楊 芳,涂 芳,劉 杰,鄭文杰

(1.暨南大學(xué) 化學(xué)系,廣東 廣州 510632;2.水體富營(yíng)養(yǎng)化與赤潮防治廣東省教育廳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 510632)

螺旋藻是光合自養(yǎng)的原始生物[1],屬藍(lán)藻。在藍(lán)藻中,藻膽體是由內(nèi)側(cè)中心的別藻藍(lán)蛋白與外周環(huán)繞著的藻藍(lán)蛋白通過(guò)無(wú)色多肽結(jié)合,并通過(guò)核連接蛋白使之結(jié)合到類囊體膜上,藻藍(lán)蛋白是藻膽體中主要的捕光色素,并將所捕獲的光能通過(guò)別藻藍(lán)蛋白傳給類囊體膜上的葉綠素 a進(jìn)行光合作用,因此可作為光合作用研究的材料。關(guān)于螺旋藻的譜學(xué)性質(zhì)已有一些研究報(bào)道[2],對(duì)螺旋藻中大量存在的作為光合作用色素的藻膽體的研究更是非?；钴S[3-5]。

近年來(lái),關(guān)于富硒螺旋藻的研究發(fā)現(xiàn),硒對(duì)螺旋藻具有低濃度下促進(jìn)生長(zhǎng)和高濃度下抑制生長(zhǎng)的雙重生物效應(yīng)。而硒進(jìn)入藻體的分布主要集中于藻膽體中的藻藍(lán)蛋白,因而推測(cè)硒主要是通過(guò)對(duì)藻膽體的作用而產(chǎn)生生物效應(yīng)的。碲與硒同為硫?qū)僭?它們具有極為相似的化學(xué)性質(zhì)。本課題組的研究表明,無(wú)機(jī)碲(Na2TeO3)和無(wú)機(jī)硒(Na2SeO3)一樣,同樣可被酵母菌吸收轉(zhuǎn)化為碲代(硒代)氨基酸并摻入到蛋白質(zhì)中[6];碲對(duì)螺旋藻同樣表現(xiàn)出低濃度下的促進(jìn)以及高濃度的抑制作用[7-9]。微藻是否能對(duì)無(wú)機(jī)碲進(jìn)行生物有機(jī)化作用,以及碲在生物體中是否具有獨(dú)特的生物功能,這些均是人們感興趣的問(wèn)題?？紤]到碲和硒一樣進(jìn)入螺旋藻后主要作用于藻膽體,以及藻膽體獨(dú)特的光譜性質(zhì),推測(cè) Te(IV)脅迫可能對(duì)螺旋藻產(chǎn)生一定的光譜效應(yīng)。因此,作者試圖通過(guò)研究Te(IV)脅迫下螺旋藻的一些光譜學(xué)特性變化,探索環(huán)境脅迫因子對(duì)螺旋藻生物效應(yīng)的光譜學(xué)方法。

1 材料和方法

1.1 藻種

螺旋藻(Spirulina maxima)由暨南大學(xué)水生生物研究所藻種室提供。本實(shí)驗(yàn)室保種。

1.2 儀器

PYX-800G-A型光照培養(yǎng)箱;752型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì);TU-1901型雙光束紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì);CRT970熒光分光光度計(jì);美國(guó)VARIAN熒光分光光度計(jì)(1500W氙燈作光源)。

1.3 培養(yǎng)條件和方法

250 mL三角燒瓶中加入100 mL Zarrouk標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基,接種螺旋藻并調(diào)節(jié)光吸收值A(chǔ)560nm= 0.10,溫度30℃,初始pH值8.5,光照強(qiáng)度4 000 lx,光周期光:暗為14 h:10 h,每天定時(shí)搖動(dòng)3～5次,并添加蒸餾水補(bǔ)充水分蒸發(fā)。

1.4 Te(IV)脅迫實(shí)驗(yàn)

按表1添加 Te(IV)儲(chǔ)備液(以 Na2TeO3配制,按Te計(jì)量。儲(chǔ)備液Te(IV)質(zhì)量濃度:10 g/L)。表1括號(hào)中的數(shù)據(jù)為Te(IV)的累積量(mg/L)。

表1 各試驗(yàn)組中Te(IV)的添加時(shí)間和質(zhì)量濃度Tab 1 Adding time and concentration of Te (IV)

