化 冰 楊夢(mèng)晗 池亞菲 王 超

(首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)系，北京100069)

1922年，研究者［1］在果蠅中發(fā)現(xiàn)了一類具有轉(zhuǎn)錄抑制作用的基因，由于這類基因負(fù)責(zé)其軀干、肢體和翅膀上與感覺神經(jīng)功能有關(guān)的鬃毛或毛發(fā)發(fā)育，因此被命名為Hairy基因。Hairy類基因編碼的蛋白質(zhì)為一種具有堿性螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄抑制因子，因此統(tǒng)稱為Hairy相關(guān)蛋白［2］。隨后，在哺乳動(dòng)物體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了一類與Hairy相關(guān)蛋白結(jié)構(gòu)和功能相似的HEY(Hairy and enhancer-of-split related with YRPW motif)基因。近年來研究［3］顯示，HEY基因家族通過介導(dǎo)Notch信號(hào)系統(tǒng)影響心臟發(fā)育，與人類心臟瓣膜形成，心肌及大血管發(fā)育密切相關(guān)，如HEY2基因突變會(huì)引起人類諸多類型先天性心臟病。本文主要綜述了HEY基因家族在人類心血管發(fā)育中的作用。

1 HEY基因家族及其編碼蛋白的特點(diǎn)

1999年，Leimeister C等［4］在小鼠腎臟發(fā)育早期調(diào)節(jié)基因中，發(fā)現(xiàn)了一類編碼蛋白結(jié)構(gòu)與Hairy相關(guān)蛋白相似的基因，分別命名為HEY1、HEY2和HEYL (Hey-Like)，統(tǒng)稱HEY基因家族。該家族編碼蛋白質(zhì)均屬具有堿性螺旋-環(huán)-螺旋(basic helix-loop-helix，bHLH)的轉(zhuǎn)錄因子。蛋白結(jié)構(gòu)分析［5］表明，HEY蛋白家族與其他的Hairy相關(guān)蛋白結(jié)構(gòu)存在差異，導(dǎo)致其與DNA的結(jié)合存在特異性，因此被歸為新的蛋白亞家族。其差別在于：①HEY1和HEY2的C-端的4個(gè)氨基酸序列不同于Hairy相關(guān)蛋白;HEYL則因?yàn)闆]有該基因序列而被稱為Hey-Like基因;② Hairy相關(guān)蛋白bHLH結(jié)構(gòu)域的堿性區(qū)依賴脯氨酸與DNA特異性結(jié)合，而HEY家族為甘氨酸;③HEY蛋白的C-端有一個(gè)特異的TE(I/V)GAF結(jié)構(gòu)域。

2 HEY基因家族在哺乳動(dòng)物心血管發(fā)育中的作用

2.1 在心臟發(fā)育中的作用

HEY基因家族參與了哺乳動(dòng)物心臟發(fā)育，但所承擔(dān)的角色和重要性有別。HEY1在心臟發(fā)育早期僅在心房細(xì)胞中表達(dá)，HEY2則在心室細(xì)胞中表達(dá)［6］。在出生后，HEY1和HEY2在心臟中的表達(dá)就逐漸減退［7］。當(dāng)分別敲除小鼠HEY1和HEYL基因后，并不影響小鼠繁殖，且心血管系統(tǒng)也未表現(xiàn)功能異常［8］。但HEY2基因敲除后情況發(fā)生了變化，Kokubo H等［9］研究發(fā)現(xiàn)，HEY2－/－小鼠表現(xiàn)出嚴(yán)重的心血管畸形，包括法洛四聯(lián)癥、三尖瓣狹窄或閉鎖或室間隔缺損等心臟畸形。在出生后早期，大部分純合突變小鼠死于充血性心力衰竭并伴有心臟的明顯擴(kuò)大。對(duì)生后5 d的純合突變小鼠行超聲心動(dòng)圖檢查發(fā)現(xiàn)有二尖瓣和三尖瓣返流，膜部室間隔缺損，繼發(fā)孔房間隔缺損等畸形所導(dǎo)致的血流動(dòng)力學(xué)異常。

