韓倩倩 王春仁 戴建武 魯葵 岳瑞齊 黃經(jīng)春

1 中國食品藥品檢定研究院（北京100050）

2 中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所（北京100190）

3 國家食品藥品監(jiān)督管理局濟(jì)南醫(yī)療器械監(jiān)督檢驗(yàn)中心（濟(jì)南 250101）

1.功能生物材料概述

1.1 生物材料

生物材料通常指以醫(yī)療為目的，單獨(dú)或與藥物一起，用于組織或器官的治療或替代以修復(fù)受損組織的材料。使用生物材料的目的是為組織細(xì)胞生長提供三維支架，在對損傷部位進(jìn)行填充、替換的同時，促進(jìn)細(xì)胞的粘附、增殖乃至分化，所以除了符合一般生物醫(yī)學(xué)材料的要求外，理想的生物材料還需滿足以下要求：（1）良好的生物相容性；（2）可降解性及合適的降解速率；（3）合適的孔徑結(jié)構(gòu)；（4）合適的表面理化性質(zhì)和良好的細(xì)胞界面關(guān)系；（5）與植入部位組織的力學(xué)性能相匹配的結(jié)構(gòu)強(qiáng)度；（6）便于加工成理想的二維或三維結(jié)構(gòu)，可獲得所需的組織或器官形狀[2]。

1.2 膠原生物材料

膠原蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，作為細(xì)胞生長的依附與支架，能誘導(dǎo)上皮細(xì)胞等的增殖和分化。膠原蛋白為生物體提供了機(jī)械支撐作用，維護(hù)器官與組織的完整性，保障其正常功能的行使[3]。膠原在創(chuàng)傷修復(fù)中有十分重要的作用，是參與創(chuàng)傷愈合的主要結(jié)構(gòu)蛋白，所以，我們選擇膠原作為修復(fù)組織損傷的支架材料。

膠原在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用包括許多方面，包括創(chuàng)面的愈合和燒傷的修復(fù)、整形，神經(jīng)損傷再生，以及血管瓣膜替代等。表1 總結(jié)了膠原在醫(yī)療上的用途。

表1.膠原材料在醫(yī)療上的應(yīng)用

2.功能膠原生物材料的研究

功能生物材料是指能主動對機(jī)體的理化或生理過程產(chǎn)生影響的生物活性材料，它能夠誘導(dǎo)細(xì)胞的長入，使材料細(xì)胞化，從而使得損傷部位形成新的組織。在這種情況下，生物材料不只是起物理機(jī)械支持作用，它還能夠通過改變周圍環(huán)境而改變再生的過程。目前，活化材料的生物活性分子有幾種：（1）促細(xì)胞粘附分子，促進(jìn)細(xì)胞在材料上的生長和分化；（2）生長因子，促進(jìn)細(xì)胞增殖、存活及控制細(xì)胞表型；（3）特異表達(dá)活性分子的DNA，可以達(dá)到長期穩(wěn)定的作用效果。三方面的研究目前都有很大的進(jìn)展，我們更為關(guān)注生長因子的獨(dú)特功能。

2.1 生長因子與膠原復(fù)合構(gòu)成生物材料

圖1.生長因子與材料簡單吸附的生物材料

生長因子是通過細(xì)胞間信號傳遞影響細(xì)胞活動的一類多肽因子，可由多種細(xì)胞分泌，與靶細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合來發(fā)揮其作用，有促進(jìn)或抑制細(xì)胞的增殖、遷移和基因表達(dá)的作用，在生物體的發(fā)育與損傷修復(fù)過程中發(fā)揮重要的作用[4]。

目前，用生長因子來活化膠原材料，并與膠原材料聯(lián)合用于損傷修復(fù)的例子已經(jīng)有很多。然而，根據(jù)目前的研究，生長因子與生物材料簡單的復(fù)合作用是有限的，這是因?yàn)轶w內(nèi)體液的浸潤與流動，造成了生長因子的自由擴(kuò)散，從而不能達(dá)到局部富集的目的。如圖1 所示。這種擴(kuò)散會有幾方面的問題，一是擴(kuò)散的生長因子為機(jī)體帶來潛在的風(fēng)險，二是擴(kuò)散使細(xì)胞活動主要發(fā)生在材料的外部，導(dǎo)致修復(fù)效果有限，而為了加強(qiáng)修復(fù)效果，需要反復(fù)用藥，這無疑增加了成本與患者的痛苦[5]。

