王春雨，遲乃玉*，張慶芳

（大連大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116622）

低溫脂肪酶具有高效、耐熱、作用周期短等優(yōu)勢，在應(yīng)用上具有中高溫脂肪酶無法取代的優(yōu)越性，因此低溫脂肪酶廣泛的應(yīng)用在食品、輕紡、皮革、香料、化妝品、洗滌劑、有機(jī)合成、醫(yī)藥等領(lǐng)域上。國外研究者對其中幾種典型的脂肪酶如來源于Candida rugosa[6]、Candida antarcticaA[7]、CandidaantarcticaB[8]、Rhizomucor miechei[9]、Thermomyces lanuginosus[10]的脂肪酶的應(yīng)用進(jìn)行了詳細(xì)的綜述，這些脂肪酶在油脂加工和食品工業(yè)、壽星藥物合成、生物能源、醫(yī)藥和化妝品等行業(yè)顯示出良好的前景。相比于國外，國內(nèi)目前只有作為洗滌劑的堿性脂肪酶，而酯化或轉(zhuǎn)酯化用的脂肪酶還是空白。

本文從大連大黑山和渤海灣采樣，篩選產(chǎn)低溫脂肪酶的菌株，并對其產(chǎn)酶條件進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 土樣來源

渤海灣海水和大連大黑山土樣。

1.2 培養(yǎng)基

Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基[11]：胰蛋白胨1.0%，酵母提取物0.5%，NaCl 1.0%，瓊脂1.5%，pH7.0。

初篩培養(yǎng)基：蛋白胨1.0%，酵母粉0.5%，NaCl 0.5%，CaCl20.02%，Tween80 1.0%，pH7.2。

發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母膏0.5%，（NH4）2SO40.5%，KH2PO40.2%，NaCl 0.3%，MgSO4·7H2O 0.05%，橄欖油2%（v/v），pH7.0。

在教學(xué)中，建立關(guān)系的前提是師生之間發(fā)生交流和交往，但現(xiàn)在的許多課堂，只是單向的教師講授、學(xué)生接收。教師的注意力主要在“教”，沒有注意到在“教”的過程中與學(xué)生發(fā)生交流和交往，建立某種超越客觀知識的情感關(guān)系。我試圖強(qiáng)調(diào)的是，在“教”的過程“之中”發(fā)生了什么。當(dāng)前，我們沒有很好地區(qū)別什么是教師關(guān)注自己的教學(xué)本身，什么是關(guān)注教學(xué)“之中”發(fā)生的事情。這個區(qū)別不是特別明顯，但同時這個區(qū)別又是巨大的。

牛肉膏蛋白凍培養(yǎng)基：牛肉膏0.3%，蛋白胨1.0%，Na-Cl 0.5%，瓊脂1.8%，pH7.0。

1.3 產(chǎn)低溫脂肪酶菌株的初篩

樣品稀釋至10-7后，接種于初篩培養(yǎng)基平板上，20℃培養(yǎng)4d。產(chǎn)脂肪酶的菌株能分解Tween80在菌落周圍形成白色沉淀圈。將產(chǎn)生白色沉淀圈的菌株活化后，分別接種于初篩培養(yǎng)基平板上，記錄菌落直徑與沉淀圈直徑之比。

1.4 產(chǎn)低溫脂肪酶菌株的復(fù)篩

將待測菌株活化后，接種于種子液中，20℃、160r/min培養(yǎng)12h，轉(zhuǎn)接于100mL發(fā)酵液中，20℃、160r/min培養(yǎng)2d，測其酶活。

1.5 產(chǎn)低溫脂肪酶菌株的紫外誘變

選出一株菌落直徑與沉淀圈直徑之比和酶活最大的菌株，將其制成種子液，在20℃、160r/min培養(yǎng)12h。把菌液稀釋到適當(dāng)梯度，置于磁力攪拌器上，在紫外燈的功率15W，照射的距離為30cm的條件下，照射不同時間進(jìn)行紫外誘變。分別吸取不同照射時間的稀釋液均勻涂布到初篩培養(yǎng)基上，裝入黑布袋中，倒置于恒溫箱中，在20℃培養(yǎng)3d，取出計算菌落數(shù)，并觀察白色沉淀圈。

