張耀超

(西安醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)系，陜西西安710021)

變異鏈球菌(Streptococcus mutans，Sm，以下簡稱變鏈菌)是G+性微需氧菌，可使碳水化合物分解產(chǎn)酸而導(dǎo)致牙齒無機(jī)質(zhì)脫礦，并與牙菌斑生物被膜的形成密切相關(guān)。因此，變鏈菌在人類口腔微生物環(huán)境中占有重要的生態(tài)地位，是最重要的致齲菌［1］。在自然條件下，絕大多數(shù)微生物粘附在一個(gè)表面上，以生物被膜(biofilm)的形式生存。牙菌斑就是一種典型的生物被膜，是齲病和牙周病發(fā)生的始動因子。生物被膜中的種群基因表達(dá)的調(diào)節(jié)與浮游細(xì)菌不同，細(xì)菌必須協(xié)調(diào)大量基因的表達(dá)以形成穩(wěn)定的生物被膜［2］。LuxS基因在G－和G+細(xì)菌中都高度保守，由約450～550個(gè)堿基對組成。變鏈菌基因圖譜中LuxS基因編碼160個(gè)氨基酸的LuxS蛋白，LuxS蛋白是一種合成酶，能合成LuxS系統(tǒng)的信號分子即AI－2信號分子［3］。LuxS編碼的AI－2信號參與牙菌斑內(nèi)細(xì)菌間的信息交流，并利用群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控特定的生理功能［4］。本研究在前期成功構(gòu)建變鏈菌LuxS基因缺失突變株的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步觀察LuxS基因缺失對變異鏈球菌生長特點(diǎn)和生物被膜形成能力的影響。

1 材料和方法

1.1 主要材料和設(shè)備

變異鏈球菌UA159標(biāo)準(zhǔn)株(四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)中心);變鏈菌LuxS基因突變株(本實(shí)驗(yàn)室成功構(gòu)建并保存);TSA固體培養(yǎng)基、TSA－Cmr固體培養(yǎng)基(含10 μg/mL氯霉素)、BHI液體培養(yǎng)基(北京陸橋生物制品公司);BHI固體培養(yǎng)基(含有25 μg/mL氯霉素的BHI瓊脂用以選擇性培養(yǎng)突變株);氯霉素粉劑(中國藥品生物制品檢定所標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)品);結(jié)晶紫溶液(天津金章科技發(fā)展有限公司);光學(xué)顯微鏡(Olympus，日本);R200電子天平(德國);標(biāo)準(zhǔn)24孔微量板(Costar 3524，Corning Inc.);直徑為12 mm圓形蓋玻片(江蘇鹽城恒泰玻璃儀器廠);微量加樣器 (Eppendorf公司，德國);紫外分光光度計(jì)(BECKMAN，美國)。

1.2 變鏈菌標(biāo)準(zhǔn)株和LuxS突變株生長特性觀察

1.2.1 兩菌株在不同培養(yǎng)基中生長情況和鑒定

?。?0℃凍存的變鏈菌 UA159標(biāo)準(zhǔn)株和LuxS突變株，常規(guī)復(fù)蘇后分別接種于TSA固體培養(yǎng)基和 TSA－Cmr固體培養(yǎng)基中，37℃厭氧(800 mL/L N2、100 mL/L H2、100 mL/L CO2)條件下培養(yǎng)48 h后，觀察兩菌株在兩種培養(yǎng)基中的菌落生長情況。同時(shí)挑取單個(gè)菌落分別進(jìn)行常規(guī)生化鑒定和革蘭染色涂片鑒定。

1.2.2 兩菌株生長曲線觀察

將常規(guī)復(fù)蘇24 h的變鏈菌UA159標(biāo)準(zhǔn)株和LuxS突變株分別接種于BHI瓊脂培養(yǎng)基，37℃厭氧(800 mL/L N2，100 mL/L H2，100 mL/L CO2)條件下培養(yǎng)48 h，分別挑取兩菌株單菌落轉(zhuǎn)種于BHI液體培養(yǎng)基增菌，37℃厭氧條件下培養(yǎng)過夜。涂片檢查為純培養(yǎng)后充分混勻，于紫外分光光度計(jì)600 nm處制備成吸光度A=1.0的菌懸液備用。將上述菌懸液1 000倍稀釋接種于BHI液體培養(yǎng)基，置37℃恒溫?fù)u床中孵育，定時(shí)取樣測量A值，每次每個(gè)菌種測3份取均值，以不接種細(xì)菌的BHI液體培養(yǎng)基作陰性對照組。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 變鏈菌UA159標(biāo)準(zhǔn)株和LuxS突變株生物被膜形成能力的觀察

