +45T＞G (rs2241766)位于第2個(gè)外顯子，為同義突變，Qi L等［4］發(fā)現(xiàn)對于rs2241766而言，G等位基因攜帶者與AA基因型者相比，血漿脂聯(lián)素水平無明顯差異。

越來越多的數(shù)據(jù)［4-7，16-17］表明ADIPOQ基因突變在糖尿病患者中與冠心病相關(guān)。但結(jié)果卻不盡一致。Lacquemant C等［7］在法國和瑞士的2型糖尿病患者隊(duì)列研究中，通過對162例糖尿病合并冠心病病人以及315例糖尿病對照患者比較后發(fā)現(xiàn)，無論是2個(gè)隊(duì)列單獨(dú)比較，還是將兩組合并，rs2241766(+45T＞G)與冠心病關(guān)聯(lián)。與TT純合子相比，GG純合子和GT雜合子組合升高患冠心病的風(fēng)險(xiǎn)(OR=2.0;95% CI：1.3～3.2;P=0.020)。而在之后的研究中，如意大利、日本以及美國糖尿病患者隊(duì)列研究［4-6，16］中并未發(fā)現(xiàn)rs2241766與冠心病的關(guān)聯(lián)。馬曉偉等［17-18］在中國人群159例2型糖尿病合并冠心病病例，以及3本研究首先通過對20例擁有極端表型(2型糖尿病合并冠心病)患者進(jìn)行ADIPOQ基因第2個(gè)外顯子測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn) rs2241766多態(tài)性 G等位基因增加T2DM合并CAD風(fēng)險(xiǎn)［OR(95%CI)=2.78(1.20～8.65)，P=0.015］，然而在大樣本量復(fù)制研究中未發(fā)現(xiàn)rs2241766T/G多態(tài)性與T2DM、CAD或T2DM合并CAD關(guān)聯(lián)的趨勢。與大多數(shù)隊(duì)列研究結(jié)果一致。因此，rs2241766T/G多態(tài)性可能不是影響2型糖尿病患者發(fā)生冠心病的危險(xiǎn)因素。

對于2型糖尿病對照組的選擇差異可能是導(dǎo)致各項(xiàng)研究結(jié)果不一致的原因。Lacquemant C等［7］、Bacci S等［6］、Ohashi K等［16］通過心絞痛病史，并且靜息心電圖正常排除冠心病;Qi L等［4-5］則進(jìn)行前瞻性研究，通過隨訪心血管事件明確或排除冠心病;馬曉偉等［17］則是通過冠狀動脈造影陰性來排除冠心病，但導(dǎo)致對照組樣本量少于病例組;本研究通過冠狀動脈造影明確冠心病而通過無心絞痛病史排除冠心病，而無排除冠心病的客觀證據(jù)，可能存在一定誤差。

［1］ Lloyd-Jones D，Adams R J，Brown T M，et al.Heart disease and stroke statistics——2010 update：a report from the American Heart Association［J］.Circulation，2010，121 (7)：e46-e215.

［2］ Preis S R，Hwang S J，Coady S，et al.Trends in all-cause and cardiovascular disease mortality among women and men with and without diabetes mellitus in the Framingham Heart Study，1950 to 2005［J］.Circulation，2009，119(13)：1728-1735.

［3］ Fox C S，Hwang S J，Coady S，et al.Trends in cardiovascular complications of diabetes［J］.JAMA，2004，292 (20)：2495-2499.

［4］ Qi L，Doria A，Manson J E，et al.Adiponectin genetic variability，plasma adiponectin，and cardiovascular risk in patients with type 2 diabetes［J］.Diabetes，2006，55(5)：1512-1516.

［5］ Qi L，Li T，Rimm E，et al.The+276 polymorphism of the APM1 gene，plasma adiponectin concentration，and cardiovascular risk in diabetic men［J］.Diabetes，2005，54 (5)：1607-1610.

［6］ Bacci S，Menzaghi C，Ercolino T，et al.The+276 G/T single nucleotide polymorphism of the adiponectin gene is associated with coronary artery disease in type 2 diabetic patients［J］.Diabetes Care，2004，27(8)：2015-2020.

［7］ Lacquemant C，F(xiàn)roguel P，Izzo P，et al.The adiponectin gene SNP+45 is associated with coronary artery disease in Type 2(non-insulin-dependent)diabetes mellitus［J］.Diabet Med，2004，21(7)：776-781.

［8］ Nasiri H，F(xiàn)orouzandeh M，Rasaee M J，et al.Modified salting-out method：high-yield，high-quality genomic DNA extraction from whole blood using laundry detergent［J］.J Clin Lab Anal，2005，19(6)：229-232.

［9］ Haffner S M，Lehto S R，Nnemaa T，et al.Mortality from coronary heart disease in subjects with type 2 diabetes and in nondiabetic subjects with and without prior myocardial infarction［J］.N Engl J Med，1998，339(4)：229-234.

［10］Ordovas J M.Genetic links between diabetes mellitus and coronary atherosclerosis［J］.Curr Atheroscler Rep，2007，9 (3)：204-210.

［11］Fumeron F，Reis A F，Velho G.Genetics of macrovascular complications in diabetes［J］.Curr Diab Rep，2006，6(2)：162-168.

［12］Barakat K，Hitman G A.Genetic susceptibility to macrovascular complications of type 2 diabetes mellitus［J］.Best Pract Res Clin Endocrinol Metab，2001，15(3)：359-370.

［13］Kawano J，Arora R.The role of adiponectin in obesity，diabetes，and cardiovascular disease［J］.J Cardiometab Syndr，2009，4(1)：44-49.

［14］Ferrarezi D A，Cheurfa N，Reis A F，et al.Adiponectin gene and cardiovascular risk in type 2 diabetic patients：a review of evidences［J］.Arq Bras Endocrinol Metabol，2007，51(2)：153-159.

［15］Cao Y，Tao L，Yuan Y，et al.Endothelial dysfunction in adiponectin deficiency and its mechanisms involved［J］.J Mol Cell Cardiol，2009，46(3)：413-419.

［16］Ohashi K，Ouchi N，Kihara S，et al.Adiponectin I164T mutation is associated with the metabolic syndrome and coronary artery disease［J］.J Am Coll Cardiol，2004，43(7)：1195-1200.

［17］Ma X W，Lin Y H，Li J P，et al.Adiponectin gene polymorphisms are associated with the risk of coronary artery disease in Chinese type 2 diabetic patient［J］.Chin J Diabetes，2008(04)：197-200.

［18］馬亞紅，冼勛德，楊俊芬，等.2型糖尿病HDL26的變化特點(diǎn)及時(shí)預(yù)測冠心病風(fēng)險(xiǎn)的意義［J］.首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，32(5)：609-613.