2.2 利用帶膠原結(jié)合區(qū)的生長因子與膠原材料復(fù)合構(gòu)成功能膠原生物材料

如果通過特定的方式，將生長因子錨定在膠原支架材料上，限制生長因子的自由擴(kuò)散，就能使生長因子在材料的原位發(fā)揮作用，促進(jìn)細(xì)胞在材料內(nèi)的增殖、遷移、分化。如圖2 所示。由此我們可以預(yù)測：一方面，移植到體內(nèi)后，生長因子的自由擴(kuò)散可以得到限制，削弱生長因子的自由擴(kuò)散對機(jī)體的潛在風(fēng)險；另一方面，可以大大降低生長因子使用量，降低治療成本，達(dá)到高效率利用生長因子的目的；最重要的一點(diǎn)是可以提高修復(fù)治療效率，使得再生能夠比較均勻，從而提高修復(fù)后組織的質(zhì)量[5]。

為了增強(qiáng)生長因子與膠原材料的結(jié)合能力，采用基因工程的方法，在生長因子上融合能夠特異結(jié)合膠原的多肽TKKTLRT（膠原結(jié)合區(qū)CBD），從而賦予生長因子更強(qiáng)的特異結(jié)合膠原蛋白的能力。其中，膠原結(jié)合區(qū)CBD 衍生于膠原酶中膠原結(jié)合區(qū)的一段7 肽，序列為TKKTLRT，具有特異的膠原結(jié)合能力。

針對不同的損傷，可以制備不同的膠原材料。對適于這種組織損傷修復(fù)的生長因子進(jìn)行改造，使之帶有膠原結(jié)合能力。具有膠原特異結(jié)合能力的生長因子和不同的膠原材料，構(gòu)成適于不同組織損傷修復(fù)的功能膠原生物材料，并且在皮膚、骨、肌肉（膀胱肌肉，腹壁肌肉）、外周神經(jīng)和中樞神經(jīng)損傷修復(fù)中驗(yàn)證了膠原功能生物材料的作用。

圖 2.生長因子與材料定向結(jié)合的功能生物材料

3.膠原功能生物材料對不同組織損傷修復(fù)的作用

3.1 膠原功能生物材料在皮膚組織損傷修復(fù)中的作用

對于皮膚損傷修復(fù)，膠原膜(Collagen Membrane,CM)是一種合適的材料。膠原膜可以作為創(chuàng)面覆蓋物，具有封閉創(chuàng)面、保濕、止血以及可吸收等特點(diǎn)（圖3）。

選擇PDGF-BB（血小板源性生長因子-BB）作為治療皮膚損傷的活化因子。PDGF 參與了許多細(xì)胞活動，包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞生長、遷移及細(xì)胞的生存凋亡等，對各種間充質(zhì)及神經(jīng)上皮來源的一些細(xì)胞是潛在的促分裂素。大量的動物實(shí)驗(yàn)表明，加入外源的PDGF 能夠促進(jìn)愈合過程。外源PDGF-BB 能夠促進(jìn)組織的新生、傷口的愈合，提高修復(fù)質(zhì)量[6,7]。

對PDGF-BB 進(jìn)行改造，將膠原結(jié)合區(qū)CBD融合入PDGF-BB 中，制備出帶膠原結(jié)合區(qū)的PDGF-BB（稱之為CBD-PDGF），同時也制備出天然形式的PDGF-BB，稱之為NAT-PDGF。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，NAT-PDGF 和CBD-PDGF具有相似的生物學(xué)活性，這說明膠原結(jié)合區(qū)CBD的融合，沒有影響CBD-PDGF 的生物學(xué)活性[7]。體外膠原結(jié)合實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，CBD-PDGF 具有特異結(jié)合膠原蛋白的能力，其膠原結(jié)合能力顯著性優(yōu)于NAT-BDNF[7]。

隨后，用動物模型檢驗(yàn)由膠原膜結(jié)合CBDPDGF 構(gòu)成的功能膠原生物材料。采用的皮膚損傷模型是兔耳潰瘍模型。共分為3 組：PBS 浸泡的膠原膜組（CM/PBS），膠原膜吸附NAT-PDGF組（CM/NAT-PDGF），膠原膜結(jié)合CBD-PDGF 組(CM/CBD-PDGF)。測量不同時間點(diǎn)，各個組的傷口愈合率，結(jié)果顯示，由膠原膜結(jié)合CBD-PDGF構(gòu)成的功能膠原生物材料組的愈合速度顯著好于膠原膜吸附NAT-PDGF 組和對照組。手術(shù)后14 天，由膠原膜結(jié)合CBD-PDGF 構(gòu)成的功能生物材料組的潰瘍已經(jīng)基本愈合。免疫組化觀察血管新生和膠原沉積。血管新生將改變傷口處的血供，運(yùn)輸養(yǎng)分；而膠原沉積是皮膚愈合及重塑不可或缺的過程，膠原沉積的好壞往往反映了傷口愈合治療的優(yōu)劣。在這兩個指標(biāo)上，由膠原膜結(jié)合CBDPDGF 構(gòu)成的功能膠原生物材料組也顯著高于膠原膜吸附NAT-PDGF 組與對照組，顯示了其在促進(jìn)損傷修復(fù)，提高修復(fù)質(zhì)量上的巨大作用[7]。