根據(jù)Loo等［5］的方法并加以修改，建立變鏈菌LuxS基因突變株和標(biāo)準(zhǔn)株生物被膜，并染色觀察。先在標(biāo)準(zhǔn)24孔微量板中放入直徑12 mm的蓋玻片，再將復(fù)蘇24 h的兩菌株的菌懸液調(diào)節(jié)濃度至A600=0.1后，各取500 μL滴至蓋玻片表面，同時(shí)向孔中加入1 mL BHI液體培養(yǎng)基，另在空白蓋玻片滴加等量BHI培養(yǎng)液作為陰性對照組。上述每組復(fù)3孔，分別于37℃厭氧條件(800 mL/L N2，100 mL/L H2，100 mL/L CO2)條件下培養(yǎng)48 h后，取出24孔板，微量吸液器吸棄孔內(nèi)菌懸液，用PBS緩沖液輕輕沖洗以去除表面未粘附的細(xì)菌，室溫下自然干燥20 min，肉眼觀察玻片上生物膜形成情況。然后每孔加入10 g/L結(jié)晶紫溶液200 μL，室溫下放置20 min后吸棄染色液，用PBS緩沖液輕輕沖洗掉玻片表面的染色液和浮游菌，自然干燥30 min，光學(xué)顯微鏡下分別觀察標(biāo)準(zhǔn)株和突變株生物被膜形成情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組間計(jì)量資料(±s)比較用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 變鏈菌UA159標(biāo)準(zhǔn)株與LuxS突變株生長特性比較

2.1.1兩菌株在不同培養(yǎng)基中的生長情況和鑒定結(jié)果

在含10 μg/mL氯霉素的TSA－Cmr固體培養(yǎng)基中，標(biāo)準(zhǔn)株基本不能生長，而突變株的生長狀況基本正常。在TSA固體培養(yǎng)基中，兩菌株均生長正常，且在菌落形態(tài)學(xué)上沒有明顯的表型差別，菌落均為乳白色、呈細(xì)小而光滑的隆起狀，且邊緣整齊。經(jīng)常規(guī)生化鑒定，兩菌株均為血清C型(表1)。

涂片、革蘭染色后光學(xué)顯微鏡下觀察，兩菌株均為革蘭染色陽性，但形態(tài)上存在一定的差異:標(biāo)準(zhǔn)株菌體呈長鏈狀排列而且相互纏繞，局部甚至呈小的團(tuán)塊狀，為典型的變鏈菌形態(tài)(圖1);而LuxS突變株菌體多數(shù)呈短鏈狀排列，形成長鏈的較少，甚至可以見到不少游離的單個(gè)菌體(圖2)。

2.1.2兩菌株生長曲線的比較

以A值為縱座標(biāo)，時(shí)間為橫座標(biāo)繪制兩菌株生長曲線可見，兩種菌株在生長模式上基本一致，均呈典型的“S”曲線，只是在進(jìn)入生長穩(wěn)定期(11.5～22.5 h)后，兩者在細(xì)菌飽和度上有一定的差異，即:11.5 h之前各時(shí)間點(diǎn)兩菌株的A值均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);而自11.5 h起至22.5 h內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)，LuxS突變株的A值均低于標(biāo)準(zhǔn)株，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(表2，圖3)。

2.2 變鏈菌UA159標(biāo)準(zhǔn)株與LuxS突變株生物被膜形成能力的比較

培養(yǎng)48 h后肉眼觀察，標(biāo)準(zhǔn)株和突變株均能在玻片上形成生物被膜，而陰性對照組未見生物被膜形成。其中標(biāo)準(zhǔn)株的生物膜光滑而完整，且分布均勻，呈乳白色;突變株的生物被膜形態(tài)則較標(biāo)準(zhǔn)株粗糙、薄且分布不均勻、大部分形成較大的團(tuán)塊(圖4)。當(dāng)PBS輕輕沖洗蓋玻片時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)株生物被膜與玻片表面結(jié)合的較牢固，基本上不受沖洗的影響;突變株被膜內(nèi)的部分細(xì)胞較易脫落，會重新懸浮到?jīng)_洗液中。

經(jīng)結(jié)晶紫染色后光學(xué)顯微鏡觀察，標(biāo)準(zhǔn)株呈完整片狀，幾乎較均勻的粘附于玻片表面，并且有一定的厚度;而LuxS突變株形成的被膜量少且薄，被膜團(tuán)塊間有較大的間隙，呈散在的篩孔狀分布(圖5)。

