何丁文，鄔亞華，殷 明，魏強強，殷嫦嫦

(1南昌大學第二附屬醫(yī)院，南昌330006;2九江學院)

骨髓間充質干細胞(BMSCs)是來源于中胚層的具有自我更新和多向分化潛能的成體干細胞之一，不僅可分化成中胚層來源的多種細胞，如骨細胞、成骨細胞、脂肪細胞等，且可分化成內皮細胞［1］、神經細胞［2］及內胚層來源的細胞［3］，此外BMSCs具有特殊的免疫逃避及抑制特性［4］，可用于異體移植，隨著干細胞治療臨床應用的興起，BMSCs已成為重要種子細胞來源，在臨床可用于創(chuàng)傷后神經修復、軟骨損傷修復、細胞替代治療等，是最具臨床應用前景的干細胞之一。體外獲取、分離及純化BMSCs是干細胞治療的關鍵環(huán)節(jié)。2012年1～3月，我們比較了普通、高純度胎牛血清培養(yǎng)基及塑料瓶、玻璃瓶體外培養(yǎng)全骨髓貼壁法分離的骨髓間充質干細胞的效果，旨在建立一種簡便、有效、穩(wěn)定的BMSCs分離培養(yǎng)體系。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康4周齡SD大鼠6只，雌雄不限，由南昌大學動物科學部提供，實驗過程中對動物的處置符合2006年科技部《關于善待實驗動物的指導性意見》的規(guī)定。

1.1.2 主要試劑和儀器設備 DMEM、0.25%胰蛋白酶－EDTA消化液、標準胎牛血清、PBS粉、DMSO (Solarbio公司)，DMEM/F12(HyClone公司)，高純度胎牛血清(GIBCO公司，南美產)，一次性塑料培養(yǎng)瓶(CORNING公司)，CO2恒溫孵育箱(SIM公司)，超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司)，倒置相差顯微鏡及照相系統(NIKON公司)。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs分離培養(yǎng) 將健康4周齡SD大鼠乙醚麻醉后頸椎脫臼法處死，75%乙醇浸泡10 min，將SD大鼠轉入超凈臺內，無菌條件下取雙側股骨、脛骨、肱骨、尺橈骨，徹底清除附著其上的肌肉組織，去除兩端骨骺，暴露骨髓腔，5 mL無菌注射器抽取PBS液反復沖洗骨髓腔至骨髓腔變白，吹打離散細胞，將沖洗液收集于離心管中，1000 r/min離心5 min，棄去上清及脂肪，加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液6～7 mL，重懸細胞種植于100 mL培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2、飽和濕度下培養(yǎng)，3 d后首次更換培養(yǎng)液，去除未貼壁細胞，以后每3 d換液1次，第7～10天傳代。

1.2.2 BMSCs傳代及純化 倒置顯微鏡下觀察待貼壁細胞融合達90%時，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化貼壁細胞，鏡下觀察見細胞變圓且部分脫落時加入等量培養(yǎng)液終止消化，吸管反復吹打，液體轉移至無菌離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄去上清夜，培養(yǎng)液5～6 mL重懸成單細胞懸液，按1∶2或1∶3傳代，細胞隨著換液和傳代逐漸純化。

1.2.3 BMSCs分組培養(yǎng)及培養(yǎng)效果觀察 分為4組。其中2組分別采用含10%標準胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基、含10%高純度胎牛血清的DMEM/ F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，分別為標準胎牛血清組和高純度胎牛血清組。2組分別用一次性塑料瓶和玻璃瓶培養(yǎng)，分別為塑料瓶組和玻璃瓶組。培養(yǎng)過程中采用倒置顯微鏡在100倍視野下觀察并比較比較標準胎牛血清組合高純度胎牛血清組、塑料瓶組和玻璃瓶組BMSCs的黏附、增殖、分化狀況及細胞形態(tài)。

2 結果

標準胎牛血清組細胞原代培養(yǎng)第3天全量換液后見少量貼壁變形細胞，部分細胞呈短梭形，透亮度較高，輪廓清晰，但細胞增殖緩慢，第7天細胞密度仍低，出現異常分化、衰老現象，部分細胞脫落，細胞透亮，出現多個突起，類似神經樣細胞，增殖至第10天細胞面積仍只占瓶底面積的50%左右，傳代后細胞幾無增殖，呈現瘢痕樣及神經球樣細胞形態(tài);高純度胎牛血清組細胞原代培養(yǎng)第3天全量換液后見貼壁細胞較多，部分細胞呈短梭形，逐漸呈長梭形，輪廓清晰，細胞增殖較快，細胞形態(tài)大致一致，第7天見細胞呈典型的長梭形，細胞呈柵欄樣、魚群及漩渦樣集落生長，細胞間緊密排列，第9天鋪滿瓶底達80%左右，未出現異常分化、衰老細胞，傳代細胞經1～2 d靜止期后呈對數增長，4 d左右鋪滿瓶底達90%左右，細胞形態(tài)呈一致的典型的長梭形，緊密排列。