1.6 脂肪酶活性測定方法

取3mL 50mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH值為7.0）和1mL橄欖油，放入水浴恒溫磁力攪拌37℃中預(yù)熱5min，加入0.1mL酶溶液，磁力攪拌10min，立即加入8mL笨，繼續(xù)攪拌2min，終止反應(yīng)，同時萃取生成的脂肪酸。將溶液轉(zhuǎn)移至離心管中，4000r/min離心10min，有機(jī)相和水相分離澄清。取上層有機(jī)相4mL于小錐形瓶中，加入1mL顯色劑，磁力攪拌上攪拌3min，4000r/min離心10min，取上層含有脂肪酸銅的苯溶液，用分光光度計在波長710nm處測OD值。

由脂肪酶活力定義得活力計算公式：脂肪酶活力（單位/mL）=CV/TV’，公式中C脂肪酶的濃度（μmol/mL）；V脂肪酸/苯溶液的體積（mL）；T作用時間（min）；V’酶液的用量（mL）。

1.7 產(chǎn)脂肪酶菌株的鑒定

1.7.1 形態(tài)學(xué)、生理生化特征

產(chǎn)脂肪酶菌株的形態(tài)學(xué)觀察、生理生化實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[12]方法進(jìn)行。

1.7.2 16SrDNA序列測定和分析

以菌株CZWOO1總DNA為模板，利用真細(xì)菌的16SrDNA通用引物進(jìn)行PCR，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，得到一條1.5bp左右的條帶（見圖1）。以Seq Forward、Seq Internal和16SSeqF1為引物進(jìn)行DNA測序。序列分析結(jié)果表明，菌株CZWOO1的16SrDNA序列得到有效擴(kuò)增，其大小為1429bp。進(jìn)入NCBI主頁，應(yīng)用BLAST程序與數(shù)據(jù)庫中的已有細(xì)菌16S rDNA序列進(jìn)行相似性比較分析。利用ClustalX1.83進(jìn)行匹配比對，然后用MEGA5.05軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

圖1 3%瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 3% Agarose gel electrophoresis

2 結(jié)果

2.1 菌種篩選

從59株來自大連大黑山土樣和渤海灣海水的細(xì)菌中篩選到10株產(chǎn)低溫脂肪酶的菌株，其中以菌株007的直徑比最大且酶活最高，其酶作用溫度最低（25℃）。對該菌株進(jìn)行紫外誘變，當(dāng)誘變130s時，致死率達(dá)到90.7%，得到一株直徑比和酶活明顯高于原菌株的菌株，命名為CZWOO1。

2.2 菌種鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)、生理生化特征

菌株CZWOO1在LB培養(yǎng)上20℃培養(yǎng)3d，菌落乳白色、圓形、隆起、不透明、表面光滑、濕潤、邊緣整齊，直徑約0.9cm。菌體革蘭氏陰性、短桿狀。常規(guī)生理生化特征見表1。

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定

序列分析結(jié)果表明，菌株CZWOO1的16SrDNA序列全長為1429bp。將序列輸入GenBank進(jìn)行BLAST相似度比較，下載相似度序列，利用ClustalX進(jìn)行多序列匹配比對，通過MEGA5.05軟件計算出序列的系統(tǒng)進(jìn)化距離，采用Neighbor-Joining構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（見圖2）。菌株CZWOO1與Bacillusthuringiensis（NR 043403.1）親緣關(guān)系最近，同源性達(dá)到100%，因此菌株CZWOO1屬于芽孢桿菌屬中的蘇云金芽孢桿菌，命名為BacillusthuringiensisCZWOO1。

2.3 脂肪酶的分離純化及二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

表1 菌株CZWOO1 生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characteristics of the strain CZWOO1

圖2 菌株CZWOO1基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic trees for 16S rDNA sequence of CZWOO1

