鄒 榮，于紅剛，周 巍

武漢大學(xué)人民醫(yī)院消化內(nèi)科，湖北武漢430060

胃癌是消化道最常見的惡性腫瘤，其浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移是影響患者療效及預(yù)后并導(dǎo)致死亡的重要因素，因此，探討胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移是目前研究工作的一個(gè)重要方面。與張力蛋白同源的第10號(hào)染色體丟失的磷酸酶基因PTEN是一種具有雙重磷酸酶活性的抑癌基因，PTEN基因的突變、缺失、失活在原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤中發(fā)生率較高，失活是因?yàn)閱?dòng)子甲基化沉默導(dǎo)致的［1］。Paxillin是一種黏著斑信號(hào)蛋白，作為一種接頭蛋白在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用，主要參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移［2-3］。目前國(guó)內(nèi)外將PTEN與paxillin聯(lián)合起來研究的文章并不多，且采用免疫印跡和免疫熒光技術(shù)探討PTEN與paxillin的關(guān)系更是少見，本文通過此兩種研究方法探討PTEN與paxillin在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，為尋求新的臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料及試劑 人胃癌細(xì)胞株BGC823(購(gòu)于上海中科院)，胎牛血清(GIBCO公司)，1640(GIBCO公司)，RIPA裂解液(碧云天生物技術(shù)有限公司)，小鼠抗人paxillin單克隆抗體(購(gòu)于ABcom公司)，小鼠抗人PTEN單克隆抗體(購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司)，兔抗人β-actin單克隆抗體(購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司)，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG(購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司)，質(zhì)粒抽提試劑盒(OMEGA公司)，碧云天BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(增強(qiáng)型)。質(zhì)粒pEAK8和pEAK8-PTEN由李宏宇教授(沈陽軍區(qū)總醫(yī)院消化科)惠贈(zèng)。

1．2 方法

1．2．1 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pEAK8及pEAK8-PTEN:以大腸桿菌E．coli為載體擴(kuò)增質(zhì)粒，按照質(zhì)粒抽提試劑盒說明書提取質(zhì)粒，于紫外分光光度計(jì)下測(cè)定質(zhì)粒濃度，細(xì)胞饑餓12 h后，利用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將質(zhì)粒和脂質(zhì)體(LipofectamineTM2000，購(gòu)于invitrogen公司)按說明書操作加入到培養(yǎng)瓶，細(xì)胞培養(yǎng)48 h后提蛋白。

1．2．2 Western blot檢測(cè)PTEN、paxillin及actin(內(nèi)參)蛋白水平的表達(dá):BCA法測(cè)定蛋白濃度。加入上樣緩沖液后煮沸蛋白使蛋白變性;10 μg體積的蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上;10%脫脂牛奶封閉;一抗(小鼠抗人PTEN單克隆抗體1∶750稀釋、小鼠抗人paxillin單克隆抗體1∶1 000稀釋、兔抗人β-actin單克隆抗體1∶1 000稀釋)4℃孵育過夜;TBST洗5 min，3次;二抗(HRP-偶聯(lián)的羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG)孵育1 h(1∶1 500稀釋);TBST洗3次，每次10 min;化學(xué)發(fā)光法定影顯影后用數(shù)碼成像系統(tǒng)對(duì)膠片進(jìn)行掃描，利用Quanity One軟件對(duì)條帶的灰度值進(jìn)行分析。

1．2．3 免疫熒光檢測(cè)paxillin在細(xì)胞內(nèi)的定位:將瞬轉(zhuǎn)pEAK8和pEAK8-PTEN質(zhì)粒的BGC細(xì)胞以3×105種入置有蓋玻片的六孔板內(nèi)培養(yǎng)至細(xì)胞融合達(dá)60%～70%，4%多聚甲醛固定30 min后去固定液，PBS洗滌3次;加入0．2%Triton 100(透膜)靜置10 min，PBS洗滌3次;5%BSA封閉30 min;一抗(小鼠抗人paxillin單克隆抗體1∶100稀釋)4℃孵育過夜;PBS洗3次;二抗(TexRed熒光標(biāo)記，購(gòu)自Santa Cruz公司)孵育1 h;PBS洗5 min，3次;DAPI(Santa Cruz公司)染色2 min;PBS洗5 min，3次。熒光顯微鏡下觀察。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13．0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，不同組間灰度值差異可用單因素方差分析檢驗(yàn)，PTEN與paxillin的相關(guān)關(guān)系用Spearman秩相關(guān)進(jìn)行分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0．05，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 W estern blot檢測(cè) 如圖1所示，胃癌細(xì)胞中實(shí)驗(yàn)組［pEAK8-PTEN-BGC823(pE-P-B)］與對(duì)照組［空白對(duì)照BGC823(BGC823)、陰性對(duì)照pEAK8-BGC823 (pE-B)］相比，PTEN蛋白水平的表達(dá)明顯升高，而paxillin蛋白的表達(dá)明顯受到抑制。表1中各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)，空白對(duì)照與陰性對(duì)照組中PTEN與 paxillin的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)。PTEN與paxillin兩者呈負(fù)相關(guān)(r=－0．12，P＜0．05)。actin用于顯示上樣量一致。