1)參與心臟瓣膜的形成：心臟瓣膜形成的主要過程是瓣膜形成位置的內(nèi)皮細(xì)胞特化、增生并分化為間質(zhì)細(xì)胞，被稱為內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(endothelial-to-mesenchymal transformation，EMT)［10］。單 獨(dú) 研 究［11］HEY2－/－小鼠發(fā)現(xiàn)，HEY2－/－小鼠房室瓣的發(fā)育異常，HEY2－/－小鼠表現(xiàn)出一系列與瓣膜發(fā)育失控相關(guān)的心臟畸形，包括法洛四聯(lián)癥、三尖瓣閉鎖和室間隔缺損。說明HEY2基因表達(dá)對(duì)心臟瓣膜的形成是必需的。HEY1和HEY2雙敲除小鼠則僅有很少的細(xì)胞能進(jìn)行EMT，提示HEY1和HEY2在EMT過程中均起作用。

研究［12］顯示，在人類法洛四聯(lián)癥患兒HEY2基因的5個(gè)外顯子中，未發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)，只發(fā)現(xiàn)2個(gè)新的雜合性同義突變位點(diǎn)，說明HEY2基因可能不是人類法洛四聯(lián)癥發(fā)病的相關(guān)基因。其發(fā)病機(jī)制有待于深入研究。

2)參與心肌正常發(fā)育：HEY2在小鼠心肌細(xì)胞的正常發(fā)育中起重要作用，而且HEY1基因與HEY2基因之間的相互作用對(duì)心肌小梁的形成和維持是必需的。Kokubo H等［11］發(fā)現(xiàn)，HEY1－/－和HEY2－/－小鼠均表現(xiàn)出心室肌小梁的缺陷。實(shí)驗(yàn)初期，小鼠心室腔具有致密部和小梁部，其后小梁部心肌細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致肌小梁的形成不良。正常情況下，如果二尖瓣出現(xiàn)返流，則左心室的收縮功能會(huì)代償性增加。HEY2－/－小鼠超聲心動(dòng)圖檢查發(fā)現(xiàn)該類小鼠存在二尖瓣返流，但左心室收縮功能卻降低了［13］。研究［14］發(fā)現(xiàn)HEY2－/－小鼠心肌細(xì)胞出現(xiàn)線粒體形態(tài)異常，糖原顆粒堆積和肌原纖維組織破壞等問題。存活的HEY2－/－小鼠有輕度畸形表現(xiàn)，且超聲心動(dòng)圖表現(xiàn)出左心室射血分?jǐn)?shù)的降低［15］。據(jù)此推測(cè)該小鼠心肌細(xì)胞發(fā)育不良是左心室收縮功能降低的主要原因。

2.2 在血管發(fā)育中的作用

在血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)育過程中，3種HEY基因表達(dá)有重疊結(jié)構(gòu)域，提示它們之間功能上互補(bǔ)。成年小鼠血管損傷后，HEY2基因有調(diào)節(jié)血管平滑肌增生和遷移的功能［16］，而HEY2－/－小鼠未表現(xiàn)血管發(fā)育異常。HEY1－/－和 HEY2－/－小鼠胚胎表現(xiàn)出嚴(yán)重的血管畸形，血管畸形雖然不影響血管的初始形成，但會(huì)導(dǎo)致胚胎和卵黃囊中重要大血管的缺失。在正常小鼠胚胎大血管的發(fā)育形成過程中，左右背側(cè)動(dòng)脈向下向后融合為腹側(cè)的降主動(dòng)脈繼而與前主靜脈相連，HEY1－/－、HEY2－/－小鼠左右背側(cè)動(dòng)脈發(fā)育不良，其通過毛細(xì)血管及其他分支血管代替降主動(dòng)脈發(fā)育直接與前主靜脈相通，這一發(fā)現(xiàn)與斑馬魚grl基因突變或敲除的血管表現(xiàn)極為相似。與小鼠HEY2基因同源的斑馬魚gridlock(grl)基因突變后，斑馬魚表現(xiàn)出背側(cè)軀干至尾部的血流中斷［17］。由此可見，HEY基因是血管發(fā)育的關(guān)鍵基因之一。