蘇云金芽孢桿菌CZW001脂肪酶發(fā)酵上清經(jīng)65%硫酸銨沉淀，用0.05mol/LTis-Hcl緩沖液（pH8.2）溶解，并用相同的緩沖液4℃透析12h獲得粗酶液。經(jīng)截留分子量為10ku的中空纖維柱超濾濃縮，將濃縮液加到預(yù)先用Tis-Hcl緩沖液（0.05mol/L pH8.2）平衡好的DEAE-纖維素-52層析柱（Φ1.6×30cm）上，用250mL 0～1mol/L的NaCl線性梯度洗脫。利用平板定性檢測脂肪酶活性，收集含脂肪酶各管，測定其酶活，合并含酶活各管。將樣品過Sephadex G-100（Φ1.6×50cm）柱，用0.05mol/L Tis-Hcl緩沖液（pH8.2）洗脫，收集有酶活性部分，結(jié)果見圖3。蛋白曲線呈現(xiàn)一個小峰和一個大峰，而低溫脂肪酶酶組分主要集中在大峰內(nèi)，25管～45管范圍內(nèi)的蛋白峰酶活性比較高，說明Sephadex G-100凝膠柱已經(jīng)除去了一部分高分子量和低分子量的蛋白，將目的酶蛋白同其他雜蛋白分離開來。

蘇云金芽孢桿菌CZW001脂肪酶發(fā)酵上清液經(jīng)硫酸銨沉淀、超濾離心、DEAE-纖維素-52離子交換層析和Sephadex G-100凝膠過濾層析等純化步驟，脂肪酶純化倍數(shù)為75.5倍，活性回收率為37.6%。其中DEAE-纖維素-52離子交換層析效果最佳，僅此一步就純化了56倍（純化效果見表2）。SDS-PAGE凝膠電泳[9]顯示純化后的脂肪酶為單一條帶（見圖4），分子量約為40ku。純化倍數(shù)為75.5倍，活性回收率為37.6%，跑12%SDS-PAGE電泳為單一條帶（見圖4），分子量約為40ku。

對多次分離純化的低溫脂肪酶進(jìn)行圓二色譜分析，見圖5。用Jascow32軟件分析及Yang-chen公式計算其二級結(jié)構(gòu)成分：α-螺旋10.6%，β-折疊40.1%，β-轉(zhuǎn)角18.8%，無規(guī)則卷曲30.5%。

圖3 Sephadex G-100 凝膠過濾Fig.3 Gel filtration chromatogram of Sephadex G-100

表2 脂肪酶的純化Table 2 Purification of Bacillus thuringiensis CZWOO1 lipase

圖4 12%SDS-PAGE電泳圖Fig.4 12% SDS-PAGE of enzyme solution

圖5 低溫脂肪酶圓二色譜圖Fig.5 The CD spectrum of cold-active amylase

2.4 脂肪酶性質(zhì)

2.4.1 pH值對CZWOO1脂肪酶活力的影響

在30℃、不同pH值條件測定菌株CZWOO1脂肪酶活力，結(jié)果見圖6。該酶的適宜作用pH值范圍在7～9，最適pH值為8。

圖6 p H值對CZWOO1脂肪酶活力的影響Fig.6 Effects of pH value on lipase activity of CZWOO1

2.4.2 溫度對CZWOO1脂肪酶活力的影響

圖7 溫度對CZWOO1脂肪酶活力的影響Fig.7 Effects of temperature on lipase activity of CZWOO1

在pH8.0條件下，測定10℃～45℃溫度范圍酶活力與溫度的關(guān)系，結(jié)果見圖7。CZWOO1脂肪酶活力在25℃達(dá)到最高，在10℃是仍具有較高的酶活，相對酶活達(dá)到38%。

2.4.3 溫度對CZWOO1脂肪酶穩(wěn)定性的影響

將酶液在不同溫度中保溫30min，在25℃、pH8.0條件下，測定CZWOO1脂肪酶殘余活力。結(jié)果見圖8，CZWOO1脂肪酶穩(wěn)定性較差，在60℃處理30min，酶活損失達(dá)70%。

圖8 溫度對CZWOO1脂肪酶穩(wěn)定性的影響Fig.8 Effects of temperature on lipase stability of CZWOO1

