賈艷艷，鹿成濤，宋 穎，丁莉坤，楊 靜，陳敏純，李雪晴，宋 薇，周 倫，馮智軍，文愛(ài)東

（中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，陜西 西安710032）

HPLC-MS/MS聯(lián)用技術(shù)定量測(cè)定人血漿中伊伐布雷定及其代謝產(chǎn)物

賈艷艷，鹿成濤，宋 穎，丁莉坤，楊 靜，陳敏純，李雪晴，宋 薇，周 倫，馮智軍，文愛(ài)東

（中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，陜西 西安710032）

為了定量測(cè)定人血漿中伊伐布雷定和去甲伊伐布雷定濃度，建立了HPLC-MS/MS聯(lián)用方法以地西泮為內(nèi)標(biāo)，V（甲醇）∶V水（5mM醋酸銨＋1%甲酸）＝80∶20的混合溶液為流動(dòng)相，Diamosil C18（150mm×4.6mm，5μm）色譜柱為分析柱，通過(guò)電噴霧離子源（ESI），以正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）方式檢測(cè)。用于定量分析的離子對(duì)分別為m/z469.2→177.1（伊伐布雷定），m/z455.2→177.1（去甲伊伐布雷定），m/z285.1→193.1（地西泮）。伊伐布雷定的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為0.101 3～101.3μg/L，定量下限為0.101 3μg/L；去甲伊伐布雷定的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為0.085～25.5μg/L，定量下限為0.085μg/L。日內(nèi)、日間精密度的RSD＜15%，平均回收率＞75%。

伊伐布雷定；去甲伊伐布雷定；高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜；血漿藥物濃度

鹽酸伊伐布雷定是一種減緩心率藥，起到減緩竇房結(jié)起搏點(diǎn)活動(dòng)速度的作用，用于治療慢性穩(wěn)定型心絞痛。伊伐布雷定常見(jiàn)的不良反應(yīng)為心動(dòng)過(guò)緩、房室傳導(dǎo)1度阻滯、室性期外收縮、頭痛、眩暈和視力模糊與其劑量存在依賴性［1－2］。伊伐布雷定在體內(nèi)經(jīng)肝藥酶代謝成去甲伊伐布雷定，從而發(fā)揮減慢心率的作用，是臨床常用的藥物［3－5］，但目前國(guó)內(nèi)暫無(wú)伊伐布雷定及其代謝產(chǎn)物體內(nèi)定量檢測(cè)方法的研究報(bào)道。本試驗(yàn)建立了伊伐布雷定及其代謝產(chǎn)物在人血漿中定量檢測(cè)的方法，并用于人體藥動(dòng)學(xué)研究。

1 試驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與裝置

6410型高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國(guó)Agilent公司產(chǎn)品，其中安捷倫1200高效液相色譜系統(tǒng)包括二元輸液泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱，串聯(lián)質(zhì)譜儀為Agilent 6410型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，包含電噴霧離子化源以及串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜檢測(cè)器；色譜工作站：MassHunter數(shù)據(jù)處理軟件，美國(guó)Agilent公司產(chǎn)品；FA1004電子天平：上海恒平科學(xué)儀器公司產(chǎn)品；Milli-Q Plus純水器：美國(guó)密理博中國(guó)有限公司產(chǎn)品；XW-80A微型旋渦混合儀：上海滬西分析儀器有限公司產(chǎn)品；TGL 16G臺(tái)式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品；KS康氏振蕩器：江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司產(chǎn)品。

1.2 主要試劑

鹽酸伊伐布雷定對(duì)照品（含量99.13%，批號(hào)：YF-D01），鹽酸去甲伊伐布雷定對(duì)照品（含量99.13%，批號(hào)：091007）：由常州四藥制藥有限公司提供；地西泮對(duì)照品（內(nèi)標(biāo)，批號(hào)：100294-200602）：由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供；甲醇，磷酸（色譜純）：美國(guó)Fisher公司產(chǎn)品；水：自制純化水；空白血漿：由第四軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供；實(shí)驗(yàn)用水為去離子水，實(shí)驗(yàn)室自制。