1.5 生物量的測(cè)定

每天同一時(shí)間在 752分光光度計(jì)上于波長(zhǎng) 560 nm處測(cè)定螺旋藻的吸光度(A560),重復(fù)3次取平均值,以示螺旋藻的生長(zhǎng)情況。將培養(yǎng)到第12天的藻液用300目濾布過(guò)濾,等滲 NaCl鹽水沖冼后冷凍干燥,稱量。以干藻粉的質(zhì)量與藻液的體積之比(mg/L)代表螺旋藻最終的生物量。

1.6 活藻體吸收光譜、熒光光譜測(cè)定及紅外光譜測(cè)定

離心收集培養(yǎng)至第10天的藻,用等滲NaCl鹽水反復(fù)洗滌后立即重新懸浮于等滲NaCl鹽水中。調(diào)節(jié)A560為 0.2。以等滲 NaCl鹽水為空白,于 TU-1901型紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)上測(cè)定螺旋藻活體吸收光譜,掃描范圍為400～750 nm。于970CRT熒光分光光度計(jì)上室溫下測(cè)定螺旋藻活體的熒光光譜。將生長(zhǎng)至12 d的藻液用300目濾布過(guò)濾,等滲NaCl鹽水沖洗后,冷凍干燥,得螺旋藻干粉,進(jìn)行固體熒光及紅外光譜測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同質(zhì)量濃度 Te(IV)脅迫對(duì)螺旋藻生長(zhǎng)的影響

各實(shí)驗(yàn)組螺旋藻生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖1,由于在第9天后A560值的測(cè)定受到儀器測(cè)定范圍限制,螺旋藻的生長(zhǎng)情況用最終生物量表示,結(jié)果見(jiàn)圖2。從圖1可見(jiàn)施加Te(IV)脅迫的第3天(即接種的第7天)即可觀察到 Te(IV)產(chǎn)生較為明顯的生物效應(yīng),至 Te(IV)脅迫的第5天(即接種的第9天)則觀察到碲脅迫實(shí)驗(yàn)組的A560nm值明顯低于對(duì)照組,因此有抑制作用。從圖2可見(jiàn)藻的最終生物量呈現(xiàn)有規(guī)律的遞減。對(duì)照組的最終生物量為1 213 mg/L,碲脅迫實(shí)驗(yàn)組中,藻的生長(zhǎng)明顯受到抑制并呈劑量效應(yīng)。同時(shí)還觀察到高濃度的Te(IV)脅迫下有部分藻絲嚴(yán)重?cái)嗔选?/p>

在Te (IV)脅迫下的螺旋藻培養(yǎng)液散發(fā)出一種強(qiáng)烈刺激性的氣體。初步判斷為藻細(xì)胞對(duì)無(wú)機(jī)碲吸收、代謝轉(zhuǎn)化為有機(jī)碲的氣態(tài)小分子化合物,這和富硒螺旋藻培養(yǎng)時(shí)情況相似[10],也說(shuō)明了螺旋藻對(duì)硒、碲的吸收代謝情況相似,本課題組曾觀察到酵母菌吸收無(wú)機(jī)碲后可以將無(wú)機(jī)碲轉(zhuǎn)化為碲氨基酸(碲代蛋氨酸)并摻入到蛋白質(zhì)中[6],那么微藻是否也能把無(wú)機(jī)碲轉(zhuǎn)化？或者碲是否如同硒一樣,在生物體具有特定的生物功能？將是很有意義的研究課題。

圖1 螺旋藻的生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curves of Spirulina maxima

圖2 螺旋藻最終生物量Fig.2 Final biomass of Spirulina maxima

2.2 UV-Vis吸收光譜變化

圖3為螺旋藻活藻體的吸收光譜。從圖3可見(jiàn),對(duì)照組藻液的特征吸收峰清晰,其中440 nm和680 nm處分別為葉綠素 a在藍(lán)光區(qū)和紅光區(qū)的吸收峰,490 nm處的肩峰為類胡蘿卜素的吸收峰,630 nm附近為藻藍(lán)蛋白的吸收峰(通常在620 nm)。Te(IV)脅迫組吸收峰的強(qiáng)度相對(duì)于對(duì)照組發(fā)生了明顯的變化,其中在680 nm處的吸收峰強(qiáng)度明顯減弱,而在440、620 nm處幾乎觀察不到特征吸收峰。說(shuō)明Te(IV)脅迫使藻體中葉綠素和藻藍(lán)蛋白遭到損傷從而導(dǎo)致對(duì)可見(jiàn)光的吸收減弱。

圖3 螺旋藻活藻體懸浮水溶液的吸收光譜Fig.3 Absorption spectra of aqueous suspension of Spirulina maxima

