楊 玲，曾文鋌，張 鶴，謝栩碩

(1廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，廣州510120;2南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院)

人白細(xì)胞抗原(HLA)-I類(lèi)限制性細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞(CTL)免疫反應(yīng)可能參與乙型肝炎病毒(HBV)相關(guān)的嚴(yán)重乙型肝炎活動(dòng)(SHB)［1，2］。HLA-A2限制性特異性CTL表位HBeAg18-27能在90%的急性乙型肝炎患者體內(nèi)激起強(qiáng)的免疫反應(yīng)［3］。第27位氨基酸(core27)是該表位與HLA-A2分子結(jié)合的錨基位點(diǎn)，當(dāng)core27位置發(fā)生改變，該表位的免疫原性發(fā)生改變［4］。HBcAg18-27V是從歐美地區(qū)的主要流行HBV基因型A、D中鑒定出來(lái)的，在我國(guó)流行的HBV基因B、C型中，HBcAg18-27主要表現(xiàn)為HBcAg18-27I［5］。當(dāng)HBcAg18-27發(fā)生變異后，通過(guò)活化靶細(xì)胞或活化CTL而增強(qiáng)CTL細(xì)胞毒反應(yīng)［4］。本研究觀(guān)察了SHB患者HBeAg18-27的表現(xiàn)形式、隨訪(fǎng)后的變異情況及CTL頻數(shù)變化，探討HBeAg18-27V/I變異體與HBV相關(guān)SHB的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2008年1月～2011年6月廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院及南方醫(yī)院收治的HBV感染患者，包括HBV導(dǎo)致SHB患者77例［男69例、女8例，年齡(35±9)歲，HBeAg陽(yáng)性32例、陰性45例，血清ALT(597±607)IU/L］及慢性乙型病毒性肝炎(CHB)88例［男75例、女13例，年齡(35±9)歲，HBeAg陽(yáng)性65例、陰性23例，血清ALT(139± 75)IU/L］。SHB定義為，在CHB基礎(chǔ)上，患者血清ALT最高值≥600 U/L及總膽紅素(TB)最高值≥51.3 μmol/L［6］。排除標(biāo)準(zhǔn):①合并有甲、丙、丁型肝炎病毒及其他嗜肝病毒感染者;②肝硬化者;③嚴(yán)重代謝性肝病或自身免疫性肝病者;④合并人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV)感染者;⑤長(zhǎng)期接受免疫抑制劑治療者，包括器官移植后患者;⑥長(zhǎng)期酗酒、戒酒未滿(mǎn)半年者。CHB的診斷符合《病毒性肝炎防治方案》［7］中的標(biāo)準(zhǔn):HBsAg陽(yáng)性半年以上，出現(xiàn)輕度或中度肝炎活動(dòng)，即血清ALT波動(dòng)(40～80)U/L，TB≤17.1 μmol/L。從發(fā)病入院開(kāi)始，每3個(gè)月對(duì)SHB患者進(jìn)行隨訪(fǎng)。收集患者的血標(biāo)本。

1.2 HBcAg18-27編碼區(qū)擴(kuò)增及測(cè)序 采用QIAGEN血清DNA抽提試劑盒提取受檢者血清中的HBV DNA。用引物P1(5'-TTTT TCACCTCTGCCTAATC-3')和 P35(5'-TGATAAGATAGGGG CATTTG-3')及引物P1和HC24R(5'-CCTGAGTGCTGTATGGTGAGG-3')進(jìn)行半巢式PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性1 min;接著94℃變性25 s，55℃退火25 s，72℃延伸40 s，共循環(huán)30圈;最后72℃再延伸5 min。用P1引物行PCR產(chǎn)物測(cè)序。