1.3 HPLC-MS/MS分析條件

1.3.1 色譜條件 色譜柱：迪馬公司DIAMOSIL C18（150mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：V（甲醇）∶V 水（5mmol/L醋酸銨＋0.1%甲酸）＝80∶20的混合溶液；流速0.6mL/min；柱溫40℃；進(jìn)樣量5μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子化源（ESI源），正離子模式檢測(cè)，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）方式，毛細(xì)管電壓4 000V，駐留時(shí)間150ms，干燥氣溫度325℃，干燥氣流速12L/min，霧化氣壓力345kPa。以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)的質(zhì)譜掃描方式分析，測(cè)定伊伐布雷定，用于定量分析的離子對(duì)m/z 469.2→177.1，碰撞電壓25eV，裂解電壓140 V；去甲伊伐布雷定，用于定量分析的離子對(duì)m/z455.2→177.1，碰撞電壓23eV，裂解電壓140 V；地西泮（內(nèi)標(biāo)），用于定量分析的離子對(duì)m/z 285.1→193.1，碰撞電壓32eV，裂解電壓150 V，所得的質(zhì)譜圖示于圖1。

1.4 試驗(yàn)步驟

1.4.1 血漿樣品的處理 精密量取1mL血漿樣品于10mL玻璃離心管中，加入50μL內(nèi)標(biāo)溶液（2mg/L地西泮溶液），旋渦30s后混勻，加入4mL乙酸乙酯，渦漩3min，以4 000r/min離心10min。吸取有機(jī)層，在30℃水浴中以氮?dú)饬鞔蹈?，殘?jiān)?00μL流動(dòng)相復(fù)溶，以16 000 r/min離心8min，吸取上清液轉(zhuǎn)移至自動(dòng)進(jìn)樣器樣品管中，進(jìn)樣量5μL，進(jìn)行 LC-MS/MS分析。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)控樣品的制備 精密稱量11.01mg鹽酸伊伐布雷定標(biāo)準(zhǔn)品 （含10.13mg伊伐布雷定標(biāo)準(zhǔn)品），置于10mL棕色容量瓶中，用甲醇定容，得伊伐布雷定濃度為1.013 g/L，作為儲(chǔ)備液備用，然后用空白血漿依次稀釋配制 成 濃 度 為 0.101 3、0.303 9、1.013、3.039、10.13、30.39、101.3μg/L的標(biāo)準(zhǔn)含藥血漿。按照1.4.1方法進(jìn)行處理并測(cè)定。同樣步驟再次配制濃度為0.202 6、5.065、75.975μg/L的質(zhì)控樣品。

圖1 伊伐布雷定、去甲伊伐布雷定及內(nèi)標(biāo)地西泮質(zhì)譜圖Fig.1 Mass spectrum of ivabradine，N-desmethylivabradine and Diazepam（IS）

精密稱取4.63mg鹽酸去甲伊伐布雷定標(biāo)準(zhǔn)品 （內(nèi)含4.25mg去甲伊伐布雷定），置于10 mL容量瓶中，加入甲醇稀釋至10mL，溶解搖勻，即得0.425g/L伊伐布雷定的儲(chǔ)備液，然后用空白血漿依次稀釋配制成濃度為0.085、0.255、0.85、2.55、8.5、17、25.5μg/L 的標(biāo)準(zhǔn)含藥血漿。按照1.4.1方法進(jìn)行處理并測(cè)定。同樣步驟再次配制濃度為0.17、2.55、12.75μg/L的質(zhì)控樣品。