圖3.膠原膜（CM）的結(jié)構(gòu)（A）膠原膜（CM）的直觀圖（B）膠原膜（CM）電鏡圖

圖4.DBM的結(jié)構(gòu)（A）DBM直觀圖；（B）DBM電鏡圖。

3.2 膠原功能生物材料在骨組織損傷修復(fù)中的作用

選擇脫鈣骨基質(zhì)(Demineral bone matrix,DBM)即骨膠原作為促進(jìn)骨損傷修復(fù)的支架材料（圖4）。DBM 保持了天然骨的小梁結(jié)構(gòu)與有機(jī)成分（骨的主要成分），DBM 的膠原結(jié)構(gòu)表面含有礦物沉積的位點(diǎn)，對礦物沉積有誘導(dǎo)作用，可有效引發(fā)和控制礦化過程，促進(jìn)骨形成，因而是很好的骨填充材料[5,8]。

研究的另外一個方面是選擇活化DBM 的因子，研究人員選擇了骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)作為誘導(dǎo)骨形成的活性分子。同樣，通過基因工程的方法在BMP-2 一端耦聯(lián)CBD，制備出與膠原蛋白具有特異結(jié)合能力的CBD-BMP-2。且制備出天然的BMP-2（NAT-BMP-2）。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了NAT-BMP-2 與CBD-BMP-2 的生物學(xué)活性沒有明顯的差別，體外膠原結(jié)合實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明CBD-BMP-2 具有良好的膠原結(jié)合能力[5]。

為了研究這種功能膠原生物材料對原位骨缺損的修復(fù)作用，采用兔下頜骨缺損模型，即在兔的下頜骨部位制造一個自身無法修復(fù)的12mm×5mm×4mm 的缺損。隨后用3 組不同材料填充，或不填充作為對照，即總共分為4 個組：不填充材料的空白組，填充PBS 浸泡的DBM 作為對照組（DBM/PBS），以及 DBM 吸附NAT-BMP-2組（DBM/NAT-BMP-2），DBM 結(jié)合CBD-BMP-2組（DBM/CBD-BMP-2）。對不同組的愈合情況進(jìn)行X 光檢查，通過側(cè)面的X 光成像來分析傷口的愈合情況。結(jié)果表明由DBM 結(jié)合CBD-BMP-2 構(gòu)成的功能膠原生物材料（DBM/CBD-BMP-2）顯著加速了骨修復(fù)的能力，不僅外周成骨比較成熟，而且材料的內(nèi)部的成骨作用也非常明顯[5]。

3.3 功能膠原生物材料在肌肉組織損傷修復(fù)中的作用

3.3.1 膀胱肌肉損傷修復(fù)

用膠原膜CM 作為促進(jìn)膀胱肌肉損傷修復(fù)的支架材料。選擇人堿性成纖維生長因子bFGF 作為活化材料的因子。bFGF 是促進(jìn)膀胱損傷后組織再生的重要因子。對bFGF 進(jìn)行改造，將膠原結(jié)合區(qū)CBD 融合入bFGF 蛋白中，制備出能與膠原蛋白特異結(jié)合的CBD-bFGF，同時也制備出天然形式的bFGF（NAT-bFGF）。在大鼠膀胱肌肉損傷模型中，檢驗(yàn)了由膠原膜結(jié)合CBD-bFGF構(gòu)成的功能膠原生物材料的作用。共分為4 組：假手術(shù)組（sham-operated group）；PBS 浸泡過的膠原膜組（CM/PBS）；膠原膜吸附NAT-bFGF 組（CM/NAT-bFGF）；膠原膜結(jié)合CBD-bFGF 組（CM/CBD-bFGF）[9]。

