李 淼 尚云曉 魏 兵

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院小兒呼吸內(nèi)科，沈陽(yáng)110004）

氣道重塑是慢性哮喘氣道的重要病例特點(diǎn)。氣道重塑是導(dǎo)致氣道高反應(yīng)，肺功能持續(xù)性下降的主要原因，并可導(dǎo)致頑固性哮喘。預(yù)防和逆轉(zhuǎn)氣道重塑是干預(yù)哮喘，尤其是頑固性哮喘的有效途徑。吸入性糖皮質(zhì)激素（ICS）是哮喘治療的一線藥物，其通過(guò)減輕氣道炎癥，抑制免疫反應(yīng)的作用來(lái)減輕氣道反應(yīng)，布地奈德氣霧劑是目前哮喘治療的常用藥物。氣道重塑的病例特點(diǎn)包括：氣道平滑肌層肥厚／增生，杯狀細(xì)胞增生肥厚，上皮下纖維化及血管增生，其中氣道平滑肌層增生／肥厚在其中起到重要作用。有文獻(xiàn)報(bào)道，糖皮質(zhì)激素有抑制氣道平滑肌層增厚的作用［1］，但其對(duì)ASMC作用機(jī)制報(bào)道較少，因此，本研究從細(xì)胞水平探討了布地奈德氣霧劑對(duì)ASMC 中 MMP-9／TIMP-1 作 用，以 進(jìn) 一 步 說(shuō) 明ICS對(duì)哮喘氣道的作用。

材料和方法

1.實(shí) 驗(yàn)動(dòng)物及材料

雌性Wistar大鼠60只，周齡6周～8周，體質(zhì)量60～80g，中國(guó)醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物部提供；百日咳滅活桿菌購(gòu)自北京生物制品研究所；卵蛋白及氫氧化鋁凝膠購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；抗α－平滑肌肌動(dòng)蛋白多克隆抗體購(gòu)自武漢博士德公司；定量PCR試劑盒及 MMP-9／TIMP-1mRNA 引物購(gòu)自美國(guó)Takara公司。

2.方 法

2.1 大鼠哮喘氣道重塑模型制作方法

參照文獻(xiàn)［2］，即1d及8d腹腔注射1%卵蛋白10mg、氫氧化鋁凝膠200mg及百日咳滅活桿菌6×109／ml混合液共1ml致敏，第15d開(kāi)始超聲霧化吸入2%卵蛋白誘喘，隔日一次6W，模型制作共8W。

2.2 大鼠來(lái)源及分組

選擇同種屬、同體質(zhì)量（60-80g）、飼養(yǎng)條件一致的雌性 Wistar大鼠共60只、隨機(jī)分成以下各組。按不同的影響因素進(jìn)行分組。其中正常對(duì)照組20只、模型組20只、治療組20只。飼養(yǎng)期間給予正常飲食。

2.3 因素處理及取材時(shí)機(jī)

A正常對(duì)照組：用生理鹽水代替卵蛋白吸入，吸入方法同模型組并同期取材。B模型組：按哮喘氣道重塑模型制作方法，誘喘成功后24h內(nèi)取材。在致敏后大鼠出現(xiàn)劇烈咳嗽、打噴嚏、呼吸困難、喘息、呼氣費(fèi)力或點(diǎn)頭樣呼吸、聽(tīng)診聞及喘鳴音，則表明哮喘模型制作成功。C治療組：卵蛋白吸入致敏及誘喘同模型組。自致敏第15d，每只大鼠每日在吸入致敏后用壓縮霧化機(jī)面罩吸入普米克霧化溶液（2ml／1mg）、每次5min、隔日一次，共6w，誘喘后24h內(nèi)取材。

2.4 HE 染色

各組大鼠分次在最后一次致敏后24h內(nèi)處死，每次取材6只，每組2只，腹腔注射10%水合氯醛（30mg／kg）麻醉后，左心室取血處死大鼠。取右肺中葉組織用4%多聚甲醛固定24h后石蠟包埋，切片5μm。按照文獻(xiàn)［1］用圖像分析軟件（HMIAS 2000；Qianping Systems，Wuhan，China）測(cè)量哮喘大鼠氣道壁面積（Wat）及平滑肌層面積（Was），并用氣道基膜周長(zhǎng)（Pbm）進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。用這種方法每張切片測(cè)量3-5個(gè)支氣管，測(cè)量結(jié)果用ˉx±s表示，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2.5 ASMC原代培養(yǎng)［3］

在肺組織取材后無(wú)菌分離大鼠氣管，仔細(xì)剝離外膜，去除內(nèi)膜。將氣管平滑肌剪下，用含雙抗的DMEM培養(yǎng)液清洗后，用0.1%Ⅳ型膠原酶于37℃水浴下消化30min兩次，待液體渾濁時(shí)用含10%胎牛血清的DMEM終止消化。1000r／min離心后用含10%胎牛血清DMEM重懸后200目濾網(wǎng)過(guò)濾后37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)。3d換液，7d細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶。用0.25%胰蛋白酶消化傳代后，利用成纖維細(xì)胞貼壁較快的特點(diǎn)純化平滑肌細(xì)胞，取第4代細(xì)胞用于檢測(cè)。