圖1 W estern blot檢測(cè)PTEN、paxillin、actin蛋白的表達(dá)Fig 1 The protein expression of PTEN，paxillin and actin detected by W estern blot

表1 PTEN和paxillin蛋白的表達(dá)(±s)Tab 1 The protein expression of PTEN and paxillin(±s)

表1 PTEN和paxillin蛋白的表達(dá)(±s)Tab 1 The protein expression of PTEN and paxillin(±s)

分組PTEN Paxillin BGC 0．506±0．015 2．663±0．096 pE-B 0．513±0．006 2．747±0．047 pE-P-B 1．013±0．074 0．883±0．032

2．2 免疫熒光 如圖2所示:胃癌細(xì)胞核呈藍(lán)色，paxillin位于細(xì)胞膜上呈紅色(箭頭所示)，在細(xì)胞伸出偽足處聚集。

3 討論

PTEN(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10)基因是1997年發(fā)現(xiàn)并命名的一個(gè)抑癌基因，定位于染色體10q23，具有脂質(zhì)磷酸酶活性和蛋白磷酸酶活性。其主要功能是通過脂質(zhì)磷酸酶活性調(diào)控磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphoinositide 3-kinase/AKT，PI3K/AKT)通路活性，而PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)通路的激活被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞抗凋亡的主要機(jī)制之一。其蛋白磷酸酶活性可使粘著斑激酶(focal adhesional kinase，F(xiàn)AK)蛋白去磷酸化繼而抑制細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和侵襲能力［2，4］。PTEN蛋白可通過多種信號(hào)途徑調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡、運(yùn)動(dòng)、侵襲、轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)行為［5-7］。PTEN基因在多種惡性腫瘤中可發(fā)生突變和缺失，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)［8-10］。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤、子宮內(nèi)膜癌、前列腺癌、膀胱癌、肺癌、乳腺癌、胃癌等都有檢測(cè)到PTEN基因的突變和缺失。本研究結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染質(zhì)粒GFP的BGC細(xì)胞與空白對(duì)照BGC細(xì)胞相比，PTEN與paxillin蛋白水平的表達(dá)無明顯差異，說明GFP質(zhì)粒對(duì)胃癌細(xì)胞中的蛋白的生成未產(chǎn)生明顯影響，只是使細(xì)胞能發(fā)出綠色熒光;共轉(zhuǎn)質(zhì)粒GFP與PTEN的BGC細(xì)胞PTEN的表達(dá)明顯高于陰性對(duì)照組GFP-BGC細(xì)胞和空白對(duì)照組BGC細(xì)胞，而paxillin的表達(dá)明顯低于后兩者，表明PTEN可下調(diào)胃癌細(xì)胞中paxillin的表達(dá)，與楊麗敏等［11］研究發(fā)現(xiàn)PTEN與paxillin的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)結(jié)論相同。