1.4.3 穩(wěn)定性考察 在不同的試驗(yàn)條件下對(duì)質(zhì)控樣品進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)（n＝3）：1）質(zhì)控樣品在－80℃冰箱中完全冷凍后取出，在室溫環(huán)境下解凍，然后再次放入冰箱，如此反復(fù)3次后制備并測(cè)定；2）質(zhì)控樣品在室溫下放置4h后制備并測(cè)定；3）質(zhì)控樣品在－80℃下避光保存，1個(gè)月后制備并測(cè)定；4）質(zhì)控樣品在進(jìn)樣器放置4h后制備并測(cè)定。

2 方法與結(jié)果

2.1 特異性考察

分別取6個(gè)不同受試者的1mL空白血漿，除不加入內(nèi)標(biāo)溶液外，其余按血漿樣品分析方法處理，進(jìn)樣5μL，獲得空白樣品的色譜圖，示于圖2a；將一定濃度的伊伐布雷定標(biāo)準(zhǔn)溶液、去甲伊伐布雷定標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)地西泮溶液加入空白血漿中，用相同的方法進(jìn)行樣品處理，獲得相應(yīng)的色譜圖，示于圖2b；受試者服藥5mg伊伐布雷定片0.5h后的色譜圖示于圖2c。結(jié)果表明，空白血漿中的內(nèi)源性雜質(zhì)并未干擾伊伐布雷定、去甲伊伐布雷定和內(nèi)標(biāo)的測(cè)定。

圖2 血漿中伊伐布雷定、去甲伊伐布雷定、地西泮的典型多反應(yīng)監(jiān)色譜圖Fig.2 Representative chromatograms for ivabradine，N-desmethylivabradine，and IS.

2.2 基質(zhì)效應(yīng)考察

分別用甲醇配制相當(dāng)于血漿濃度0.202 6、5.065、75.975μg/L的伊伐布雷定樣品各1 mL，相當(dāng)于血漿濃度0.17、2.55、12.75μg/L的去甲伊伐布雷定樣品各1mL，加入50μL內(nèi)標(biāo)，每種濃度各做10份，以氮?dú)獯蹈?。其?份樣品以200μL流動(dòng)相復(fù)溶，另外5份以空白血漿提取液復(fù)溶，以16 000r/min離心8min，移取上清液至自動(dòng)進(jìn)樣瓶，進(jìn)樣分析，流動(dòng)相復(fù)溶峰面積比值平均值記為fR，空白血漿提取液復(fù)溶樣品峰面積記為fs，按下式計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)（RE），RE＝（fs/fR）×100%。結(jié)果顯示：伊伐布雷定高、中、低3個(gè)濃度的基質(zhì)效應(yīng)分別為2.8%、2.1%、3.7%，去甲伊伐布雷定高、中、低3個(gè)濃度的基質(zhì)效應(yīng)分別為2.5%、1.7%、6.3%，RSD均小于15%，可認(rèn)為沒(méi)有基質(zhì)效應(yīng)干擾。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍

以待測(cè)化合物和內(nèi)標(biāo)峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，權(quán)重系數(shù)1/x，進(jìn)行線性回歸計(jì)算，得到伊伐布雷定標(biāo)準(zhǔn)曲線：f＝0.003 848＋0.057 28C，線性相關(guān)系數(shù)r為0.998；去甲伊伐布雷定標(biāo)準(zhǔn)曲線：f＝0.001 061＋0.019 807C，線性相關(guān)系數(shù)r為0.999，而且各點(diǎn)標(biāo)示濃度和計(jì)算濃度的偏差都在±15μg/L以內(nèi)（最低定量限為±20μg/L）。伊伐布雷定的最低定量（LLOQ）濃度為0.101 3μg/L，其日內(nèi)精密度RSD為10.8%，日間精密度RSD為5.4%；去甲伊伐布雷定的最低定量濃度為0.085μg/L，其日內(nèi)精密度RSD為8.4%，日間精密度RSD為4.7%，符合要求。

