崔煥忠，張 輝，范譯文，康 倩，錢愛東*

(吉林農業(yè)大學動物科技學院，吉林 長春 130118)

單核細胞增生性李斯特菌自溶素研究進展

崔煥忠，張 輝，范譯文，康 倩，錢愛東*

(吉林農業(yè)大學動物科技學院，吉林 長春 130118)

自溶素是由細菌產生的可以降解細菌細胞壁的肽聚糖水解酶，參與細菌的分裂、細胞壁更新、細菌自溶等生理過程。自溶素也是細菌的重要毒力因子之一，參與細菌的黏附與侵襲，與細菌的致病性密切相關。本文對單核細胞增生性李斯特菌的胞壁水解酶p60、酰胺酶Ami、自溶素IspC、自溶素Auto與胞壁水解酶MurA等自溶素的蛋白結構、生理功能及致病性進行了簡要介紹。

單核細胞增生性李斯特菌；自溶素；研究進展

單核細胞增生性李斯特菌是一種重要的食物源性人獸共患病病原菌，為革蘭氏陽性胞內寄生菌，在食品污染中廣泛存在，人們極易通過食用污染的食品而感染發(fā)病，兒童、孕婦、老年人及免疫功能低下者更易感染發(fā)病。被世界衛(wèi)生組織列為僅次于大腸桿菌O157、沙門氏菌、志賀氏菌后的第四大重要的食源性致病菌。因此應加強該致病菌的深入研究，建立快速有效的檢測方法，保障食品質量安全，以降低該病的發(fā)病率；尋找新型無抗性的生物制劑用于該病的治療，以降低該病的死亡率，為該病的防治奠定基礎。

自溶素(autolysin)為細菌的表面蛋白，具有肽聚糖水解酶活性，可以降解細菌細胞壁，與細菌多種生物學功能有關，如細胞壁翻轉、細胞分裂、細胞分離、趨化作用、生物膜形成、遺傳轉化能力、蛋白質分泌、鞭毛與孢子形成及抗生素誘導裂解等，對細菌的生存和致病性至關重要[1]。根據(jù)自溶素作用位點的不同，可將其分為以下幾類：N-乙酰胞壁酸酶，作用于N-乙酰胞壁酸與N-乙酰葡萄糖胺之間的1,4-糖苷鍵；N-乙酰糖苷酶，作用于N-乙酰葡萄糖胺與N-乙酰胞壁酸之間的1,4-糖苷鍵；N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶，作用于N-乙酰胞壁酸的D-乳酸與L-丙氨酸之間的酰胺鍵；肽鏈內切酶；糖基轉移酶[2]。近年來，多種自溶素在革蘭陽性細菌中得到證實，如結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、山羊葡萄球菌(Staphylococcus caprae)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)、枯草桿菌(Bacillus subtilis)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、糞腸球菌(Enterococcus faecalis)、豬鏈球菌2型(Streptococcus suis type 2)和變異鏈球菌(Streptococcus mutans)等[3-4]。

研究表明自溶素在單核細胞增生性李斯特菌也普遍存在，通過蛋白的分離純化與表達，目前已經證實的自溶素有7種，其中包括胞壁水解酶p60、酰胺酶Ami、表面蛋白P45、自溶素IspC、自溶素Auto、胞壁水解酶MurA及表面蛋白FlaA等，上述自溶素參與細菌細胞的分裂與分離、肌動蛋白尾的形成、調節(jié)表面蛋白的分泌表達等生理過程，以及細菌的黏附與侵襲、細菌在細胞內的生長、細菌從細胞到細胞的擴散等致病過程，與其毒力密切相關。

