趙常玉,李 劍,張金林,王鎖民

(草地農(nóng)業(yè)系統(tǒng)國家重點實驗室 蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院,甘肅 蘭州 730020)

土壤鹽漬化嚴(yán)重影響作物產(chǎn)量，降低農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力[1]。鹽漬生境中，過多的Na+破壞植物體內(nèi)離子平衡、引起生物膜失活、新陳代謝活性下降，最終導(dǎo)致植物生長受到抑制甚至死亡[2]。Na+是土壤溶液中的大量元素，濃度范圍在0.4～150 mmol·L-1，濃度較低時，可以促進(jìn)某些植物的生長，是有益元素[3-6]，但濃度較高時，大多數(shù)植物的生長受到嚴(yán)重抑制[7-8]。K+是植物所必需的大量元素之一，與Na+有相似的水合半徑。鹽脅迫時，非選擇性陽離子通道或轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白不能將二者區(qū)分，大量Na+的吸收抑制了植物根系對K+的攝入，植物體內(nèi)K+/Na+降低，造成鹽害，因此維持細(xì)胞質(zhì)中高的K+/Na+是植物應(yīng)對脅迫的有效措施[9-10]。高親和性鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白HKT(High-affinity K+Transporter)能維持植物體內(nèi)離子平衡，增強(qiáng)植物耐鹽性。本研究就HKT蛋白的最新研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期闡述其與植物耐鹽性的關(guān)系。

1 HKT蛋白種類和特性

Schachtman和Schroeder[11]首次從小麥(Triticumaestivum)中克隆了HKT蛋白基因TaHKT2;1，其開放閱讀框(ORF)編碼534個氨基酸，分子量58.9 KD，具有10～12個跨膜區(qū)，位于第7號染色體上，原位雜交顯示TaHKT2;1主要在根皮層和葉維管組織細(xì)胞中表達(dá)。繼小麥TaHKT2;1之后，先后在擬南芥(Arabidopsisthaliana)、桉樹(Eucalyptuscamaldulensis)、水稻(Oryzasativa)、冰葉日中花(Mesembryanthemumcrystallinum)、鹽地堿蓬(Suaedasalsa)等植物中發(fā)現(xiàn)了HKT基因[12-16]，與大腸桿菌(Escherichiacoli) TrkH、超嗜熱菌(Aquifexaeolicus)KtrB、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)Trk1,2等共同構(gòu)成一個超級K+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因家族[17-18]。根據(jù)異源表達(dá)系統(tǒng)上的離子選擇性特征差異和氨基酸序列同源性分析，Platten等[19]將HKT蛋白分為兩類：第1類以擬南芥AtHKT1;1為代表，包括鹽地堿蓬SsHKT1;1、水稻OsHKT1;5和冰葉日中花McHKT1;1等，通常為Na+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，有的也能轉(zhuǎn)運(yùn)K+[13,15]；第2類以小麥TaHKT2;1為代表，包括水稻OsHKT2;1、大麥(Hordeumvulgare)HvHKT2;1等，為K+-Na+共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，雙子葉植物缺少此類蛋白基因(圖1)。HKT基因通常含有兩個內(nèi)含子，且第1類上的內(nèi)含子明顯比第2類大，而一粒小麥(Triticummonococcum)TmHKT1;4-A2只有一個內(nèi)含子[20]。這種命名法可以分析不同物種相同基因和相同物種不同基因在進(jìn)化和功能上的區(qū)別與聯(lián)系[19]。

高等植物HKT蛋白的氨基酸數(shù)目多在500個左右。有的HKT蛋白基因是單拷貝，或是一個小基因家族，通常受鹽脅迫和K+饑餓誘導(dǎo)，可以在根、莖、葉和花等不同組織中表達(dá)[21-23](表1)。拒鹽型鹽生植物小花堿茅(Puccinelliatenuiflora)PutHKT2;1在鹽脅迫時，根中表達(dá)量增加，地上部變化不大[24]，而鹽地堿蓬SsHKT1;1葉中表達(dá)量高于根中[16,21]。不同物種基因組中HKT基因數(shù)目差異很大，擬南芥只有1個AtHKT1;1[12]，而Garciadeblás等[25]在水稻品種日本晴(Nipponbare)基因組中發(fā)現(xiàn)7個可能編碼Na+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的HKT基因(另2個為假基因)。

圖1 高等植物HKT蛋白氨基酸序列同源性分析[19]Fig.1 Phylogenetic analysis of HKT proteins of higher plants[19]