2.6 ASMC鑒定

于倒置顯微鏡下觀察，ASMC呈梭形或多角型，呈谷峰樣。以抗α-actin，山羊抗兔FITC免疫熒光染色后，細(xì)胞漿呈綠色的細(xì)胞為平滑肌細(xì)胞。

2.7 MMP-9／TIMP-1mRNA含量檢測(cè)

將各組大鼠ASMC速凍于液氮中保存。使用Trizol試劑盒提取總RNA，利用Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄總RNA至cDNA，逆轉(zhuǎn)錄體積10μl。取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物加入SYBR Master Mix、上下游引物行實(shí)時(shí)定量PCR。所有引物均由大連Takara生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，分別為大鼠 MMP-9：上游5＇-AGCCGGGAACGTATCTGGA-3＇；下 游 5＇-TGGAAACTCACACGCCAGAAG-3＇；大鼠 TIMP-1：上游5＇-CGAGACCACCTTATACCAGCGTTA -3＇；下游5＇-TGATGTGCAAATTTCCGTTCC-3＇；大 鼠 GAPDH：上 游 5＇-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3＇；下游5＇-ATGGTGGTGAAGACGCCAGT-3＇。采用 Rotor-gene 2000Realtime Amplication實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增。每個(gè)樣本做3個(gè)平行管。反應(yīng)條件均為95℃變性30s，95℃5s，60℃20s，共40個(gè)循環(huán)，標(biāo)準(zhǔn)溶解曲線分析。線性指數(shù)增殖期的CT值用來(lái)計(jì)算DNA模板的初始拷貝數(shù)。同時(shí)測(cè)量每個(gè)樣本的管家基因GAPDH mRNA表達(dá)與 MMP-9／TIMP-1mRNA表達(dá)。模型組、治療組的CT值分別與正常組CT值比較，得出相對(duì)倍數(shù)。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以ˉx±s表示，組間比較采用單因素方差分析LSD或SNK法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.H E染色

在模型組大鼠肺組織中粘膜層及粘膜下層炎癥細(xì)胞較正常對(duì)照組大鼠明顯增加。模型組標(biāo)準(zhǔn)化后的氣道壁面積及平滑肌層面積明顯較正常對(duì)照組增加，治療組大鼠肺組織炎癥細(xì)胞較模型組明顯減少，但較正常對(duì)照組增多。圖像分析測(cè)量各組大鼠肺支氣管哮喘模型組 Wat／Pbm及 Was／Pbm明顯較正常對(duì)照組增加，治療組Wat／Pbm及Was／Pbm較正常對(duì)照組增加，但較模型組明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（見(jiàn)表1，圖1）。

表1 各組大鼠氣道Wat／Pbm及Was／Pbm的比較（ˉx±s n＝60）Table 1 the comparisons of Wat／Pbm and Was／Pbm in different group

圖1 8周后各組大鼠肺組織切片觀察（HE 10×）Fig.1the observation of lung tissue in different group after 8W（HE 10×）

2.R eal time PCR 檢 測(cè) 各 組 大 鼠 ASMC 中MMP-9mRNA及 TIMP-1mRNA表達(dá)含量

當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至融合并呈谷峰狀態(tài)時(shí)進(jìn)行傳代。用第四代細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。模型組大鼠ASMC中MMP-9mRNA表達(dá)較正常組增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；但治療組大鼠 ASMC中 MMP-9mRNA表達(dá)較模型組減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；但較正常對(duì)照組大鼠ASMC增加（P＜0.05）。模型組大鼠ASMC中TIMP-1mRNA較正常組降低；但治療組大鼠ASMC中TIMP-1mRNA較哮喘組增加，但較正常對(duì)照組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 Real-time PCR檢測(cè)不同組ASMC中MMP-9mRNA及TIMP-1mRNA表達(dá)（ˉx±s）Table 2 Real-time PCR analyses the expressions of MMP-9mRNA and TIMP-1mRNA in ASMC of different group（ˉx±s）