1 胞壁水解酶p60

p60蛋白也稱為cwhA(cell wall hydrolase A)，由iap(invasion-associated protein)基因編碼，分子質量為60kD，等電點(pI)為9.75，它是一種胞外蛋白，具有胞壁水解酶和酰胺酶活性。由N端到C端分別為信號肽、SH3區(qū)、Thr-Asn的重復區(qū)、胞壁水解酶活性區(qū)。p60蛋白存在于所有李斯特菌中，其C端和N端分別為由100個和120個氨基酸組成的保守區(qū)，中間區(qū)域高度可變[5]。因此可利用iap基因兩端序列設計引物，進行李斯特菌屬的鑒定，利用中間區(qū)域可變性進行李斯特菌種的鑒定[6]。iap基因的表達不被prfA所調控。p60蛋白是單核細胞增生性李斯特菌的主要保護性抗原之一，常用于疫苗研制的候選抗原[7]。p60蛋白與細菌的侵襲性密切相關，iap基因缺失突變體對Caco-2細胞及3T6細胞的黏附能力降低。p60蛋白對于細胞的分裂必不可少，iap基因缺失后缺少細胞分裂，造成在隔膜形成后，ActA在隔膜形成點沿著鞭毛聚集，而沒有聚集在鞭毛尾部，不能形成F-肌動蛋白尾，使細菌喪失基于肌動蛋白的運動性，導致突變體在細胞間的擴散能力下降而使其毒力顯著降低[5]。以iap基因缺失突變體靜脈接種小鼠，與野生型菌株相比，小鼠肝臟及脾臟細菌計數(shù)明顯減少，表明缺失iap基因后細菌毒力顯著降低。在細菌感染早期，p60蛋白以間接的方式激活NK細胞，產生大量IFN-γ，從而可能通過對外圍細胞的免疫調節(jié)促進細菌感染早期的擴散[8]。Sashinami等[9]研究p60蛋白對宿主天然免疫反應的影響，結果發(fā)現(xiàn)重組p 6 0蛋白可以刺激幼鼠RAW264.7巨噬細胞產生TNF-α，調節(jié)抗單核細胞增生性李斯特菌感染的天然免疫反應。

2 酰胺酶Ami

酰胺酶Ami的大小在不同血清型中存在差異，在1/2a血清型中由917個氨基酸組成，分子質量為102kD，而在4b血清型由770個氨基酸組成。盡管不同血清型間Ami的大小不同，但是其N端的同源性高達98%，然而C端的同源性只有54%，并且C端的甘氨酸-色氨酸模序(glycine-tryptophan，GW模序)，GW的數(shù)量在不同血清型中不同，1/2a血清型有8個，而4b血清型有6個[10]。Ami的N端為催化域，與金黃色葡萄球菌At1自溶素的酰胺酶區(qū)域相似，C端為細胞壁錨定結構域。Ami除裂解細菌細胞壁外，還可以通過其細胞壁錨定結構域使細菌黏附至靶細胞表面，參與細菌的黏附過程。不同血清型的單核細胞增生性李斯特菌對Hep-G2細胞的黏附能力不同，1/2a血清型黏附能力強于4b血清型[11]。Ami與細菌毒力相關，參與小鼠肝細胞的黏附與內化過程，從而發(fā)揮其致病作用，同時通過發(fā)揮肽聚糖水解酶活性裂解菌體，釋放細胞壁免疫活性物質，增加TNF-α和IL-6的產生釋放，在細菌感染早期激發(fā)宿主主動免疫反應[12]。

3 自溶素Auto

Cabanes等[13]通過硅片對比分析單核細胞增生性李斯特菌和無致病性的無害李斯特菌的基因組，結果發(fā)現(xiàn)一個在無害李斯特菌基因組中不存在的基因auto，auto基因也是唯一一個在無害李斯特菌中不存在的自溶素基因。auto基因編碼一種具有自溶活性的表面蛋白Auto，該蛋白由572個氨基酸殘基組成，分子質量為62kD，包括由26個氨基酸殘基組成的信號肽序列、N端自溶結構域(第75～243位氨基酸)及C端細胞錨定結構域(第244～572位氨基酸)[14]。錨定結構域與Ami、金黃色葡萄球菌的自溶素Atl、AtlC、AtlE及Aas相同，由GW模序組成，但是GW模序的數(shù)量不同為4個。auto基因的表達不被prfA調控。Auto不參與細胞黏附，但與侵入真核細胞有關。auto基因缺失突變體對一些上皮細胞和成纖維細胞的侵襲力降低，但不影響其在鼠巨噬細胞如J774中的侵襲力，同時該突變體對豚鼠和小鼠的毒力降低。Auto對單核細胞增生性李斯特菌的侵襲是必需的，但是需與其他黏附侵襲相關毒力因子協(xié)同作用[15]。