2 HKT蛋白結(jié)構(gòu)與功能

Durell等[26]認(rèn)為原核生物含有1個MPM(Membrane-Pore-Membrane)，包括2個跨膜螺旋和1個P環(huán)，植物HKT蛋白由KcsA類K+通道亞基經(jīng)復(fù)制加倍及融合進(jìn)化而來，所以包含4個MPM，此模型已在小麥、水稻和擬南芥中得到證實[27-28](圖2)。HKT蛋白4個MPM高度保守，并且含有1個甘氨酸-酪氨酸-甘氨酸(GYG)基序，研究表明，HKT蛋白存在與K+和Na+選擇性吸收相關(guān)的多個位點，且多位于P環(huán)或離P環(huán)很近的區(qū)域[27]。第1類HKT蛋白第1個P環(huán)過濾器位置處有1個絲氨酸殘基，其余3個P環(huán)上為甘氨酸殘基，構(gòu)成S-G-G-G類型；第2類HKT蛋白第1個P環(huán)處的絲氨酸殘基被甘氨酸代替，其余3個P環(huán)處仍為甘氨酸殘基，構(gòu)成G-G-G-G類型，水稻OsHKT2;1例外[14,29](圖3)。

表1 部分高等植物HKT蛋白基因分子特性Table 1 Molecular characteristics of HKT of higher plants

圖2 HKT類蛋白拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)示意圖[17,27-28,34]Fig.2 Diagrammatic representation of HKT-like protein topological structure[17,27-28,34]

圖3 一些高等植物HKT的4個P環(huán)保守序列[34]Fig.3 Conservative sequences of four P-loop of higher plants[34]

Rubio等[30]認(rèn)為小麥TaHKT2;1中存在1個高親和性K+結(jié)合位點和1個高親和性Na+結(jié)合位點，Km分別為3和175 μmol·L-1。為確定這些位點，Diatloff等[31]采用定點突變和酵母(Saccharomycescerevisiae)突變體(K+吸收缺陷)異源表達(dá)方法，發(fā)現(xiàn)小麥TaHKT2;1一段16個氨基酸保守序列在Na+轉(zhuǎn)運(yùn)方面發(fā)揮著重要作用。Rubio等[32]發(fā)現(xiàn)小麥TaHKT2;1突變體N365S通過緩解對高親和性K+吸收的抑制、減少低親和性Na+吸收，從而降低酵母體內(nèi)Na+/K+，顯著提高鹽敏感型酵母(Na+ATPase缺失)的耐鹽性。Liu等[18]對小麥TaHKT2;1蛋白上可能參與K+、Na+選擇性吸收相關(guān)位點做了進(jìn)一步研究，認(rèn)為跨膜區(qū)3和4之間的高電荷P環(huán)上可能存在這些位點，環(huán)中片段L149-E180缺失后轉(zhuǎn)入酵母中，提高了酵母體內(nèi)K+/Na+，增強(qiáng)了其耐鹽性。M?ser等[29]認(rèn)為植物HKT蛋白存在4個P環(huán)，若第1個P環(huán)中過濾器處為甘氨酸殘基，通常為K+-Na+的共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；若第1個P環(huán)中過濾器處為絲氨酸殘基，通常為Na+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。擬南芥AtHKT1;1與小麥TaHKT2;1嵌合體試驗表明，在擬南芥AtHKT1;1中將Ser-68突變?yōu)楦拾彼岷蟀l(fā)現(xiàn)，增大了K+的通透性；在小麥TaHKT2;1中將Gly-91突變?yōu)榻z氨酸，K+通透性受到抑制。但第2類HKT蛋白的甘氨酸殘基并不是決定K+選擇性吸收的唯一因素，因為一些第1類HKT蛋白同樣具有K+轉(zhuǎn)運(yùn)特性，且賴氨酸和精氨酸殘基對于K+吸收可能也有作用[33]。

3 HKT與植物耐鹽性

3.1小麥HKT與其耐鹽性 Epstein等[35]認(rèn)為高等植物中存在兩個K+吸收系統(tǒng)：1)當(dāng)K+濃度較低時，主要由K+載體起作用的高親和性吸收系統(tǒng)；2)當(dāng)K+濃度較高時，主要由K+通道起作用的低親和性吸收系統(tǒng)。小麥TaHKT2;1的發(fā)現(xiàn)為此假說提供了直接證據(jù)[11]。Schachtman和Schroeder[11]采用功能互補(bǔ)法，從小麥幼根cDNA文庫中篩選到能互補(bǔ)酵母K+吸收缺陷的TaHKT2;1，其編碼蛋白對幾種單價陽離子的選擇性順序為K+>Cs+>Rb+>Na+>NH4+。Gassmann等[36]證明TaHKT2;1屬于K+-Na+同向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。當(dāng)Na+濃度較低時，介導(dǎo)兩種離子吸收；當(dāng)Na+濃度較高、K+濃度較低時，介導(dǎo)低親和性Na+吸收，K+吸收受到抑制。因此小麥TaHKT2;1的轉(zhuǎn)運(yùn)特性與外界離子情況密切相關(guān)。