2.4 精密度和準(zhǔn)確度

方法學(xué)考核伊伐布雷定濃度為0.202 6、5.065、75.975μg/L的質(zhì)控樣品（n＝6），去甲伊伐布雷定濃度為0.17、2.55、12.75μg/L的質(zhì)控樣品（n＝6），考核批次為3次，結(jié)果列于表1。結(jié)果表明，此方法的精密度和準(zhǔn)確度偏差均在±15%以內(nèi)。

2.5 穩(wěn)定性

分別在－80℃反復(fù)凍融3次、血漿室溫放置4h、－80℃下凍存3個(gè)月、進(jìn)樣器放置4h（n＝3），4種條件下考察方法的穩(wěn)定性，結(jié)果列于表2。結(jié)果表明，伊伐布雷定及去甲伊伐布雷定在這4種條件下的穩(wěn)定性良好。

表1 伊伐布雷定和去甲伊伐布雷定的回收率和精密度Table 1 Precision and recovery of ivabradine and N-desmethylivabradine

表2 伊伐布雷定和去甲伊伐布雷定的穩(wěn)定性Table 2 Stability of ivabradine and N-desmethylivabradine

2.6 提取回收率試驗(yàn)

取10mL玻璃離心管數(shù)支，分別加入不同量的伊伐布雷定和去甲伊伐布雷定標(biāo)準(zhǔn)溶液，以氮?dú)饬鞔蹈?，加?.5mL空白血漿提取液，配制成含0.202 6、5.065、75.975μg/L伊伐布雷定血漿樣品及含0.17、2.55、12.75μg/L去甲伊伐布雷定血漿樣品，渦漩混勻后，按1.4.1處理，記錄色譜圖，計(jì)算峰面積比值fi（fi＝As/Ai）。并計(jì)算每種濃度的平均值。

取10mL玻璃離心管數(shù)支，配成含0.202 6、5.065、75.975μg/L的含伊伐布雷定血漿標(biāo)準(zhǔn)樣品及含0.17、2.55、12.75μg/L的去甲伊伐布雷定血漿標(biāo)準(zhǔn)樣品，每種濃度各做5份，除不加內(nèi)標(biāo)外，按1.4操作，取上清液2.5mL，加入50μL內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)液，渦漩后，于35℃水浴中以氮?dú)饬鞔蹈?，?00μL流動(dòng)相復(fù)溶，以16 000 r/min離心3min，移取上清液至自動(dòng)進(jìn)樣器，5 μL進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，計(jì)算峰面積比值fs（fs＝As/Ai）。將上述fs和的比值代入下式，即可求得伊伐布雷定的絕對(duì)回收率（R%），R%結(jié)果列于表3。

表3 伊伐布雷定、去甲伊伐布雷定的提取回收率Table 3 Recovery of ivabradine andN-desmethylivabradine

2.7 方法應(yīng)用

應(yīng)用本方法測(cè)定10名中國(guó)成年健康志愿者單劑量口服5mg鹽酸伊伐布雷定后，不同時(shí)間血漿中伊伐布雷定和去甲伊伐布雷定的濃度，并計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，其平均血藥濃度－時(shí)間曲線示于圖3。藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)結(jié)果為：伊伐布雷定t1/2：（5.18±1.20）h，AUC（0－48）：（169.56±33.15）（μg·h）/L，Cmax：（35.88±8.88）μg/L，tmax：（1.08±0.53）h；代謝產(chǎn)物去甲伊伐布雷定t1/2：（9.91±1.24）h，AUC（0－48）（23.87±9.43）（μg·h）/L，Cmax為（3.11±1.62）μg/L，tmax：（1.30±0.26）h。

圖3 健康志愿者口服5mg伊伐布雷定片后的平均血藥濃度－時(shí)間曲線Fig.3 Mean plasma concentration-time profiles of ivabradine and N-desmethylivabradine after single oral dose of 5mg ivabradine hydrochloride tablets