4 自溶素IspC

IspC是由Wang Linru等[16]于2008年發(fā)現(xiàn)的一種具有免疫原性的細菌表面蛋白，由774個氨基酸殘基組成，具有由23個氨基酸組成的信號肽序列，成熟蛋白的分子質量為84kD，pI為9.4，與Auto和Ami相似，具有N端催化域(第24～197位氨基酸)及由7個GW模序組成的C端細胞壁錨定結構域(第198～774位氨基酸)。同野生型菌株相比，ispC基因缺失突變株在體外生長、復制、微觀形態(tài)以及生化特性方面沒有改變，但是對小鼠毒力明顯降低，表現(xiàn)在肝臟和心臟的細菌計數(shù)顯著減少，并且沒有死亡[17]。IspC與細菌細胞的分裂與分離無關，但是與細菌的毒力密切相關，在細菌感染過程發(fā)揮多種功能，參與細菌的黏附與內化，細菌從細胞到細胞的擴散，在胞內感染早期參與肌動蛋白尾的形成，感染后期與細菌在胞內的生長有關。IspC通過細胞類型依賴方式參與Hep-G2細胞、Vero細胞與SCP細胞的黏附及Caco-2細胞、Hep-G2細胞、Vero細胞、L132細胞與SCP細胞的內化。以C端細胞壁錨定結構域特異的結合到SCP細胞和Vero細胞表面，從而參與細胞的黏附。ispC基因缺失突變株對人腦微血管內皮細胞(human brain microvascular endothelial cell，HBMEC)的黏附能力沒有變化，表明IspC可能為細菌通過血腦脊液屏障所必需。蛋白質組學和免疫學分析表明，由于IspC的缺失導致ActA、InlC2 及 FlaA表面蛋白的表達量減少。N端催化域調節(jié)包括ActA、鞭毛蛋白、InlB前體、p60蛋白及InlA在內的表面蛋白的分泌表達[16]。

5 P45蛋白

Schubert等[18]以4d血清型單核細胞增生性李斯特菌免疫小鼠制備單克隆抗體，發(fā)現(xiàn)該單克隆抗體與分子質量為45kD的蛋白(P45)反應，該蛋白不僅存在于細菌表面，也能分泌到培養(yǎng)液中。利用李斯特菌屬不同菌種與單克隆抗體進行交叉反應，結果表明除了格氏李斯特菌外，該單克隆抗體與其他李斯特菌均發(fā)生反應。將編碼蛋白的結構基因克隆到大腸桿菌中并進行測序，發(fā)現(xiàn)該基因編碼的蛋白由402個氨基酸殘基組成，預計分子質量為42.7kD，具有由27個氨基酸殘基組成的信號肽序列，成熟蛋白的分子質量為39.9kD，與p60的同源性為55%，與糞腸球菌P54蛋白及乳酸乳球菌Usp45蛋白的同源性較高，具有肽聚糖水解活性。將該編碼基因命名為spl (secreted protein with lytic property) 。

6 胞壁水解酶MurA

MurA是一種表面蛋白，由590個氨基酸殘基組成，分子質量為66kD，具有由52個氨基酸組成的信號肽序列，成熟蛋白的分子質量為58kD，在MurA的149～301位氨基酸之間具有甘露糖基糖蛋白內切β-N-乙酰氨基葡糖苷酶保守催化谷氨酸和天冬氨酸殘基的結構域。N端序列與革蘭氏陽性菌的溶菌酶同源，C端為細胞錨定結構域，具有4個由賴氨酸模序組成的重復區(qū)域，每個區(qū)域由43個氨基酸組成，重復區(qū)域之間由富含絲氨酸、蘇氨酸與天冬酰胺的序列間隔開，重復區(qū)域之間的同源性為76%，C端重復區(qū)域與希氏腸球菌的胞壁質酸酶-2及乳酸乳球菌與糞腸球菌的胞壁水解酶的同源性為80%，與p60蛋白的N端兩個由賴氨酸模序組成的重復區(qū)域高度同源。

MurA具有胞壁水解酶活性，參與細胞分離，murA基因缺失突變株不能表達胞壁水解酶，造成細菌在對數(shù)生長期形成長鏈，不能分離。而將murA基因重新整合到murA基因缺失突變株染色體上，細菌則恢復表達胞壁水解酶和細胞分離的能力。在不利于細菌生長的條件下，MurA參與細菌的裂解，同時MurA也是發(fā)揮菌體自溶功能的主要蛋白。p60蛋白與酰胺酶Ami通過參與細胞的黏附，直接發(fā)揮其致病作用，而MurA則通過菌體自溶，釋放細胞壁免疫活性成分和毒素，從而間接發(fā)揮細菌的致病性[19]。