Laurie等[37]將反義的TaHKT2;1轉(zhuǎn)入小麥后發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)源TaHKT2;1強(qiáng)烈下調(diào)，在100 mmol·L-1NaCl濃度下，轉(zhuǎn)基因植株22Na+內(nèi)流明顯低于對照組；在200 mmol·L-1NaCl濃度下，轉(zhuǎn)基因株系根部的Na+濃度更低，轉(zhuǎn)基因株系耐鹽性提高，由此認(rèn)為小麥TaHKT2;1在整株水平上的生理功能是介導(dǎo)Na+吸收。

小麥含有A、B和D三個基因組，硬粒小麥(T.turgidum)含有A和B兩個基因組，前者比后者具有更高的耐鹽性，因此推測小麥基因組D中可能含有耐鹽性位點[38-39]。Dubcovsky等[39]從小麥4D染色體中分離到的Kna1能控制K+和Na+向地上部選擇性運(yùn)輸，維持體內(nèi)高的K+/Na+，提高其耐鹽性。Munns等[40]從硬粒小麥耐鹽品系149中分離到兩個與Na+外排相關(guān)的位點，Nax1和Nax2。James等[41]研究表明，Nax1能夠從根木質(zhì)部和葉鞘中卸載Na+，防止Na+在葉片中過度積累，Nax2僅在根部發(fā)揮作用。Huang等[20]采用圖位克隆法從一粒小麥(T.monococcum)中分離到兩個可能的Na+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因TmHKT1;4-A1(TmHKT7-A1) 和TmHKT1;4-A2 (TmHKT7-A2)，TmHKT1;4-A2主要在根部和葉鞘中表達(dá)，參與Na+在根部和葉鞘木質(zhì)部中的卸載，被認(rèn)為是Nax1的候選基因。Byrt等[42]發(fā)現(xiàn)TmHKT1;5-A是Nax2的候選基因。

3.2擬南芥AtHKT1;1與其耐鹽性 Uozumi等[12]從擬南芥(A.thaliana)中克隆到AtHKT1;1，在非洲爪蟾卵母細(xì)胞(Xenopuslaevisoocytes)中表達(dá)分析表明，AtHKT1;1為專一的Na+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，外界K+濃度不影響其轉(zhuǎn)運(yùn)特性；擬南芥AtHKT1;1在酵母突變體G19(Na+-extruding ATPase基因缺失)中表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)G19對鹽更敏感，但小麥TaHKT2;1在G19中表達(dá)后降低了其鹽敏感性；AtHKT1;1不能互補(bǔ)酵母突變體CY162(缺失Trk1和Trk2)的K+吸收缺陷，但能使大腸桿菌(Escherichiacoli)突變體(無K+吸收功能，KAT1被點突變)LB2003在低K+培養(yǎng)基上生長。

Rus等[43]研究發(fā)現(xiàn)，AtHKT1;1的突變(athkt1-1,athkt1-2)能抑制擬南芥sos3-1(salt overly sensitive)的鹽敏感性，HKT1;1的缺失提高了sos3-1的耐鹽性，而且改善了sos3-1的缺K+表型，雙突變體sos3-1hkt1-1幼苗的耐鹽性提高，由此認(rèn)為，AtHKT1;1介導(dǎo)根部Na+吸收。但Berthomieu等[44]認(rèn)為AtHKT1;1不參與根部Na+吸收，因為突變體sas2-1(AtHKT1;1功能缺失)的Na+內(nèi)流比野生型還高20%。

Munns[45]提出假設(shè)，地上部過多的Na+隨韌皮部汁液流轉(zhuǎn)運(yùn)至根中，限制過多Na+在地上部積累對于提高植物耐鹽性非常重要。Berthomieu等[44]研究發(fā)現(xiàn)，在鹽脅迫下，突變體sas2-1韌皮部汁液中Na+的含量顯著降低，Na+在葉中大量積累，但根中Na+含量降低，定位研究表明，AtHKT1;1主要在各器官的韌皮部組織中表達(dá)，由此認(rèn)為AtHKT1;1參與Na+從地上部到根部的長距離運(yùn)輸，將地上部過多的Na+裝載到韌皮部汁液中，防止過多Na+在地上部富集。

