吳劍宏，阮狄克，王德利，張 超，何 勍，王超鋒，張 燕，辛洪奎，顧 韜，徐 成，劉 玥

近年來，基因治療成為椎間盤退變性疾病生物學治療的研究熱點。隨著對端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(telomerase reverse transcriptase，TERT)基因研究的深入，通過載體將TERT基因轉(zhuǎn)入細胞，進而激活細胞端粒酶活性，使細胞延長壽命，甚至使細胞“永生化”成為可能［1-2］。腺相關(guān)病毒是目前在基因治療研究領(lǐng)域常使用的一種病毒類載體［3］，本研究使用腺相關(guān)病毒為載體介導人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)基因轉(zhuǎn)染人椎間盤髓核細胞，評估重組腺相關(guān)病毒人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因(recombinant adeno-associated virus vector-mediated hTERT gene，rAAV-hTERT)是否能轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)人髓核細胞，并對其安全性相關(guān)指標進行檢測，為進一步的功能研究及在體研究提供安全性證據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

DMEM培養(yǎng)液、PBS液(Hyclone)、胎牛血清(fetal bovineserum，F(xiàn)BS)(Gibco)，0.25%Trypsin-EDTA(Gibco)，trizol液(Invitrogen)，Ⅱ型膠原酶(碧云天)，鼠抗人hTERT蛋白單抗及羊抗兔/鼠二抗(Abcam)。PCR、RT-PCR 試劑盒(Promega)，75 μm的細胞濾膜(Millipore)，6孔培養(yǎng)板(corning)，PCR引物根據(jù)PCR引物設(shè)計原則，按照hTERT及甘油醛-3-磷酸 脫 氫 酶 (glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH)基因序列，利用 Prime Premer 5軟件設(shè)計，由北京博邁德生物公司合成。3～4周齡裸鼠由北京大學醫(yī)學部動物中心提供。rAAV-hTERT(病毒滴度=1×1012μg/mL)由北京五加和生物技術(shù)公司包裝。Hela細胞由解放軍307醫(yī)院婦產(chǎn)科實驗室惠贈。

1.2 方法

1.2.1 人椎間盤髓核細胞的分離與培養(yǎng)

椎間盤髓核標本來源于1名19歲男性的正常椎間盤髓核組織，將標本用PBS清洗2次后仔細分離出髓核組織，將髓核組織修剪成1 mm3大小的組織塊，0.025% Ⅱ型膠原酶置于 37°C、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中消化14～16 h，將消化液用75 μm的細胞濾膜過濾，收集細胞以1×105/孔的密度培養(yǎng)于6孔培養(yǎng)板，以含10%FBS的DMEM為培養(yǎng)液，置于37°C含5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中，2～3 d換液1次，于倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài)。

1.2.2 rAAV-hTERT轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)人髓核細胞

轉(zhuǎn)染培養(yǎng)傳代后的第2代人髓核細胞(70%～80%融合時)，計數(shù)細胞，用PBS清洗細胞2次，按推薦的感染復數(shù)(multiplicity of infection，MOI)每細胞105v.g 加入病毒轉(zhuǎn)染液 2 mL，置于 37°C、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，棄去病毒轉(zhuǎn)染液，無血清DMEM培養(yǎng)基清洗2次，加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)傳代，于不同的時間點取出部分細胞進行檢測。實驗共分3組:①rAAV-hTERT轉(zhuǎn)染組;②AAV空病毒轉(zhuǎn)染組;③未轉(zhuǎn)染組。

1.2.3 rAAV-hTERT轉(zhuǎn)染后轉(zhuǎn)錄水平的檢測(RTPCR)

用半定量的反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應的方法來檢測hTERT基因及GAPDH基因(內(nèi)參照)在mRNA水平上的表達情況，在轉(zhuǎn)染后的7 d、90 d、120 d、150 d各取6孔rAAV-hTERT轉(zhuǎn)染組、AAV空病毒轉(zhuǎn)染組及未轉(zhuǎn)染組髓核細胞，將各組細胞各自混勻后用trizol法提取各組 RNA，然后利用 AMV random dT primer和AMV在42°C條件下孵育1 h，將 RNA反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，以cDNA為模板在 PCR儀上進行PCR反應，PCR反應條件如下:95°C、5 min，94℃、45 s，56℃、45 s，72℃、45 s，33 個循環(huán);72℃10 min。GAPDH上游引物:5’-GAA GGT CGG AGT CAA CGG-3’;GAPDH下游引物:5’-GGA AGA TGG TGA TGG GAT T-3’;hTERT基因上游引物:5’-GCC AGC ATC ATC AAA CCC-3’;hTERT基因下游引物:5’-CCA CGA ACT GTC GCA TGT AC-3’，PCR 產(chǎn)物以2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.4 rAAV-HTERT轉(zhuǎn)染后蛋白水平表達的檢測(western-blot)