7 表面蛋白FlaA

Popowska等[20]利用氯化鋰處理細菌細胞獲得分子質量為29kD的表面蛋白，利用快速蛋白液相層析(FPLC)將其分離，采用明膠酶譜分析證實該蛋白具有肽聚糖水解酶活力。雙向電泳后進行測序分析，證實該蛋白為FlaA蛋白。FlaA蛋白由flaA基因編碼，為細菌表面的鞭毛蛋白。Dons等[21]構建了flaA基因缺失突變株，研究表明同野生型菌株相比，該突變株對Caco-2細胞的侵襲能力降低，F(xiàn)laA蛋白參與上皮細胞的黏附，并可激發(fā)宿主的免疫反應，誘導TNF-α和IL-1的產生。Shen等[22]研究發(fā)現(xiàn)，在37℃培養(yǎng)條件下及細胞內感染階段，MogR蛋白抑制FlaA蛋白的表達，DNA 結合與微陣分析表明MogR蛋白通過直接與位于轉錄啟動區(qū)內的兩個TTTTN5-AAAA結合，從而阻遏RNA聚合酶結合，抑制所有鞭毛運動基因的轉錄。上位分析表明MogR蛋白抑制基因轉錄由反應調節(jié)子DegU以溫度依賴方式拮抗，DegU通過轉錄后機制調節(jié)FlaA蛋白的水平。

8 其 他

除了上述自溶素外，單核細胞增生性李斯特菌可能編碼自溶素還有Lmo0327蛋白，Lmo0327蛋白為細菌的表面蛋白，具有胞壁水解酶活性，分子質量為144kD，具有信號肽序列、N端LRR結構域及C端錨定結構域，通過LPXTG模序與細胞壁胞壁酸共價結合。Lmo0327蛋白的表達可能由上游的轉錄調節(jié)子Lmo0326正向調控。Lmo0327蛋白參與細胞的分離及細胞壁的翻轉[23]。此外，預測lmo1521和lmo2203編碼產物與Ami和Auto相似，具有肽聚糖水解區(qū)和GW模序，可能具有自溶活性[24-25]。

9 結 語

因為李斯特菌產生的自溶素僅對李斯特菌起作用，可特異性的破壞細菌細胞壁結構，而不影響其他正常菌群，并且很容易通過基因工程技術獲得和修飾改善，而且其重組蛋白同樣具有水解活性，因此有望開發(fā)成為一類新型抗菌制劑，用于治療李斯特菌感染[26]。目前，肺炎鏈球菌及金黃色葡萄球菌的自溶素已經成為新型抗菌藥物的研發(fā)熱點，研究表明肺炎鏈球菌自溶素LytA在體內外都能有效的溶菌，靜脈注射可以治療耐藥肺炎鏈球菌引起的腹膜炎——敗血病等[27]。Sinch等[28]通過研究同源金黃色葡萄球菌的自溶素缺陷株和野生株發(fā)現(xiàn)，苯唑西林及萬古霉素等抗生素能與細菌自有的自溶素聯(lián)合增強抑菌作用。肺炎鏈球菌自溶素LytA是肺炎鏈球菌表面重要的毒力因子，存在于所有肺炎鏈球菌菌株中，并且高度保守，是理想的疫苗候選抗原[29-30]。由于auto基因是唯一一個在無害李斯特菌中不存在的編碼自溶素的基因，因此可將其作為單核細胞增生性李斯特菌與無害李斯特菌鑒別診斷的候選基因。此外，也可利用自溶素基因的保守片段建立檢測及診斷方法，為食品檢測及疾病的診斷提供可靠的參考依據(jù)。

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Research Progress in Autolysin from Listeria monocytogenes

CUI Huan-zhong，ZHANG Hui，F(xiàn)AN Yi-wen，KANG Qian，QIAN Ai-dong*
(College of Animal Science and Technology, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

Autolysin is a kind of peptidoglycan hydrolase produced by the bacteriumb and able to degrade its own cell wall. This enzyme is involved in numerous cellular processes including cell division, cell-wall turnover and bacterial lysates. Autolysin is closely associated with pathogenicity, which participated in host cell adhesion and invasion. The protein structure, physiological function and pathogenicity of autolysins in Listeria monocytogenes, such as p60, Ami, IspC, Auto and MurA are reviewed here.

Listeria monocytogenes；autolysin；progress

Q939.94

A

1002-6630(2012)11-0290-04

2011-05-11

2007年度高等學校博士學科點專項科研基金項目(20070193062)

崔煥忠(1973—)，男，副教授，碩士，研究方向為動物疾病診療新技術。E-mail：huanzhongcui@163.com

*通信作者：錢愛東(1960—)，男，教授，博士，研究方向為動物病毒學。E-mail：qianaidong0115@163.com