塑料培養(yǎng)瓶組細胞貼壁、變形較快，4 h左右基本貼壁完成，貼壁后細胞增殖速度較快，呈典型形態(tài)生長，換液時未出現脫落現象;玻璃培養(yǎng)瓶組細胞貼壁、變形慢，24 h后仍有部分漂浮細胞，貼壁后細胞增殖速度較慢，細胞形態(tài)尚典型，換液時細胞出現部分脫落現象。

3 討論

間充質干細胞是具有自我更新和多向分化潛能的成體干細胞，其來源及分布廣泛，已在脂肪、肝臟、臍血、羊水等組織中分離出間充質干細胞，但目前細胞的獲取及研究仍主要集中在骨髓組織，骨髓中間充質干細胞的比例極小，約占骨髓有核細胞的0.0001%～0.001%［5］。BMSCs在不同的體外條件下可誘導分化成成骨細胞、骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、內皮細胞、神經細胞、心肌細胞及內皮細胞等，是理想的干細胞治療的種子細胞。因此尋找一種簡便、有效、穩(wěn)定的BMSCs分離培養(yǎng)及純化體系具有十分重要的意義。

1966年Friedenstein等［6］首次采用BMSCs的塑料黏附生理習性對其進行分離培養(yǎng)，后人在此基礎上對分離方法不斷改進，目前常用的BMSCs體外分離、純化培養(yǎng)方法主要有四種:全骨髓貼壁法、密度梯度離心法、流式細胞儀分選法及免疫磁珠分選法［7］，其中以前兩種方法最為常用，全骨髓貼壁法是最早應用的方法，在不斷換液及傳代過程中可以去除不貼壁的血細胞和造血細胞成分，此種方法操作簡便，細胞損傷小，經3～4次傳代后可獲得純度較高的BMSCs;密度梯度離心法利用各細胞成分的密度不同采用特定密度的淋巴細胞分離液分離BMSCs，所獲得的原代細胞純度較高，但在3～4次傳代后細胞純度與全骨髓貼壁法無明顯區(qū)別［8］;流式細胞儀和免疫磁珠分選法可獲得純度較高的BMSCs，但容易損傷細胞，甚至造成細胞失活，限制了這兩種方法的應用［9］。本研究采用全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)BMSCs，經過多次換液沖洗及傳代后得到形態(tài)比較一致的典型的纖維樣細胞，細胞緊密排列。

BMSCs的鑒定標準為:①細胞呈纖維樣細胞形態(tài);②在標準培養(yǎng)條件下，BMSCs必須具備塑料黏附特性;③BMSCs必須表達CD73、CD90、CD105，而不表達CD34、CD45、CD14、CD11b、CD79或者CD19和HLA-DR表面分子;④BMSCs必須能在體外分化為成骨細胞、脂肪細胞和軟骨細胞［10，11］。本研究發(fā)現高純度胎牛血清組獲得形態(tài)大致一致的長梭形纖維樣細胞，細胞呈柵欄樣、魚群及漩渦樣集落式生長，緊密排列，而且在后面的實驗中發(fā)現，該細胞在塑料培養(yǎng)瓶中比玻璃培養(yǎng)瓶黏附牢固，結果符合上述標準的前兩條，可初步斷定我們所獲得的細胞為BMSCs，但為獲得確實證據需進一步鑒定細胞表面標志物并在體外進行誘導。

BMSCs增殖需多種細胞因子和生長因子共同作用，如PDGF、VEGF、IGF等，但目前仍沒有一種細胞因子和生長因子混合物能滿足細胞生長需求，故干細胞培養(yǎng)通常在基礎培養(yǎng)基中應用胎牛血清作為培養(yǎng)添加劑［12］，本研究中我們采用不同廠家的不同類別的胎牛血清及培養(yǎng)基對BMSCs進行分離培養(yǎng)，以觀察不同血清及培養(yǎng)基對干細胞增殖、分化的影響，結果發(fā)現標準胎牛血清組不能得到典型的細胞，細胞增殖緩慢，而且細胞老化、分化現象嚴重，而高純度胎牛血清組可獲得典型的長梭形細胞，細胞增殖活躍，多次換液及傳代后獲得較純的細胞，可能因不同血清其純度、細胞因子和生長因子含量及“隱形成分”不同導致了不同的結果。

綜上所述，本實驗結果證實了全骨髓貼壁法分離、純化培養(yǎng)BMSCs可行，為快速獲得純度較高的BMSCs需采用純度較高的血清及塑料培養(yǎng)瓶，對體外擴增BMSCs用于干細胞治療有重要意義。

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