在轉(zhuǎn)染后的 7 d、90 d、120 d、150 d 各取 6 孔rAAV-hTERT轉(zhuǎn)染組、AAV空病毒轉(zhuǎn)染組及未轉(zhuǎn)染組髓核細胞，以冷PBS洗滌3次后加入預冷的細胞裂 解 液 (1% NP-40，20 mmol/L Tris pH 7.4，150 mmol/L NaCl，10% 甘油，1 mmol/L苯甲基磺酰氟，10 mL抑菌肽，1 g/mL亮肽素，500 mmol/L正礬酸鈉)，混勻，置于冰上 30 min，4℃、12000 ×g離心20 min，收集上清，BioRad法蛋白定量后調(diào)整蛋白濃度一致。加等量的2×SDS上樣緩沖液，94℃變性10 min，配制150 L的聚丙烯酰胺分離膠，每孔上樣60 g蛋白，電泳分離蛋白后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，5%的脫脂牛奶封閉1 h后各樣品用8%SDS-PAGE電泳分離，之后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜。轉(zhuǎn)移好的硝酸纖維素膜用5%脫脂奶粉+TBS 37℃封閉1 h，鼠抗人hTERT蛋白單抗(1∶1000，Abcam)4℃ 孵育過夜，TBS/0.1%Tween-20洗滌3次后加人辣根過氧化物酶標記的羊抗兔/鼠(1∶2000，Abcam)，37℃ 孵育1 h，TBS/0.1%Tween-20洗膜后用增強化學發(fā)光法檢測目的條帶的表達。圖像掃描進行Western blot免疫印跡分析。另配置120 g/L的分離膠，按傳統(tǒng)方法做內(nèi)參GAPDH的Western blot免疫印跡。

1.2.5 髓核細胞染色體核型分析

取rAAV-hTERT轉(zhuǎn)染組培養(yǎng)10代(120 d)細胞和未轉(zhuǎn)染組2代髓核細胞培養(yǎng)于60 mL培養(yǎng)瓶中，以含10%FBS的DMEM為培養(yǎng)液，置于37°C、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中，隔日換液，待細胞長滿培養(yǎng)瓶底90% ～100%時，加入秋水仙素，終濃度為0.4 mg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后常規(guī)收獲、制片，G顯帶后進行核型分析并顯微照相。

1.2.6 髓核細胞裸鼠致瘤性分析

取3組體外傳代7 d的髓核細胞及Hela細胞消化、離心，將細胞濃度調(diào)為3×107/mL，各取100 μL細胞懸腋注入5周齡裸鼠腋下，接種完畢后，置恒溫、恒濕的無菌凈化屏障系統(tǒng)飼養(yǎng)，接種后3個月處死裸鼠，記錄腫瘤生長情況。

1.3 統(tǒng)計學處理

所有測量數(shù)據(jù)均用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析，對灰度值變化比較采用單因素方差分析，對染色體異常比率行卡方檢驗，以P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 細胞形態(tài)學觀察

各組細胞在單層培養(yǎng)條件下共培養(yǎng)14代(＞150 d)，倒置顯微鏡觀察顯示病毒轉(zhuǎn)染后細胞形態(tài)較未轉(zhuǎn)染細胞無明顯差異，各組細胞在5代以前形態(tài)以多角形及長梭形為主，隨著傳代次數(shù)的增加，長梭形細胞比例逐漸增加，至培養(yǎng)14代(150 d)時，細胞形態(tài)呈現(xiàn)為一致的長梭形。