修復(fù)過程中的30 天和90 天兩個時間點(diǎn)，H&E 染色觀察各組損傷修復(fù)的直觀情況。結(jié)果表明，由膠原膜結(jié)合CBD-bFGF 構(gòu)成的功能膠原生物材料組的材料植入處細(xì)胞化明顯高于其他治療組，且90 天時，其損傷部位再生組織的形態(tài)與正常組織相似。損傷處平滑肌細(xì)胞的免疫組化染色結(jié)果也表明，由功能膠原生物材料組材料植入處平滑肌細(xì)胞的陽性率顯著高于其他治療組，說明它能夠促進(jìn)損傷部位肌肉損傷的修復(fù)。接著，進(jìn)行尿動力學(xué)檢測，觀察各組膀胱功能的恢復(fù)情況。結(jié)果表明，功能膠原生物材料組的膀胱順應(yīng)性，即膀胱肌肉的彈性性能明顯高于其他組，這說明由膠原膜結(jié)合CBD-bFGF 構(gòu)成的功能膠原生物材料，顯著促進(jìn)了受損膀胱肌肉再生及膀胱功能的恢復(fù)[9]。

3.3.2 腹壁肌肉損傷修復(fù)

采用大鼠腹壁肌肉缺損模型檢驗(yàn)了對膀胱肌肉損傷修復(fù)有效果的膠原膜結(jié)合CBD-bFGF 構(gòu)成的功能膠原生物材料。腹壁肌肉缺損處用材料覆蓋，共分為四組：經(jīng)PBS 浸泡的膠原膜組（CM/PBS）；膠原膜結(jié)合吸附NAT-BDNF 組（CM/NAT-BDNF）；膠原膜結(jié)合CBD-BDNF 組（CM/CBD-BDNF）；假手術(shù)組（sham）?；謴?fù)90 天后，腹壁損傷處H&E 染色和平滑肌細(xì)胞免疫組化染色的結(jié)果表明，collagen/CBD-bFGF 組損傷處平滑肌細(xì)胞陽性率顯著高于其他治療組。說明，這種由膠原膜結(jié)合CBD-bFGF 構(gòu)成的功能膠原生物材料促進(jìn)了腹壁肌肉缺損處的肌肉再生[10]。觀察再生的腹壁肌肉組織的機(jī)械性能以評價再生腹壁肌肉組織的功能恢復(fù)，測定了再生腹壁肌肉的機(jī)械抗拉力性能。結(jié)果表明，collagen/CBD-bFGF組的最大彈性性能顯著好于其他治療組，說明由膠原膜結(jié)合CBD-bFGF 構(gòu)成的功能膠原生物材料促進(jìn)了再生肌肉的功能恢復(fù)[10]。

3.4 膠原功能生物材料在外周神經(jīng)損傷修復(fù)中的作用

對于外周神經(jīng)損傷的修復(fù)，選用膠原膜CM作為支架材料。同時，選用神經(jīng)營養(yǎng)因子（NGF）作為活化膠原膜，促進(jìn)外周神經(jīng)再生的因子。NGF 的生物學(xué)效應(yīng)廣泛，主要通過促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞樹狀突發(fā)生、伸展和維持存活的作用，增加神經(jīng)纖維在支配靶區(qū)的密度，并且促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的分化，加快有絲分裂，使神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目增加，決定軸突的生長方向[11]。

對NGF 進(jìn)行改造，使之帶有膠原結(jié)合區(qū)CBD，制備出能與膠原特異結(jié)合的NGF（CBDNGF），同時制備出天然的NGF（NAT-NGF）。體外細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)表明CBD-NGF 和NAT-NGF 都具有神經(jīng)營養(yǎng)活性，促使pc12 細(xì)胞生長出軸突。膠原結(jié)合實(shí)驗(yàn)也表明，CBD-NGF 具有特異的膠原結(jié)合能力。采用大鼠皮下包埋實(shí)驗(yàn)觀察由膠原膜結(jié)合CBD-BDNF 構(gòu)成的功能膠原生物材料促進(jìn)外周神經(jīng)再生的效果。共分為三組：PBS 浸泡膠原膜的對照組；膠原膜吸附NAT-NGF 組；膠原膜結(jié)合CBD-NGF 組。這三個組之間的神經(jīng)纖維數(shù)目都具有顯著性差異。其中由膠原膜結(jié)合CBD-NGF 構(gòu)成的功能膠原生物材料組的神經(jīng)纖維數(shù)目要明顯高于另外兩組?？梢缘贸鼋Y(jié)論，由膠原膜結(jié)合CBD-NGF 構(gòu)成的功能膠原生物材料能夠有效促進(jìn)外周神經(jīng)再生[11]。