3 討論

目前國(guó)際上有3篇關(guān)于伊伐布雷定及去甲伊伐布雷定檢測(cè)方法研究報(bào)道，其中1篇為熒光檢 測(cè) 法［6］，2 篇 為 質(zhì) 譜 聯(lián) 用 法［7－8］。 但 鑒 于 伊 伐布雷定及去甲伊伐布雷定的檢測(cè)下限較低，采用質(zhì)譜聯(lián)用法較為妥當(dāng)，但上述2篇研究報(bào)道均采用固相萃取處理方法，成本較高，不適用于大批樣品的預(yù)處理。針對(duì)上述情況，本試驗(yàn)建立了液液萃取的樣品預(yù)處理方法，成本低廉、重現(xiàn)性高、易于操作，且血漿中的雜質(zhì)不干擾樣品的測(cè)定。伊伐布雷定的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為0.101 3～101.3μg/L，去甲伊伐布雷定的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為0.085～25.5μg/L，線性關(guān)系良好；伊伐布雷定、去甲伊伐布雷定的高、中、低3個(gè)濃度的批內(nèi)和批間精密度均小于15%；相對(duì)回收率在98.7～108.2%之間；伊伐布雷定、去甲伊伐布雷定血漿樣品室溫放置4h，－80℃下反復(fù)凍融3次，－80℃下凍存3個(gè)月及檢測(cè)樣品進(jìn)樣器放置4h條件下的穩(wěn)定性良好，符合生物樣品分析要求。此外，目前國(guó)際上有2篇關(guān)于伊伐布雷定與其他藥物相互作用的文章［9－10］，報(bào)道了肝藥酶誘導(dǎo)劑卡馬西平可提高伊伐布雷定的生物利用度高近80%，但主經(jīng)肝藥酶CYP3A4和CYP2C19代謝的奧美拉唑并不影響伊伐布雷定代謝，兩者之間不存在任何相互作用，上述研究均提示在臨床應(yīng)用過(guò)程中需注意伊伐布雷定的應(yīng)用，避免因藥物相互作用而出現(xiàn)不良反應(yīng)。

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Quantitative Determination of Ivabradine and N-Desmethylivabradine in Human Plasma by HPLC-MS/MS

JIA Yan-yan，LU Cheng-tao，SONG Ying，DING Li-kun，YANG Jing，CHEN Min-chun，LI Xue-qin，SONG Wei，ZHOU Lun，F(xiàn)ENG Zhi-jun，WEN Ai-dong
（Department of Pharmacy，the First Affiliated Hospital of Fourth Military Medical University of PLA，Xi’an710032，China）

Ivabradine and N-desmethylivabradine in human plasma was determined by high performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry （HPLC-MS/MS）.Diazepam was used as internal standard.Ivabradine and N-desmethylivabradine was separated on a Diamosil C18column（150mm×4.6mm×5μm）.Electrospray ionization（ESI）source was applied，and multiple reaction monitoring（MRM）mode was operated in the positive mode with the monitor ions at m/z469.2→177.1for ivabradine，m/z455.2→177.1for N-desmethylivabradine and m/z285.1→193.1for the interna1standard，respectively.The linear calibration curve are obtained over the concentration range of 0.101 3—101.3μg/L for ivabradine and 0.085—25.5μg/L for N-desmethylivabradine.The limit of quantitation are 0.101 3μg/L and 0.085μg/L for ivabradine and N-desmethylivabradine，respectively.The inter-day and intra-day precision（RSD）is less than 15%.The average recoveries are above 75%.

ivabradine；N-desmethylivabradine；high performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry（HPLC-MS/MS）；plasma concentration

O 657.63

A

1004-2997（2012）03-0081-06

2011-10-05；

2011-12-14

賈艷艷（1981～），女（漢），河北遵化人，主管藥師，從事臨床藥理學(xué)研究。E-mail：jiayanyan-2004＠hotmail.com。

文愛(ài)東（1965～），男（漢），陜西西安人，主任藥師，從事臨床藥理學(xué)研究。E-mail：adwen-2004＠hotmail.com