生理學(xué)研究表明，無機(jī)離子(如K+和Na+)被裝載到根木質(zhì)部中，在蒸騰拉力作用下向上運(yùn)輸，之后被轉(zhuǎn)移到葉木質(zhì)部薄壁細(xì)胞中，接著離子在薄壁細(xì)胞中卸載，經(jīng)共質(zhì)體途徑進(jìn)入韌皮部，重新返回根中[46-49]。Sunarpi等[50]采用GUS染色和免疫定位技術(shù)證明，AtHKT1;1主要在木質(zhì)部薄壁細(xì)胞中表達(dá)，在韌皮部組織中僅有少量表達(dá)，因而提出AtHKT1;1從根木質(zhì)部汁液中卸載Na+到周圍薄壁細(xì)胞中，防止過多Na+上運(yùn)至地上部。Davenport等[51]采用22Na同位素示蹤法進(jìn)行驗證表明，AtHKT1;1主要介導(dǎo)Na+從木質(zhì)部中的卸載。M?ller等[52]將AtHKT1;1在擬南芥根中柱區(qū)域超表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，與對照相比，轉(zhuǎn)基因植株地上部Na+含量下降37%～64%，因為AtHKT1;1將更多的Na+卸載到木質(zhì)部薄壁細(xì)胞中，提高了擬南芥的耐鹽性。

AtHKT1;1對木質(zhì)部K+沒有直接調(diào)控作用。一種假設(shè)認(rèn)為，AtHKT1;1將Na+卸載到木質(zhì)部周圍薄壁細(xì)胞中，隨著Na+不斷積累，引起薄壁細(xì)胞質(zhì)膜去極化，激活外整流K+通道蛋白(KOR)或非選擇性離子外整流通道蛋白(NOR)活性，K+被裝載到木質(zhì)部向地上部運(yùn)輸[34,46,48]。Gaymard等[53]從擬南芥中分離到K+外整流通道蛋白基因AtSKOR，異源表達(dá)系統(tǒng)結(jié)果和突變體atskor試驗顯示，AtSKOR介導(dǎo)K+從木質(zhì)部薄壁細(xì)胞向木質(zhì)部的裝載。

Zhang等[54]研究表明，枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)GB03能調(diào)節(jié)AtHKT1;1在組織中的特異性表達(dá)，提高擬南芥的耐鹽性，在100 mmol·L-1鹽脅迫下，GB03上調(diào)AtHKT1;1在地上部的表達(dá)量，而根中表達(dá)量降低。認(rèn)為AtHKT1;1在鹽脅迫時根中表達(dá)量下調(diào)，可以減少Na+進(jìn)入根中，地上部表達(dá)量增加，可以使更多的Na+裝載到韌皮部中，隨韌皮部汁液運(yùn)輸?shù)礁?，降低Na+在地上部的積累，從而提高了耐鹽性。

綜上所述，當(dāng)AtHKT1;1基因被敲除后，突變體植株會隨著Na+含量的不斷升高出現(xiàn)生長緩慢，地上部嚴(yán)重萎黃[29,44,50,55-57]，說明AtHKT1;1在維持?jǐn)M南芥體內(nèi)K+和Na+穩(wěn)態(tài)平衡中發(fā)揮重要作用。

3.3水稻OsHKT與其耐鹽性 Horie等[14]在水稻中克隆到OsHKT2;1，在爪蟾卵母細(xì)胞和酵母中表達(dá)分析表明，OsHKT2;1對Na+有強(qiáng)選擇性[14,24-25]，但也介導(dǎo)K+的轉(zhuǎn)運(yùn)[58-59]，不能互補(bǔ)低K+條件下酵母突變體的K+吸收功能缺陷。

Horie等[4]研究發(fā)現(xiàn)，在缺鉀和低鹽條件下，突變體oshkt2;1與野生型相比，oshkt2;1大大降低了根部Na+內(nèi)流。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，OsHKT2;1主要在根部皮層和內(nèi)皮層表達(dá)，因此認(rèn)為OsHKT2;1可以介導(dǎo)根部有益Na+吸收，部分行使K+功能，減緩缺K+對植株的傷害。

Horie等[14]在耐鹽品種Pokkali中分離到OsHKT2;2，其與小麥和大麥HKT2;1親緣關(guān)系相近[19]，為Na+-K+共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，能互補(bǔ)低K+條件下酵母突變體的K+吸收功能缺陷，表達(dá)模式與OsHKT2;1相似，其表達(dá)受K+饑餓誘導(dǎo)。Kader等[60]研究表明，在150 mmol·L-1鹽處理下，OsHKT2;2轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，且在葉韌皮部中表達(dá)。但Garciadeblás等[25]認(rèn)為，在水稻品種日本晴和Pokkali中，OsHKT2;2都是假基因。