3.5 膠原功能生物材料在中樞神經(jīng)損傷修復(fù)中的作用

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是一類致殘率很高的中樞神經(jīng)損傷。其中比較嚴(yán)重的是脊髓斷裂損傷，其損傷部位神經(jīng)絲斷開連接，受損脊髓組織甚至出現(xiàn)缺損。斷裂傷后神經(jīng)再生面臨的障礙有：（1）損傷處缺乏促進(jìn)軸突生長的因子；（2）軸突生長缺乏方向性，難以實(shí)現(xiàn)正確的突觸連接，神經(jīng)功能很難恢復(fù)。針對這些問題，需要設(shè)計一個綜合的治療策略，克服再生障礙。（1）要選擇一種良好的神經(jīng)生長引導(dǎo)材料；（2）對材料進(jìn)行修飾，使之帶有活性成分，促進(jìn)軸突生長。

良好的軸突生長引導(dǎo)材料可以引導(dǎo)受損軸突的生長方向，使之形成正確的突觸聯(lián)接，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。采用有序膠原生物材料LOCS（圖5）[12]。其次，選擇腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）作為活化LOCS，促進(jìn)神經(jīng)再生的因子。BDNF 能夠促進(jìn)神經(jīng)元的存活與分化，常被用來治療中樞神經(jīng)損傷，包括帕金森癥、抑郁癥及脊髓損傷[13]。研究人員對BDNF 進(jìn)行改造，將膠原蛋白結(jié)合區(qū)CBD 融合入BDNF 蛋白，制備出能與膠原材料特異結(jié)合的BDNF（CBD-BDNF），同時，還制備出天然形式的BDNF（NAT-BDNF）[12]。

圖5.有序膠原材料LOCS的宏觀照片（a）-（c）及電鏡照片（d）

采用大鼠脊髓半橫斷損傷模型檢驗(yàn)了由LOCS 結(jié)合CBD-BDNF 構(gòu)成的功能膠原生物材料的作用。大鼠脊髓做6mm 長半橫斷損傷，材料縱向植入脊髓缺損處，分為四組：對照組，不植入材料；LOCS 組；LOCS 吸附NAT-BDNF 組；LOCS 結(jié)合CBD-BDNF 組。

BBB 行為學(xué)評分結(jié)果表明，LOCS 結(jié)合CBDBDNF 組的運(yùn)動能力恢復(fù)顯著好于其他組。免疫組化觀察材料植入部位的神經(jīng)再生情況：神經(jīng)絲NF 染色結(jié)果表明，LOCS 結(jié)合CBD-BDNF 組的神經(jīng)絲陽性率顯著高于其他組，且軸突再生方向與其他組比較有更好的有序性。說明LOCS 結(jié)合CBD-BDNF 所構(gòu)成的功能膠原生物材料不但能促進(jìn)神經(jīng)再生，而且能引導(dǎo)軸突沿LOCS 的方向有序生長，顯著促進(jìn)了脊髓損傷大鼠的運(yùn)動能力恢復(fù)。

4.結(jié)論

針對不同的組織損傷，可以選用不同的膠原材料作為促進(jìn)再生的支架材料：膠原膜CM 適用于皮膚、肌肉、外周神經(jīng)的損傷修復(fù)；脫鈣骨膠原DBM 適用于骨組織修復(fù)；有序膠原材料LOCS 適用于脊髓中樞神經(jīng)損傷的修復(fù)。同時，用帶膠原結(jié)合區(qū)的生長因子來活化膠原材料，構(gòu)成功能膠原生物材料，促進(jìn)不同組織損傷的再生：CBD-PDGF 用于活化膠原膜，促進(jìn)皮膚損傷再生；CBD-BMP-2 用于活化脫鈣骨膠原DBM，促進(jìn)骨損傷修復(fù)；CBD-bFGF 用于活化膠原膜，促進(jìn)肌肉損傷修復(fù)；CBD-NGF 用來活化膠原膜，用于外周神經(jīng)損傷修復(fù)；CBD-BDNF 用來活化有序膠原材料LOCS，用于脊髓中樞神經(jīng)損傷修復(fù)。采用不同的組織損傷大鼠模型檢驗(yàn)了這些膠原功能生物材料促進(jìn)相關(guān)組織損傷修復(fù)的作用。結(jié)果表明，通過限制生長因子在生物材料上的擴(kuò)散可以有效提高生物材料引導(dǎo)組織再生的能力。

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