2.2 hTERT基因mRNA及蛋白表達檢測結(jié)果

RT-PCR(見圖1a)及Western-blot(見圖1b)檢測結(jié)果顯示了一致性:3組細胞均檢測到內(nèi)參條帶(GAPDH，220bp)，rAAV-hTERT轉(zhuǎn)染組在轉(zhuǎn)染后的7 d，90 d，120 d均可檢測到hTERT基因的表達，在轉(zhuǎn)染后150d未能檢測到hTERT基因表達;另外2組則始終未檢測到hTERT基因的表達。通過對PCR及Western-blot條帶灰度值的比較分析(見圖1c)，轉(zhuǎn)染后第7天hTERT基因mRNA表達的相對水平是最高的，而隨著細胞傳代次數(shù)及時間的增加，hTERT基因mRNA表達的相對水平逐漸降低。

圖1 hTERT基因的表達Fig.1 The levels of mRNA and protein expression for hTERT

2.3 髓核細胞染色體核型分析結(jié)果

體外培養(yǎng)2代(14 d)未轉(zhuǎn)染組中期髓核細胞分裂數(shù)為50個，10代(120 d)轉(zhuǎn)染rAAV-hTERT組中期髓核細胞分裂數(shù)為75個(見表1)，結(jié)果顯示細胞為男性染色體核型，染色體總數(shù)為46條，可見部分染色體丟失(亞二倍體)，G-帶核型分析未見染色體結(jié)構(gòu)異?？寺。竞诵蜑槟行哉：诵?46，XY;見圖2)。

2.4 裸鼠致瘤性結(jié)果

細胞接種1周左右形成肉眼可見腫瘤，3個月后3組細胞均未觀察到裸鼠腋下腫瘤生長，而Hela細胞接種組可見明顯的腫瘤形成，大小約3 cm×2 cm×2 cm(見圖3)。

表1 髓核細胞染色體核型分析結(jié)果Tab.1 The results of the karyotypic analysis

圖2 髓核細胞染色體核型分析代表圖Fig.2 Karyotype analysis of rAAV-hTERT transfected HNP cells

圖3 裸鼠致瘤性結(jié)果圖Fig.3 The results of the oncogenicity in nude mice

3 討 論

椎間盤的退變是受年齡、機械物理、細胞、基因以及生化因子等多種因素影響的復雜的病理生理改變［4-5］。目前的各種手術(shù)及非手術(shù)治療手段僅僅是針對椎間盤退變引起的各種臨床癥狀的治療，而不是從恢復椎間盤細胞功能的角度上去逆轉(zhuǎn)椎間盤的退變。生物學治療由于具有延緩甚至逆轉(zhuǎn)椎間盤退變的潛能，而成為近年來的研究熱點［6］。在生物學治療策略中，種子細胞的選擇是一個非常關(guān)鍵的問題。近年來，在椎間盤退變性疾病種子細胞選擇的研究上有很多進展［7-8］，可供選擇的種子細胞也很多，如脂肪干細胞、骨髓間充質(zhì)干細胞及軟骨細胞等，雖然均能達到生物學治療的部分目的，但也存在著一些缺點和不足:①干細胞誘導分化的條件難以穩(wěn)定掌握;②誘導分化的類髓核細胞的功能穩(wěn)定性難以長期維持;③軟骨細胞分泌的細胞外基質(zhì)成分與髓核組織在量上有著明顯的區(qū)別［9］。因而，盡管這些細胞都能在某種程度上部分恢復髓核的細胞外基質(zhì)含量，但其畢竟不是真正意義上的髓核細胞。

因而，研究者又回過頭來繼續(xù)對髓核組織來源細胞加以研究，期望通過挖掘髓核細胞本身的未知潛能，使其作為生物學治療的種子細胞來源。理論上，自體組織來源的細胞是最佳的種子細胞，然而髓核細胞來源有限，在長期的體外培養(yǎng)過程中容易發(fā)生細胞的去分化現(xiàn)象。隨著對人類端粒酶基因的研究深入，通過將hTERT基因功能片段轉(zhuǎn)入成體細胞，從而激活細胞端粒酶活性，進而維持端粒長度以幫助細胞逃過衰老過程，成為延長細胞壽命的一種良好方法。迄今為止，學者們已經(jīng)利用hTERT基因在19種不同組織的35種細胞上進行了驗證，證實hTERT基因能夠延長細胞的生命，維持細胞的功能［10］。這一轉(zhuǎn)基因策略同樣也為延長體外培養(yǎng)髓核細胞壽命提供了可能。一個高效的基因治療載體是基因治療成功的關(guān)鍵，AAV是目前在基因治療領(lǐng)域應用非常廣泛的一個病毒類載體，AAV擁有較多的優(yōu)勢:①低致病性，低免疫原性，安全性好，迄今為止尚未在人類和哺乳動物身上發(fā)現(xiàn)和AAV相關(guān)的疾?。?1-12］;②表達時間長;③轉(zhuǎn)染效率較高，能轉(zhuǎn)染分裂期和非分裂期細胞［13-14］。