2.3 活藻體室溫?zé)晒夤庾V變化

2.3.1 熒光發(fā)射光譜

圖4為螺旋藻活藻體分別在440、490、580 nm處激發(fā)所得的發(fā)射光譜圖。當(dāng)用440 nm的光激發(fā)時(shí),在680 nm有強(qiáng)的發(fā)射峰,在725 nm處有一肩峰,是葉綠素 a的發(fā)射峰,各實(shí)驗(yàn)組的相對(duì)熒光強(qiáng)度比值F680:F725大約都為1.4。用490 nm的光激發(fā)時(shí),觀察到來(lái)自光732 nm的強(qiáng)熒光發(fā)射峰,同時(shí)還有較弱的660、680nm的熒光發(fā)射峰。用580 nm的光激發(fā)時(shí),觀察到藻膽體的熒光發(fā)射峰 (660 nm)。

從圖4可見(jiàn) Te(IV)脅迫試驗(yàn)組的熒光發(fā)射峰較對(duì)照組沒(méi)有發(fā)生位移,但強(qiáng)度發(fā)生了變化,在 440、580 nm處激發(fā)時(shí),其發(fā)射峰強(qiáng)度隨Te(IV)濃度增大而減弱。說(shuō)明在Te(IV)脅迫下,活藻體的葉綠素?fù)p傷加劇,并導(dǎo)致葉綠素及藻膽體的能量傳遞均有所降低。然而以490 nm處的光激發(fā)時(shí),幾組Te(IV)脅迫組在732 nm處的發(fā)射峰強(qiáng)度接近,但均比對(duì)照組要高,表明在Te(IV)脅迫下,類胡蘿卜素吸收的能量較多地傳遞到732 nm處。

圖4 螺旋藻活藻體懸浮水溶液分別在激發(fā)波長(zhǎng)440、490、580 nm處的熒光發(fā)射光譜Fig.4 Fluorescence emission spectra of Spirulina maxima aqueous suspension excited at 440,490 and 580 nm

2.3.2 熒光激發(fā)光譜

圖5為螺旋藻活藻體分別在660、680、732 nm處記錄到的激發(fā)光譜圖。由圖可知,各實(shí)驗(yàn)組的激發(fā)峰均在600 nm和625 nm時(shí)出現(xiàn)強(qiáng)峰,強(qiáng)度比F600:F625隨Te(IV)脅迫增大而下降。由于藻藍(lán)蛋白單體由α和β亞基構(gòu)成,其中α亞基只含 1個(gè)發(fā)色團(tuán)(藻藍(lán)膽素,PCB),β亞基含2個(gè)PCB發(fā)色團(tuán),分別具有不同的吸收峰。圖中相對(duì)熒光強(qiáng)度比值F600:F625逐漸下降,可能是由于藻藍(lán)蛋白的α亞基的 PCB發(fā)色團(tuán)對(duì)Te(IV)脅迫更為敏感。從而使其在600 nm的激發(fā)減弱。這說(shuō)明 Te(IV)脅迫導(dǎo)致藻細(xì)胞中作為主要捕光體的藻藍(lán)蛋白受損傷,從而致使其捕光能力隨Te(IV)脅迫強(qiáng)度增大而下降。但以732 nm為記錄觀察激發(fā)峰時(shí),在494 nm處有強(qiáng)的激發(fā),強(qiáng)度均比對(duì)照組的峰強(qiáng)。這與熒光發(fā)射光譜觀察結(jié)果是相對(duì)應(yīng)的,即在490～494 nm激發(fā)時(shí),其能量高效率地傳遞到732 nm處。以上觀察結(jié)果表明Te(IV)脅迫下,在一定程度上改變了活藻體中藻膽體的結(jié)構(gòu),從而改變?cè)迥戵w中的能量傳遞作用。

2.4 干藻粉的固體熒光光譜

螺旋藻經(jīng)凍干處理后,藻體失水,同時(shí)經(jīng)受一系列損傷而死亡,干藻粉中的光系統(tǒng)已停止工作。干燥脅迫下的環(huán)境因子可能導(dǎo)致藻類的生理發(fā)生變化。因此,試圖通過(guò)比較各試驗(yàn)組干藻粉的固體熒光來(lái)探討干燥脅迫對(duì)藻類光合作用的影響,觀察藻細(xì)胞中水分在維持生物分子構(gòu)象、能量的捕獲和傳遞中的作用,能夠?yàn)槁菪逶诟稍锃h(huán)境的耐受力與細(xì)胞修復(fù)能力提供一些參考。由于干燥失水狀況的不同,導(dǎo)致干藻粉的固體熒光譜圖變化較為復(fù)雜。但對(duì)譜圖變化情況的分析討論仍是有意義的。