表1 變鏈菌UA159標(biāo)準(zhǔn)株和LuxS突變株形態(tài)和生化鑒定結(jié)果

圖1 標(biāo)準(zhǔn)株(革蘭染色×1 000)

圖2 突變株(革蘭染色×1 000)

表2 24 h內(nèi)變鏈菌LuxS突變株與標(biāo)準(zhǔn)株生長情況比較 (A值，n=9，±s)

表2 24 h內(nèi)變鏈菌LuxS突變株與標(biāo)準(zhǔn)株生長情況比較 (A值，n=9，±s)

*與標(biāo)準(zhǔn)株相比P＜0.05

時(shí)間(h)標(biāo)準(zhǔn)株 突變株0.5 0.018±0.014 0.018±0.020 1.5 0.079±0.024 0.079±0.018 2.5 0.146±0.071 0.143±0.021 3.5 0.247±0.082 0.242±0.032 4.5 0.301±0.079 0.302±0.043 5.5 0.343±0.095 0.343±0.051 6.5 0.394±0.098 0.390±0.057 7.5 0.489±0.083 0.481±0.069 8.5 0.746±0.102 0.703±0.095 9.5 1.258±0.191 1.229±0.107 10.5 2.253±0.304 2.059±0.313 11.5 2.558±0.373 2.272±0.304* 12.5 2.901±0.411 2.457±0.351*………21.5 2.663±0.394 2.399±0.394* 22.5 2.599±0.371 2.369±0.313* 23.5 2.342±0.322 2.217±0.336

圖4 變鏈菌標(biāo)準(zhǔn)株和突變株生物膜肉眼觀察

圖5 標(biāo)準(zhǔn)株和突變株生物膜結(jié)晶紫染色后的鏡下觀察(×40)

3 討論

變鏈菌是最重要的致齲菌，長期以來一直是國內(nèi)外齲病防治研究的熱點(diǎn)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，為了更好地研究某個(gè)與齲病相關(guān)的酶或基因，通常采用生物學(xué)手段突變該基因，構(gòu)建出基因突變株［6］，以期分析該基因在致病方面的作用［7－8］。

目前研究發(fā)現(xiàn):在微生物界存在著兩種群體感應(yīng)調(diào)控系統(tǒng)，一種是具有嚴(yán)格種屬特異性的種內(nèi)群體感應(yīng)調(diào)控系統(tǒng)［9－10］，另一種是從哈氏弧菌(Vibrio harveyi)研究中發(fā)現(xiàn)了特異性的種間群體感應(yīng)調(diào)控系統(tǒng)，即LuxS系統(tǒng)［11］，存在于多種擁有特征性LuxS基因的細(xì)菌菌群當(dāng)中。由于LuxS基因在不同菌屬中均高度保守，并已陸續(xù)發(fā)現(xiàn)超過40種致病生物膜構(gòu)成菌能表達(dá)同源的LuxS蛋白，并且合成參與哈氏弧菌LuxS調(diào)控的自體誘導(dǎo)物(autoinducer，AI)信號分子，因此推測該系統(tǒng)可能具有種屬間的調(diào)控作用。在G+和G－細(xì)菌中存在一個(gè)共同的信號分子為呋喃酰硼酸二酯 (furanosylborate diester)，即AI－2信號分子，它可以在細(xì)菌菌群間的相互作用中作為一種普遍密度感應(yīng)信號而發(fā)揮功能，LuxS基因就是合成該信號分子的標(biāo)志性基因。依賴于LuxS的信號系統(tǒng)被認(rèn)為是一種種屬間感應(yīng)群體系統(tǒng)，在許多種類細(xì)菌的重要生理功能和毒性的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用［12］。

有研究顯示:細(xì)菌生物被膜并不是細(xì)菌菌體隨機(jī)粘連的結(jié)果，而是細(xì)菌群落相互合作分化成良好結(jié)構(gòu)的結(jié)果。生物被膜的生成有賴于幾個(gè)步驟，即從最初粘附到完全成熟再到成型，從浮游生物到生物被膜生成的轉(zhuǎn)變需要繁瑣的代謝作用和生理學(xué)變化，其中存在一些促進(jìn)這一過程的基因調(diào)節(jié)子。而群體感應(yīng)系統(tǒng)作為一種基因調(diào)節(jié)系統(tǒng)被發(fā)現(xiàn)涉及細(xì)菌生物被膜的生成。