圖2 免疫熒光檢測(cè)paxillin在細(xì)胞內(nèi)的定位(400×)a、c、e:pEAK8-BGC823;:b、d、f:pEAK8-PTEN-BGC823Fig 2 The location of paxillin inside cell detected by immunofluorescence(400×)

paxillin是一個(gè)分子量為68 KD的黏著斑信號(hào)蛋白，是一種重要的細(xì)胞黏附分子，主要定位于黏著斑。paxillin分子中含有多種結(jié)構(gòu)域，包括氨基端起蛋白識(shí)別作用的5個(gè)LD結(jié)構(gòu)域和富含脯氨酸的SH3結(jié)構(gòu)域;羧基端介導(dǎo)蛋白與蛋白之間的相互作用的4個(gè)串聯(lián)的LIM結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)使paxillin能夠和一系列的信號(hào)蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白結(jié)合，成為介導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要位點(diǎn)。作為一種接頭蛋白，paxillin能將信號(hào)從細(xì)胞外經(jīng)整合素途徑向細(xì)胞內(nèi)傳遞，是細(xì)胞骨架與胞外基質(zhì)連接不可缺少的聯(lián)系紐帶。paxillin可通過重排肌動(dòng)蛋白的細(xì)胞骨架，以及與整合素相互作用來調(diào)節(jié)細(xì)胞的黏附和運(yùn)動(dòng)［12］。細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)是細(xì)胞因子或趨化因子引導(dǎo)、肌動(dòng)蛋白的聚合、新的黏著斑不斷形成和尾端黏著斑協(xié)調(diào)性解聚的多步驟的動(dòng)態(tài)過程［13-14］，多項(xiàng)研究表明paxillin可動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)黏著斑、調(diào)節(jié)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、播散和轉(zhuǎn)移［15-17］，從而提高腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力。本研究中，免疫熒光結(jié)果顯示 paxillin在GFP-BGC細(xì)胞伸出偽足處聚集，而在GFP-PTEN-BGC中未見明顯表達(dá)。偽足能誘導(dǎo)肌動(dòng)蛋白重組，形成細(xì)胞突起，起到黏附和運(yùn)動(dòng)作用［18］。paxillin在偽足聚集，更能促進(jìn)有偽足形成的癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)。而此結(jié)果也說明PTEN可抑制paxillin的表達(dá)，進(jìn)一步抑制胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。

正如本研究發(fā)現(xiàn)PTEN可以調(diào)節(jié)paxillin的表達(dá)一樣，Herlevsen等［19］也提到PTEN與paxillin有一定的作用關(guān)系，但具體通過何種途徑作用目前仍不是很清楚。也有研究發(fā)現(xiàn)在PTEN的共沉淀物中能檢測(cè)到paxillin的沉著［20］。PTEN可通過蛋白磷酸酶活性調(diào)節(jié)FAK的去磷酸化，而paxillin可以作為FAK/Src信號(hào)通路的下游信號(hào)被磷酸化激活［21］，因此PTEN通過FAK而間接調(diào)節(jié)paxillin的表達(dá)也是有可能的。研究表明PPARγ激動(dòng)劑能上調(diào)PTEN的磷酸化，進(jìn)而可能導(dǎo)致 FAK和 paxillin的磷酸化［22］。目前將 PTEN、FAK、paxillin三者一起研究的國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)甚少，而PTEN調(diào)節(jié)作為信號(hào)傳導(dǎo)重要位點(diǎn)的paxillin的表達(dá)可能還存在其他的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，但其調(diào)節(jié)機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究采用了免疫印跡及免疫熒光的方法將PTEN及paxillin聯(lián)合起來研究，證實(shí)了PTEN和paxillin都參與了胃癌的發(fā)生和發(fā)展，同時(shí)過表達(dá)PTEN和低表達(dá)paxillin影響著胃癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和轉(zhuǎn)移，然而有關(guān)PTEN對(duì)paxillin蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚，具體機(jī)制有待下一步的繼續(xù)研究。

［1］Carnero A，Blanco-Aparicio C，Renner O，et al．The PTEN/PI3K/ AKT signalling pathway in cancer，therapeutic implications［J］．Curr Cancer Drug Targets，2008，8(3):187-198．

［2］ Gupta A，Dey CS．PTEN and SHIP2 regulates PI3K/Akt pathway through adhesion kinase［J］．Mol cell Endocrinol，2009，309(1-2): 55-62．

［3］Verma A，Guha S，Wang H，et al．Tissue transglutaminase regulates focal adhesion kinase/AKT activation by modulating PTEN expression in pancreatic cancer cells［J］．Clin Cancer Res，2008，14(7): 1997-2005．

［4］Bahk YY，Cho IH，Kim TS．A cross-talk between oncogenic Ras and tumor suppressor PTEN through FAK Tyr861 phosphorylation in NIH/ 3T3 mouse embryonic fibroblasts［J］．Biochem Biophys Res Commun，2008，377(4):1199-1204．