3 討論

菌株CZWOO1為革蘭氏陰性短桿菌，兼性厭氧，不能水解淀粉、明膠、纖維素和尿素，能水解油脂，使阿拉伯糖、木糖和甘露糖產(chǎn)酸，吲哚和檸檬酸鹽試驗(yàn)陰性。從菌株CZWOO1基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹看，菌株CZWOO1與Bacillus thuringiensis（NR 043403.1）親緣關(guān)系最近，同源性達(dá)到100%，因此菌株CZWOO1屬于芽孢桿菌屬中的蘇云金芽孢桿菌，命名為BacillusthuringiensisCZWOO1。

蘇云金芽孢桿菌CZW001脂肪酶發(fā)酵上清液經(jīng)硫酸銨沉淀、透析、超濾離心、DEAE-纖維素-52離子交換層析和Sephadex G-100凝膠過濾層析得到電泳純的脂肪酶，跑12%SDS-PAGE電泳為單一條帶，分子量約為40ku。對純化后的低溫脂肪酶進(jìn)行圓二色譜分析，結(jié)果表明，其二級結(jié)構(gòu)成分：α-螺旋10.6%，β-折疊40.1%，β-轉(zhuǎn)角18.8%，無規(guī)則卷曲30.5%。對該脂肪酶二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測給其適冷機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。

對BacillusthuringiensisCZW001分泌的脂肪酶的初步研究表明，該脂肪酶的適宜作用pH值范圍在7～9，最適pH值為8，最適作用溫度為25℃，對熱敏感，60℃處理30min僅殘留30%酶活性。該低溫脂肪酶在低溫下具有良好的催化活性，作用pH值偏堿性（pH7～9）等特點(diǎn)，應(yīng)在環(huán)境治理、洗滌業(yè)等領(lǐng)域有著良好的應(yīng)用前景，并且其對熱敏感等特點(diǎn)，從而避免高溫滅活對食品品質(zhì)產(chǎn)生的破壞，在食品工業(yè)也有良好的應(yīng)用潛力。

[1]QU YEN D T,SCHMIDT-DANNERT C,SCHMID RD.High-level expression of alipasefromBacillusthermocatenulatusBT L2 inPichia pastorisand some properties of the recombinant lipase[J].Prot Expr Pur,2003,28(1):102-110.

[2]林學(xué)政，邊 際，何培青.極地微生物低溫適應(yīng)性的分子機(jī)制[J].極地研究，2003，15（1）：75-82.

[3]RASHID N,SHIMADA Y,EZAKIS,et al.Low-temperature lipase from psychrotrophicPseudomonassp strain KB700A[J].Appl Environ Microb,2001,67(9):4064-4069.

[4]LEEHK,AHNMJ,KWAK SH,et al.Purification and characterization of cold active lipase from psychrotrophicAeromonassp.LPB 4[J].J Microbiol,2003,41(1):22-27.

[5]TRIPATHIM K,ROY U,JINWAL U K,et al.Cloning,sequencing and structural features of a novelStreptococcuslipase[J].Enzyme Microb Technol,2004,34(5):437-445.

[6]BENJAMIN S,PANDEY A.Candida rugosalipases:molecular biology and versatility in biotechnology[J].Yeast,1998,14:1069-1087.

[7]DOMINGUEZ DE M P,CARBONI-OERLEMANS C,TUIN B,et al.Biotechnological applications ofCandida antarcticalipase A:stateof the art[J].J Mol Catal B:Enzym,2005,37:36-46.

[8]ANDERSON E M,LAARSSON K M,KIRK O.One biocatalyst many applications:theuseofCandidaB-lipaseinorganic synthesis[J].Biocatal Biotransf,1998,16:181-204.

[9]RODRIGUE S R C,FERNANDEZ-LAFUENTE R.Lipase fromRhizomucor mieheias an industrial biocatalyst in chemical process[J].J Mol Catal B:Enzyme,2010.

[10]FERNANDEZ-LAFUENTER.Lipase fromThermomyces lanuginosus:usesand prospectasan industrial biocatalyst[J].J Mol Catal B:Enzym,2009,62(3):197-212.

[11]SAMBROOK J,FRISH E F,MANIATIS T.Molecular.Molecular Cloning：Alaboratory Manual[M].Second Edition.New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989.

[12]東秀珠，蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊[M].北京：科學(xué)出版社，2001.