討 論

MMPs主要由巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞（SMCs）、內(nèi)皮細(xì)胞等產(chǎn)生。MMP-9是MMPs基質(zhì)降解蛋白酶家族中最主要的成員。正常情況下，MMP-9能夠降解Ⅳ型膠原、纖維連接蛋白、層粘連蛋白等細(xì)胞外基質(zhì) （ECM）。而 TIMP-1是MMPs的特異性抑制物，可由各種組織細(xì)胞和炎癥細(xì)胞分泌，可抑制 MMP-9產(chǎn)生，抑制基質(zhì)降解，引起基質(zhì)沉積。氣道重塑是氣道慢性炎癥的結(jié)果，包括氣道壁增厚和基質(zhì)沉積、膠原沉積、上皮下纖維化、平滑肌增生和肥大、肌成纖維細(xì)胞增殖及黏液腺、杯狀細(xì)胞化生及增生、上皮下網(wǎng)狀層增厚、微血管生成等病理改變。在這些病理變化中，氣道平滑肌的改變被認(rèn)為是導(dǎo)致氣道高反應(yīng)性和哮喘加重的重要因素之一。哮喘氣道ASMC增生在哮喘氣道重塑過(guò)程中起重要作用，MMP-9與哮喘氣道重塑密切相關(guān)［4］。有學(xué)者通過(guò)對(duì)比TIMP-1基因敲除小鼠與野生鼠哮喘模型發(fā)現(xiàn)TIMP-1能夠通過(guò)抑制氣道反應(yīng)性，調(diào)節(jié)氣道炎癥，抑制氣道重塑及細(xì)胞因子表達(dá)起到保護(hù)氣道的作用［5］。MMP及TIMP比例的平衡是維持正?；|(zhì)和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要因素，MMP與TIMP的分泌失衡與哮喘氣道炎癥，氣道平滑肌增生，氣道反應(yīng)性增高密切相關(guān)，參與哮喘氣道重塑的病理生理過(guò)程。也有學(xué)者通過(guò)地塞米松在體干預(yù)哮喘小鼠肺組織免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)地塞米松可通過(guò)抑制肺內(nèi)MMP-9／TIMP-1的表達(dá)而減輕氣道重塑［6］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)制作哮喘模型原代培養(yǎng)ASMC與正常大鼠比較證明 MMP-9mRNA明顯增加，而TIMP-1mRNA含量明顯降低，可見(jiàn)在哮喘時(shí)細(xì)胞水平同樣發(fā)生改變。

布地奈德氣霧劑是哮喘治療常用的吸入藥物之一，布地奈德能夠抑制嗜酸細(xì)胞氣道炎癥，能夠減少肥大細(xì)胞數(shù)量及減少炎癥介質(zhì)釋放。有文獻(xiàn)報(bào)道吸入布地奈德通過(guò)上調(diào)哮喘患兒氣道巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TIMP-1，下 調(diào) MMP-8 表 達(dá) 從 而 改 善 MMP-8／TIMP-1比值改善氣道重構(gòu)［7］。也有文獻(xiàn)報(bào)道，吸入糖皮質(zhì)激素能下調(diào)MMP-9，上調(diào)TIMP-1的表達(dá)而改善氣道重塑。但是其缺乏確切的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。本文通過(guò)吸入布地奈德干預(yù)哮喘氣道重塑大鼠模型后，通過(guò)HE染色后測(cè)量 Wat／Pbm及 Was／Pbm證明布地奈德治療組大鼠ASMC明顯較模型組降低，提示布地奈德氣霧劑吸入有改善哮喘氣道重塑的作用。本文還通過(guò)RT-PCR檢測(cè)各組 ASMC中MMP-9及 TIMP-1含量證明治療組 MMP-9含量較模型組明顯下降，但TIMP-1較哮喘組明顯增加；提示在哮喘氣道 MMP-9／TIMP-1比值降低，而布地奈德吸入能明顯改善氣道平滑肌細(xì)胞 MMP-9／TIMP-1比值從而改善哮喘氣道平滑肌層膠原沉積，減輕氣道壁增厚，改善氣道重塑過(guò)程［8］。這為糖皮質(zhì)激素在哮喘氣道重塑過(guò)程中的應(yīng)用奠定了細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。

［1］朱燦紅，季偉，固衛(wèi)芳.吸入性糖皮質(zhì)激素對(duì)哮喘氣道重塑模型平滑肌的影響.江蘇醫(yī)藥，2006，32（1）：50-51

［2］Xie M，Liu XS，Xu YJ，et al.ERK1／2Signaling Pathway Modulates the Airway Smooth Muscle Cell Phenotype in the Rat Model of Chronic Asthma.Respiration，2007，74（6）：680-690

［3］An SS，Laudadio RE，Lai J，et al.Stiffness changes in cultured airway smooth muscle cells.Am J Physiol Cell Physiol，2002，283（3）：792-801

［4］Song Y，Qi H，Wu C.Effect of 1，25-（OH）2D3（a vitamin D analogue）on passively sensitized human airway smooth muscle cells.Vespirology，2007，12（4）：486-494

［5］Sands MF，Ohtake PJ，Mahajan SD，et al.Tissue inhibitor of metalloproteinase-1modulates allergic lung inflammation in murine asthma.Clin Immunol，2009，130（2）：186-198

［6］楊 遠(yuǎn)，林 勇，黃靜.CpG ODN和地塞米松對(duì)哮喘氣道的重塑及 MMP-9、TIMP-1表達(dá)的影響.中國(guó)病理生理雜志，2007，23（10）：1977-1981

［7］Obase Y，Rytil？ P，Metso T，et al.Effects of inhaled corticosteroids on metalloproteinase-8and tissue inhibitor of metalloproteinase-1in the airways of asthmatic children.Int Arch Allergy Immunol，2010，151（3）：247-254

［8］朱清義，孫廣榮綜述.基質(zhì)金屬蛋白酶 MMP-9及其組織抑制劑-1與哮喘氣道重塑.中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2007，17（22）：2743-2747