圖5 螺旋藻活藻體懸浮水溶液分別在發(fā)射波長(zhǎng)660、680、732 nm處的熒光發(fā)射光譜Fig.5 Fluorescence excitation spectra of Spirulina maxima aqueous suspension emited at 660,680 and 732 nm

2.4.1 熒光發(fā)射光譜

圖6為螺旋藻干粉分別在440、490、580 nm處激發(fā)所得的發(fā)射光譜圖。與活藻體懸浮水溶液的發(fā)射光譜圖相比,發(fā)射峰形有所變寬。440 nm激發(fā)時(shí),對(duì)照組相對(duì)熒光強(qiáng)度比值F680:F725大約為 0.7。但Te(IV)脅迫組其F680:F725卻高于或約等于 1。在490 nm的激發(fā)所得發(fā)射光譜與其活藻體懸浮水溶液相比有很大差異,732 nm的銳峰鈍化成不易指認(rèn)的譜峰,對(duì)照組的發(fā)射峰在720 nm左右,Te(IV)脅迫下觀察不到有發(fā)射峰。在以580 nm處為激發(fā)時(shí),發(fā)射峰由725移至700 nm左右,對(duì)照組在656 nm處有一小峰。高強(qiáng)度Te(IV)脅迫組在656 nm處無(wú)法指認(rèn)出譜峰。

圖6中490 nm的熒光發(fā)射光譜表明,螺旋藻干粉中類胡蘿卜素向活性中心的能量傳遞幾乎完全停止,580 nm的熒光發(fā)射光譜上,對(duì)照組與各Te(IV)脅迫組間有顯著的差別,Te(IV)脅迫組的螺旋藻干粉725 nm處的熒光發(fā)射峰藍(lán)移且發(fā)光強(qiáng)度下降(725移到700 nm),這表明細(xì)胞中藻藍(lán)蛋白由于失水,聚集狀態(tài)可能發(fā)生了改變。

圖6 螺旋藻干粉分別在激發(fā)波長(zhǎng)440、490、580 nm處的熒光發(fā)射光譜Fig.6 Fluorescence emission spectra of Spirulina maxima powder excited at 440,490 and 580 nm

2.4.2 熒光激發(fā)光譜

圖7為螺旋藻干粉在不同發(fā)射波長(zhǎng)處所記錄到的激發(fā)光譜圖。Te(IV)脅迫組幾乎觀察不到激發(fā)峰,故圖中未顯示。圖7觀察到645 nm處激發(fā)峰,與活藻體的激發(fā)光譜圖相比,干藻粉中沒(méi)有觀察到藻藍(lán)蛋白的發(fā)射峰,受激發(fā)的主要是別藻藍(lán)蛋白,且吸收光子的能力隨 Te(IV)脅迫強(qiáng)度增大而降低。在藍(lán)藻中,藻藍(lán)蛋白和別藻藍(lán)蛋白通過(guò)無(wú)色多肽連接而成藻膽體,這說(shuō)明在干粉狀態(tài)下,藻膽體已經(jīng)發(fā)生解離,藻藍(lán)蛋白吸收光子的能力減弱,主要是別藻藍(lán)蛋白吸收光子。Te(IV)脅迫組的別藻藍(lán)蛋白吸收光子的能力下降,提示 Te(IV)脅迫可能也導(dǎo)致別藻藍(lán)蛋白分子損傷或?qū)е缕渚奂癄顩r發(fā)生變化。

螺旋藻的 Te(IV)脅迫組與對(duì)照組的紅外光譜圖均在3 400、2 930、1 650cm–1左右出現(xiàn)吸收峰,兩者在紅外光譜上沒(méi)有明顯的差異,在此不展開(kāi)討論。比較圖4～圖7,可知活藻體懸浮水溶液和干藻粉的熒光光譜有很大的差異?；钤弩w中 Te(IV)脅迫實(shí)驗(yàn)組的葉綠素a及藻膽體的能量傳遞降低。在干藻粉中,類胡蘿卜素的能量傳遞系統(tǒng)幾乎停滯,藻膽體的能量傳遞受阻。說(shuō)明干藻粉仍可反映 Te(IV)脅迫所產(chǎn)生的影響,且頗為敏感,這提示干藻粉的熒光光譜將可為藻粉質(zhì)量的鑒定提供有用的依據(jù)。

圖7 螺旋藻干粉分別在發(fā)射波長(zhǎng)725、705、700 nm處記錄的熒光激發(fā)光譜Fig.7 Fluorescence excitation spectra of Spirulina maxima powder emited at 725,705 and 700 nm

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