［5］Heo JY，Kim HJ，Kim SM，et al．Embelin suppresses STAT3 signaling，proliferation，and survival of multiple myeloma via the protein tyrosine phosphatase PTEN［J］．Cancer Lett，2011，308(1):71-80．

［6］Zhiyong C，Wentong L，Xiaoyang Y，et al．PTEN’s regulation of VEGF and VEGFR1 expression and its clinical significance in myeloid leukemia［J］．Med Oncol，2011，［Epub ahead of print］．

［7］ Arafa el-SA，Zhu Q，Shah ZI，et al．Thymoquinone up-regulates PTEN expression and induces apoptosis in doxorubicin-resistant human breast cancer cells［J］．Mutat Res，2011，706(1-2):28-35．

［8］Hou G，Lu Z，Liu M，et al．Mutational analysis of the PTEN gene and its effects in esophageal squamous cell carcinoma［J］．Dig Dis Sci，2011，56(5):1315-1322．

［9］Bowen KA，Doan HQ，Zhou BP，et al．PTEN loss induces epithelialmesenchymal transition in human colon cancer cells［J］．Anticancer Res，2009，29(11):4439-4449．

［10］Heering J，Erlmann P，Olayioye MA．Simultaneous loss of the DLC1 and PTEN tumor suppressiors enhances breast cancer cell migration［J］．Exp Cell Res，2009，315(15):2505-2514．

［11］Yang LM，Wang J．The expression and clinical signification of paxillin，F(xiàn)AK and PTEN in tissue of gastric adenocarcinoma［J］．Chin J Gastroenterol，2009，14(12):734-737．

楊麗敏，王進(jìn)．Paxillin、FAK和PTEN在胃腺癌組織中的表達(dá)及臨床意義［J］．胃腸病學(xué)，2009，14(12):734-737．

［12］Nogalski MT，Chan G，Stevenson EV，et al．Human cytomegalovirusregulated paxillin in monocytes links cellular pathogenic motility to the process of viral entry［J］．J Virol，2011，85(3):1360-1369．

［13］Pollard TD，Borisy GG．Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments［J］．Cell，2003，112(4):453-465．

［14］Conway WC，Van der Voort van Zyp J，Thamilselvan V，et al．Paxillin modulates squamous cancer cell adhesion and is important in pressure-augmented adhesion［J］．J Cell Biochem，2006，98(6):1507-1516．

［15］Deakin NO，Turner CE．Distinct roles for paxillin and Hic-5 in regulating breast cancer cell morphology，invasion，and metastasis［J］．Mol Biol Cell，2011，22(3):327-341．

［16］Metalli D，Lovat F，Tripodi F，et al．The insulin-like growth factor receptor I promotes motility and invasion of bladder cancer cells through Akt-and mitogen-activated protein kinase-dependent activation of paxillin［J］．Am J Pathol，2010，176(6):2997-3006．

［17］Schaller MD．Paxillin:a focal adhesion-associated adaptor protein［J］．Oncogene，2001，20(44):6459-6472．

［18］ Zhou FZ．The developed study of cell pseudopodia in metastasis of cancer［J］．Journal of Clinical Cancer Medicine，2007，12(1):77-79．

周方正．細(xì)胞偽足與腫瘤轉(zhuǎn)移研究進(jìn)展［J］．臨床腫瘤學(xué)雜志，2007，12(1):77-79．

［19］Herlevsen M，Oxford G，Ptak C，et al．A novel model to identify interaction partners of the PTEN tumor suppressor gene in human bladder cancer［J］．Biochem Biophys Res Commun，2007，352(2): 549-555．

［20］Haier J，Nicolson GL．PTEN regulates tumor cell adhesion of colon carcinoma cells under dynamic conditions of fluid flow［J］．Oncogene，2002，21(9):1450-1460．

［21］Van Slambrouck S，Jenkins AR，Romero AE，et al．Reorganization of the integrin alpha2 subunit controls cell adhesion and cancer cell invasion in prostate cancer［J］．Int J Oncol，2009，34(6): 1717-1726．

［22］Chen Y，Wang SM，Wu JC，et al．Effects of PPAR gamma agonists on cell survival and focal adhesions in a Chinese thyroid carcinoma cell line［J］．J Cell Biochem，2006，98(4):1021-1035．