本課題組在先前的實(shí)驗(yàn)中采用同源重組法構(gòu)建了LuxS基因缺失的變鏈菌突變株:先用PCR方法擴(kuò)增LuxS基因兩端區(qū)域目的基因片段，運(yùn)用基因重組的方法將氯霉素抗性基因連接到上下游兩片段之間，并共同構(gòu)建到PUC19載體的多克隆位點(diǎn)中，構(gòu)建出帶氯霉素抗性標(biāo)志的LuxS基因缺失突變的pUCluxKO載體;再用電穿孔技術(shù)對變鏈菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化，將突變載體pUCluxKO轉(zhuǎn)化進(jìn)入變鏈菌標(biāo)準(zhǔn)株菌體，突變載體與標(biāo)準(zhǔn)株染色體之間發(fā)生同源重組，使氯霉素抗性基因置換標(biāo)準(zhǔn)株的LuxS基因，隨后因突變載體不能在S.mutans菌體內(nèi)生長復(fù)制而丟失，從而得到LuxS基因缺失的突變株MS△LuxS。為了進(jìn)一步了解LuxS基因缺失對變鏈菌生物學(xué)性狀的影響，本研究通過常規(guī)生化鑒定、革蘭染色涂片鑒定以及生長曲線測定和體外生物膜模型的建立，以期觀察變鏈菌標(biāo)準(zhǔn)株與LuxS突變株在生物學(xué)性狀方面的異同。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:標(biāo)準(zhǔn)株在高濃度氯霉素存在的環(huán)境下生長受到了明顯抑制，甚至?xí)粶缁?而突變株中因含有氯霉素抗性基因片段，因此能在含氯霉素的培養(yǎng)基中正常生長。在不含有氯霉素的TSA固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后，兩菌株均能正常生長，且在菌落形態(tài)學(xué)上沒有明顯的表型差異，菌落均為乳白色、呈細(xì)小而光滑的隆起狀且邊緣整齊。這說明LuxS基因突變后并不會導(dǎo)致變鏈菌較嚴(yán)重的生長缺陷，提示AI－2分子的生成并不是基本代謝過程中所必需的條件［13］。LuxS基因突變后，變鏈菌的生長模式或基本營養(yǎng)素需要量也并沒有發(fā)生顯著的變化［14］。常規(guī)生化鑒定顯示兩種菌株均為血清C型;涂片、革蘭染色后觀察，兩菌株均為革蘭染色陽性，但形態(tài)有差別:標(biāo)準(zhǔn)株的菌體呈長鏈狀排列且相互纏繞，局部呈團(tuán)塊狀，為典型的變鏈菌形態(tài)，而突變株菌體多呈短鏈狀排列，形成長鏈的比較少，甚至能見到不少游離的單個(gè)菌體。這可能是因?yàn)長uxS基因突變后變鏈菌依賴于該基因的群體感應(yīng)調(diào)節(jié)機(jī)制有了缺陷，在一定程度上影響了菌群間信號分子的傳遞，從而對菌群的生長方式產(chǎn)生了影響［15］。生長曲線比較發(fā)現(xiàn):兩菌株的生長模式基本相同，只是在進(jìn)入生長穩(wěn)定期后，標(biāo)準(zhǔn)株的細(xì)菌飽和度(A值)明顯高于LuxS突變株，提示LuxS基因突變可一定程度上抑制變鏈菌的生長。生物被膜形成情況觀察顯示:兩菌株均能在玻片上形成肉眼可見的生物被膜，但標(biāo)準(zhǔn)株形成的生物膜相對光滑、比較完整且分布均勻，而突變株的生物膜較為粗糙、分布不均勻、有較大的分散狀團(tuán)塊。另外，標(biāo)準(zhǔn)株的生物被膜與玻片表面結(jié)合的較牢固，基本不受沖洗的影響，而突變株生物膜內(nèi)的一部分細(xì)胞易脫落，僅少量細(xì)胞粘附在玻片上。結(jié)晶紫染色后顯微鏡觀察，標(biāo)準(zhǔn)株生物膜呈一定厚度的完整片狀，幾乎鋪滿玻片表面，而突變株的被膜量少而薄，有分布不均勻的團(tuán)塊，呈散在的篩孔狀分布。說明LuxS基因介導(dǎo)的種間群體感應(yīng)系統(tǒng)在變鏈菌生物被膜形成中發(fā)揮了重要作用，但其確切的機(jī)制還有待于進(jìn)一步探討。

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