3 HEY基因家族是Notch信號(hào)的重要靶基因

Notch信號(hào)通路在脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物中高度保守，它在決定細(xì)胞的分化上起關(guān)鍵作用。Notch信號(hào)通路主要由 Notch受體、Notch配體和 RBP-Jκ (RBP-J kappa associated molecular)等組成。其中RBP-Jκ是DNA轉(zhuǎn)錄因子，也稱CSL。哺乳動(dòng)物分別有4種Notch受體(Notch1～4)和5種配體(Deltalike1、3、4和Jagged1、2)。當(dāng)Notch受體與相鄰細(xì)胞間的Notch配體結(jié)合后，通過早老素依賴的蛋白水解效應(yīng)，Notch受體被蛋白酶切割，釋放Notch胞內(nèi)結(jié)構(gòu)區(qū)(Notch intercellular domain，NICD)，進(jìn)入細(xì)胞核在MAML轉(zhuǎn)錄復(fù)合物(MAML transcription complex)的作用下，與RBP-Jκ結(jié)合，使其由轉(zhuǎn)錄抑制物轉(zhuǎn)變?yōu)榧せ钗铮{(diào)節(jié)下游靶基因HEY基因家族表達(dá)(Notch信號(hào)通路詳見圖1)。目前促進(jìn)NICD釋放的蛋白酶為γ—促分泌酶抑制劑DAPT，激活Notch途徑可通過加入其重組的受體蛋白實(shí)現(xiàn)，如重組大鼠 Jagged1蛋白［18］。

目前已經(jīng)證實(shí)，Notch受體在心血管系統(tǒng)有表達(dá)［19］。甄一松等［3］通過對(duì)小鼠的研究，發(fā)現(xiàn)Notch信號(hào)對(duì)于心室壁小梁心肌細(xì)胞的增生和分化起到非常關(guān)鍵的作用。Notch信號(hào)通路促進(jìn)了血管發(fā)育過程中的動(dòng)脈分化。在Notch配體Delta-like4的刺激下，激活Notch信號(hào)可誘導(dǎo)動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的特異性標(biāo)志如ephrinb2的表達(dá)［6］。

圖1 Notch信號(hào)通路Fig.1 Notch signaling lineNICD：notchintercellular domin;RBP-J：RBP-J kappa associated molecular.

秦亞錄等［20］通過對(duì)Notch信號(hào)通路的研究可知，在HEY基因家族中，HEY1、HEY2、HEYL均受到Notch信號(hào)調(diào)節(jié)，且是Notch為數(shù)不多的靶基因。HEY基因家族的所有基因也都在血管中表達(dá)［21］，其表達(dá)始于血管形成早期，其中HEY1的表達(dá)限制在內(nèi)皮層，而HEY2和HEYL則在平滑肌細(xì)胞層中優(yōu)勢(shì)表達(dá)。HEY基因家族在 Notch胞內(nèi)結(jié)構(gòu)區(qū) NICD與轉(zhuǎn)錄因子RBP-Jκ結(jié)合后被激活，作用于心血管系統(tǒng)影響其發(fā)育，如Notch信號(hào)的配體Jagged1突變小鼠均在胚胎期死于嚴(yán)重的血管畸形，提示了HEY基因家族介導(dǎo)Notch信號(hào)通路在血管形成、構(gòu)建及動(dòng)靜脈分化中的作用［22］。由于HEY2－/－小鼠與人類Jagged1突變表型相似，而Jagged1是Notch的5種配體之一。因此可能是由HEY2基因缺失造成Notch信號(hào)通路傳遞障礙引起的心肌肥厚和心肌纖維紊亂。有研究［23］發(fā)現(xiàn)，HEY2－/－小鼠雖然沒有導(dǎo)致心肌肥厚，但是出現(xiàn)左右心腔擴(kuò)大，心房基因的錯(cuò)位表達(dá)。Pedrazzini實(shí)驗(yàn)室最近研究［24］表明，HEY基因家族介導(dǎo)Notch信號(hào)通路還參與了心肌肥厚形成過程中脅迫環(huán)境下的心肌保護(hù)。因此可以認(rèn)為HEY基因家族是血管系統(tǒng)Notch途徑中主要的轉(zhuǎn)換分子。

綜上所述，HEY基因在心血管發(fā)育中起到重要作用，尤其是HEY2基因的突變可引起多種先天性心臟病與心血管畸形的發(fā)生，但具體的作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究，對(duì)HEY2基因功能的詮釋有助于了解先天性心臟病與心血管畸形等疾病發(fā)生的規(guī)律和研究新的治療方案。

［1］ Fisher A，Candy M.The function of hairy-related bHLH repressor proteins in cell fate decisions［J］.Bioessays，1998，20(4)：298-306.

［2］ Paroush Z，F(xiàn)inley R L Jr，Kidd T，et al.Groucho is required for Drosophila neurogenesis，segmentation，and sex determination and interacts directly with hairy-related b-HLH proteins［J］.Cell，1994，79(5)：805-815.