1.3 HBV基因型鑒定 采用PCR-RFLP方法。取抽提的HBV DNA，以BS1(5'-ATGAA TTCCCTGCTGGTGGCTCCAGTTCC-3')和 Pol2(5'-CGGGCAACGGGGTAAAGGTTC-3')為外引物進(jìn)行第1輪PCR擴(kuò)增。取第 1輪 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，以 YS1(5'-GCGGGGTTTTTC TTGTTGA-3')和 YS2(5'-GGGACTCAAGATGTTG TACAG-3')為內(nèi)引物再進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性1 min;接著94℃變性20 s，55℃退火25 s，72℃延伸50 s，共循環(huán)35圈;最后72℃再延伸5 min。取第2輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，分別以?xún)?nèi)切酶BsrsⅠ和StyⅠ各37℃酶切4 h。根據(jù)圖譜分型:BsrsⅠ可切的、StyⅠ不可切，為B型;BsrsⅠ不可切、StyⅠ可切，為C型。如果用上述兩種內(nèi)切酶仍不能確定基因型者，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，以確定其基因型。

1.4 HLA-A2鑒定及HBV特異性CTL檢測(cè) 分離血標(biāo)本中的單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)并行HLA-A2染色，在其中分別加入HLA-A2-FITC 1 μL及FITC標(biāo)記的IgG2b同型對(duì)照2 μL，24 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀分析 HLA-A2。分離 PBMC，行 HBcAg18-27I和HBcAg18-27V特異性五聚體(Pentamer)染色:將復(fù)蘇的PBMC分別加10 μL的FITC標(biāo)記的Pen18-27V或Pen18-27I，孵育洗滌細(xì)胞后，加入5 μL的APC標(biāo)記的CD8，孵育洗滌后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。檢測(cè)時(shí)收集5×105個(gè)細(xì)胞，用美國(guó)BD公司的Cell Quest軟件進(jìn)行分析。HBV特異性的CTL細(xì)胞陽(yáng)性率= (Pen18-27+CD+8細(xì)胞/CD+8細(xì)胞)×100%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。兩組間的頻數(shù)比較用Pearson chi-square檢驗(yàn)或Fisher's Exact檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SHB、CHB患者的HBV DNA定量、HBcAg18-27表位形式及其HBV基因型 77例SHB患者的HBV DNA為(5.65±1.66)copies/mL，88例CHB患者為(7.16±1.70)copies/mL。77例SHB患者和88例 CHB患者中共有22例 (13.3%)在HBcAg18-27編碼區(qū)表現(xiàn)為HBcAg18-27V，其中CHB患者4例(4.5%)、SHB患者18例(23.4%)，其余患者為HBcAg18-27I的形式。HBcAg18-27V流行率在SHB患者中明顯高于CHB患者［23.4%(18/ 77)vs 4.5%(4/88)］，兩者相比，P＜0.01。77例SHB患者中HBV基因型分別為B型50例、C型20例、D型1例，另外6例S區(qū)擴(kuò)增陰性，未鑒定基因型;88例CHB患者中HBV基因型分別為B型57例、C型31例。22例HBcAg18-27V患者的HBV基因型，除1例為D型外，其余為B、C型。

2.2 隨訪(fǎng)期間SHB患者HBcAg18-27表位區(qū)變異

77例SHB患者的隨訪(fǎng)時(shí)間均超過(guò)3個(gè)月，最長(zhǎng)達(dá)17個(gè)月。有18例在隨訪(fǎng)3個(gè)月期間死亡，分別為3例HBcAg18-27V和15例HBcAg18-27I患者。10例HBcAg18-27V或HBcAg18-27V、HBcAg18-27I混合感染患者及19例HBcAg18-27I患者在隨訪(fǎng)中獲得血清標(biāo)本。排除2例PCR擴(kuò)增陰性的患者。9例發(fā)病時(shí)感染HBcAg18-27V病毒株或混合感染HBcAg18-27V、HBcAg18-27I病毒株的患者按照HLA-A2陽(yáng)性或陰性分為兩組:4例HLA-A2陽(yáng)性的患者隨訪(fǎng)中均變異為HBcAg18-27I單一病毒株感染;而5例HLA-A2陰性的患者，隨訪(fǎng)中仍能檢測(cè)到包含HBcAg18-27V的病毒株。而18例發(fā)病時(shí)感染HBcAg18-27I的患者隨訪(fǎng)后仍然為HBcAg18-27I病毒株。感染的病毒株通過(guò)測(cè)序峰圖結(jié)果分析，ATT編碼蛋白為HBcAg18-27I，GTT編碼蛋白為HBcAg18-27V。