Ren等[28]從水稻中分離出與耐鹽相關(guān)的遺傳位點SKC1(Shoot K+Content)，候選基因為OsHKT1;5。在爪蟾卵母細(xì)胞中表達(dá)分析表明，OsHKT1;5為Na+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，主要在木質(zhì)部薄壁細(xì)胞中表達(dá)。在鹽處理條件下，根中表達(dá)量顯著高于地上部，且隨著脅迫時間的延長，根中OsHKT1;5表達(dá)量上調(diào)，而地上部變化不大。OsHKT1;5可以將過多的Na+從木質(zhì)部中卸載到周圍薄壁細(xì)胞中，降低木質(zhì)部汁液中Na+含量，防止向地上部轉(zhuǎn)運(yùn)，間接使得K+向地上部運(yùn)輸，從而提高地上部的K+/Na+，在Na+長距離運(yùn)輸過程中發(fā)揮重要作用[61-62]。

3.4其他植物HKT與其耐鹽性 Fairbairn等[13]從桉樹中分離到EcHKT1;1和EcHKT1;2，它們編碼的蛋白都能互補(bǔ)大腸桿菌突變體TK2463在缺K+條件下的K+吸收功能缺陷，在爪蟾卵母細(xì)胞中介導(dǎo)K+和Na+共轉(zhuǎn)運(yùn)。由于HKT蛋白對TEA+和Cs+不敏感，但對Ba2+非常敏感[13,25,63]，Wang等[64]研究發(fā)現(xiàn)，在25 mmol·L-1NaCl處理下，Ba2+顯著降低海濱堿蓬(S.maritima)根部Na+凈吸收和22Na+內(nèi)流，而TEA+和Cs+對其沒有影響，因此推測HKT蛋白可能介導(dǎo)海濱堿蓬在低鹽濃度下低親和性Na+吸收。Shao等[16]從鹽地堿蓬中克隆到SsHKT1;1，其表達(dá)受K+饑餓和鹽脅迫誘導(dǎo)，主要在葉中表達(dá)，根中表達(dá)量相對較少，可能參與鹽地堿蓬體內(nèi)離子穩(wěn)態(tài)平衡，對其耐鹽性有重要作用。Chen等[65]將大豆(Glycinemax)GmHKT1;1在煙草(Nicotianatabacum)中超表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，GmHKT1;1可以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因植株根和葉的K+、Na+轉(zhuǎn)運(yùn)，對離子穩(wěn)態(tài)平衡有重要影響，提高了煙草的耐鹽性。Su等[15]從冰葉日中花中克隆到McHKT1;1，其編碼蛋白在酵母中為K+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在爪蟾卵母細(xì)胞中對離子的選擇性為Rb+>Cs+>(K+=Na+=Li+)。大麥HvHKT2;1與HvHKT2;2都參與植株體內(nèi)離子穩(wěn)態(tài)平衡，與其耐鹽性也有重要關(guān)系[66-68]。耐鹽型蘆葦(Phragmitesaustralis)與鹽敏感型蘆葦相比，能維持體內(nèi)更低的Na+和更高的K+含量[69]。Takahashi等[70]從蘆葦中克隆到PhaHKT2;1-n，PhaHKT2;1-e和PhaHKT2;1-u，它們可能對維持蘆葦體內(nèi)離子穩(wěn)態(tài)平衡有重要影響。

4 展望

土壤鹽漬化危害作物生長，影響糧食產(chǎn)量。基因工程技術(shù)和分子育種對解決這一難題有重要幫助。HKT蛋白是一種與植物耐鹽性密切相關(guān)的Na+或K+-Na+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，能將植物木質(zhì)部中過多的Na+卸載到其周圍薄壁細(xì)胞中，降低地上部Na+含量，并維持體內(nèi)K+穩(wěn)態(tài)平衡?；谀壳暗难芯楷F(xiàn)狀，今后對HKT蛋白的研究應(yīng)放在以下幾點：1)通過比較甜土植物和鹽生植物的差異，探求鹽生植物耐鹽的分子機(jī)理，發(fā)掘更多的HKT基因；2)利用分子生物學(xué)技術(shù)，進(jìn)一步確認(rèn)HKT蛋白參與耐鹽的分子機(jī)制；3)采用基因工程手段，將篩選得到的HKT基因轉(zhuǎn)入到作物中，培育新的轉(zhuǎn)基因耐鹽品種，對于增強(qiáng)鹽漬生境下的糧食產(chǎn)量將具有重要的促進(jìn)作用。

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