［3］ 甄一松，王曉健，惠汝太.心肌肥厚和擴(kuò)張型心肌病中的Notch信號(hào)通路［J］.中國分子心臟病學(xué)雜志，2010，10 (6)：370-373.

［4］ Leimeister C，Bach A，Woolf A，et al.Screen for genes regulated during early kidney morphogenesis［J］.Dev.Genet，1999，24(3-4)：273-283.

［5］ Leimeister C，Externbrink A，Klamt B，et al.Hey genes：a novel subfamily of hairy and enhancer of split related genes specifically expressed during mouse embryogenesis［J］.Mech Dev，1999，85(1-2)：173-177.

［6］ 晉金蘭，莊漢屏.Notch信號(hào)通路與心血管發(fā)育的關(guān)系［J］.國際病理科學(xué)與臨床雜志，2008，28(3)：209-214.

［7］ 陳浩，徐志偉.Notch信號(hào)通路與心臟發(fā)育和組織再生［J］.上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2010，30(4)：463-466.

［8］ 梁佩，朱傳炳，吳秀山.Hey基因在心血管發(fā)育中的作用［J］.生命科學(xué)研究，2004，8(2)：24-28.

［9］ Kokubo H，Miyagawa-Tomita S，Tomimatsu H，et al.Targeted disruption of hesr2 results in atrioventricular valve anomalies that lead to heart dysfunction［J］.Circ Res，2004，95(5)：540-547.

［10］Armstrong E J，Bischoff J.Heart valve development：Endothelial cell signaling and differentiation［J］.Circ Res，2004，95(5)：459-470.

［11］Kokubo H，Miyagawa-Tomita S，Nakazawa M，et al.Mouse hesrl and hesr2 genes are redundantly required to mediate Notch signaling in the developing cardiovascular system［J］.Dev Baol，2005，278(2)：301-309.

［12］孔博，劉迎龍，呂小東.中國法樂四聯(lián)癥患兒HEY2基因突變篩查的初步研究［J］.中國分子心臟病學(xué)雜志，2008，8(1)：39-42.

［13］Donovan J，Kordylewska A，Jan Y，et al.Tetralogy of Fallot and other congenital heart defects in hey2 mutant mice［J］.Curr Biol，2002，12(18)：1605-1607.

［14］Gessler M，Knobeloch K P，Helisch A，et al.Mouse gridlock.No aortic coarctation or deficiency，but fatal cardiac defects in Hey2－/－mice［J］.Curr Biol，2002，12(18)：1601-1604.

［15］Sakata Y，Kamei C N，Nakagami H，et al.Ventricular septal defect and cardiomyopathy in mice lacking the transcription factor CHFI/Hey2［J］.Proc Natl Acad Sci，2002，99(25)：16197-16202.

［16］Sakata Y，Xiang F，Chen Z，et al.Transcription factor CHF1/Hey2 regulates neointimal formation in vivo and vascular smooth muscle proliferation and migration in vitro［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2004，24(11)：2069-2074.

［17］Zhong T P，Rosenberg M.Mohideen M，et al.Gridlock，an HLH gene required for assembly of the aorta in zebrafish［J］.Science，2000，287(5459)：1820-1824.

［18］楊陽，易定華.Notch信號(hào)通路參與心肌缺血/再灌注損傷及保護(hù)的研究［D］.西安，第四軍醫(yī)大學(xué)，2011.

［19］Loomes K M，Taichman D B，Glover C L，et al.Characterization of Notch receptor expression in the developing mammalian heart and liver［J］.Am J Med Genet，2002，112 (2)：181-189.

［20］秦亞錄，范忠才.Notch信號(hào)通路與心臟發(fā)育的關(guān)系［J］.西南軍醫(yī)，2011，13(1)：98-101.

［21］Fischer A，Gessler M.Hey genes in cardiovascular development［J］.Trends Cardiovasc Med，2003，13(6)：221-226.

［22］Fischer A，Klamt B，Schumacher N.Phenotypic variability in Hey2－/－mice and absence of HEY2 mutations in patients with congenital heart defects or Alagille syndrome［J］.Mamm Genome，2004，15(9)：711-716.

［23］Xin M，Small E M，van Rooij E，et al.Essential roles of the bHLH transcription factor Hrt2 in repression of atrial gene expression and maintenance of postnatal cardiac function［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2007，104(19)：7975-7980.

［24］Croquelois A，Domenighetti A A，Nemir M，et al.Control of the adaptive response of the heart to stress via the Notch1 receptor pathway［J］.J Exp Med，2008，205(13)：3173-3185.