2.3 HLA-A2鑒定及HBV特異性CTL檢測(cè)結(jié)果對(duì)15例HBcAg18-27V的SHB患者和隨機(jī)挑選的22例HBcAg18-27I的SHB患者鑒定其 HLA-A2。HLA-A2陽(yáng)性比率在HBcAg18-27V與HBcAg18-27I患者中相近(7/15 vs 8/22，P＞0.05)。在隨訪(fǎng)的患者中，2例HLA-A2陽(yáng)性患者中，1例在發(fā)病時(shí)感染HBcAg18-27V、HBcAg18-27I混合病毒株，而在隨訪(fǎng)第48周時(shí)為HBcAg18-27I單一病毒株，此時(shí)對(duì)其PBMC進(jìn)行五聚體染色顯示HBcAg18-27V特異的記憶細(xì)胞頻數(shù)為0.90%，而HBcAg18-27I特異的記憶細(xì)胞頻數(shù)為0.07%;另1例在發(fā)病時(shí)感染HBcAg18-27I單一病毒株，在隨訪(fǎng)第68周時(shí)仍為HBcAg18-27I單一病毒株感染，此時(shí)對(duì)其PBMC進(jìn)行五聚體染色顯示HBcAg18-27V特異的記憶細(xì)胞頻數(shù)為0.36%，而HBcAg18-27I特異的記憶細(xì)胞頻數(shù)為0.13%。

3 討論

HLA-A2限制性的表位HBcAg18-27V(FLPSDFFPSV)在HBV基因A、D型的患者中流行率高，而在HBV基因B、C型的患者中流行率僅為1.9%(3/ 160)和6.7%(7/105)［5，8］。在本研究中，HBcAg18-27V在SHB組明顯高于CHB組，22例HBcAg18-27V患者中有1例為HBV基因D型，其余21例為B、C型。表明HBcAg18-27V在SHB中高流行，與HBV基因型不相關(guān)。而文獻(xiàn)［4］報(bào)道，與HBcAg18-27I相比，HBcAg18-27V和HLA-A2分子有更好的親和力，能誘導(dǎo)更強(qiáng)的細(xì)胞免疫反應(yīng);表明HBcAg18-27V這種表位形式參與了HBV感染相關(guān)的SHB。

在本研究中，我們隨訪(fǎng)了存活的 10例 HBcAg18-27V形式的SHB患者，其中4例HLA-A2陽(yáng)性的患者發(fā)病時(shí)感染HBcAg18-27V或混合感染HBcAg18-27V、HBcAg18-27I病毒株，隨訪(fǎng)中均變異成HBcAg18-27I單一病毒株;而在5例HLA-A2陰性的患者中，發(fā)病時(shí)感染HBcAg18-27V或混合感染HBcAg18-27V、HBcAg18-27I病毒株，隨訪(fǎng)后仍能檢測(cè)到包含HBcAg18-27V的病毒株。表明在HLA-A2陽(yáng)性的患者中，HBcAg18-27V向HBcAg18-27I變異是免疫逃逸的結(jié)果。

僅有2例HLA-A2陽(yáng)性患者分別于隨訪(fǎng)第48周和68周時(shí)收集到PBMC，其在發(fā)病時(shí)分別感染HBcAg18-27V、HBcAg18-27I病毒株和HBcAg18-27I單一病毒株;在隨訪(fǎng)第48周和第68周時(shí)均檢測(cè)到HBcAg18-27I病毒株，HBcAg18-27V特異性記憶T細(xì)胞的頻數(shù)高于HBcAg18-27I特異性記憶T細(xì)胞的頻數(shù)。提示在長(zhǎng)時(shí)間隨訪(fǎng)后，盡管HB-cAg18-27V病毒已檢測(cè)不到，但患者體內(nèi)仍保留著對(duì)HBcAg18-27V強(qiáng)而持續(xù)的免疫反應(yīng);而正是這種強(qiáng)的免疫反應(yīng)介導(dǎo)了HBcAg18-27V病毒的清除，導(dǎo)致HBcAg18-27V向HBcAg18-27I發(fā)生表位漂移。

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