對于椎間盤退變這種慢性疾病來說，需要轉(zhuǎn)基因能在髓核細胞內(nèi)獲得一個長期、安全、高效的表達，這也是選擇AAV作為基因治療載體的主要原因。然而，在驗證rAAV-hTERT基因轉(zhuǎn)染髓核細胞是否有應用價值之前，尚需進行2步關(guān)鍵性的基礎(chǔ)工作:①必須在體外實驗中證實髓核組織對目的基因轉(zhuǎn)染是易感的;②hTERT基因轉(zhuǎn)染髓核細胞是安全的。本實驗通過AAV載體將hTERT基因?qū)塍w外培養(yǎng)人椎間盤髓核細胞，并證實導入的hTERT基因能在髓核細胞內(nèi)正確的表達，持續(xù)表達時間 ＞120 d。

正常人的體細胞染色體數(shù)目為46條，并有一定的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。染色體在形態(tài)結(jié)構(gòu)或數(shù)量上的異常被稱為染色體異常。染色體核型分析是細胞遺傳學研究的基本方法，是研究物種演化、分類以及染色體結(jié)構(gòu)、形態(tài)與功能之間的關(guān)系所不可缺少的重要手段。經(jīng)核型分析后，可根據(jù)染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目的變異來判斷生物的病因，比如是由于缺少了什么樣的基因才導致的這種疾?。?5］。本實驗結(jié)果顯示rAAV-hTERT轉(zhuǎn)染后10代髓核細胞與未轉(zhuǎn)染2代髓核細胞均有一定比例的染色體結(jié)構(gòu)異常，但2組細胞異常率差異并無統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，未出現(xiàn)多倍體及染色體異常結(jié)構(gòu)的克隆;由于并非固定部位的克隆，所以染色體數(shù)目的減少更可能是實驗操作的原因，而非異常結(jié)構(gòu)克隆，顯示在遺傳水平細胞未發(fā)生突變，不具致瘤性。

裸鼠體內(nèi)致瘤性也是檢驗細胞致瘤性的一項標準技術(shù)［16］，裸鼠為人工去胸腺培育動物，其自身排斥反應較小，目前已廣泛應用于腫瘤學研究中。本研究所選用的Hela細胞為宮頸癌細胞［17-19］，較之于其他來源腫瘤細胞，其特點為增殖異常迅速，從1951年發(fā)現(xiàn)至今，已培養(yǎng)了50多年，號稱“不死”細胞，目前已廣泛應用于腫瘤學相關(guān)疾病的研究中。本研究選擇Hela細胞為陽性對照組，對其進行裸鼠體內(nèi)移植研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Hela細胞在實驗裸鼠中種植后1周左右形成肉眼可見腫瘤，而另外3組細胞在移植3個月后均未觀察到裸鼠腋下腫瘤生長，提示rAAV-hTERT轉(zhuǎn)染髓核細胞在有限的體外培養(yǎng)時間內(nèi)不具有致瘤性，但其更長期的致瘤性還有待于進一步的觀察研究。

本實驗研究結(jié)果顯示通過體外構(gòu)建的rAAV-hTERT能成功轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)人髓核細胞并正確表達，通過對體外培養(yǎng)細胞的染色體核型分析及裸鼠成瘤實驗顯示，rAAV-hTERT轉(zhuǎn)染髓核細胞體外長期培養(yǎng)后未出現(xiàn)基因水平的突變，不具有裸鼠致瘤性，證實在體外培養(yǎng)一定時間內(nèi)rAAV-hTERT轉(zhuǎn)染髓核細胞是安全的，為進一步的rAAV-hTERT轉(zhuǎn)染髓核細胞的功能研究及體內(nèi)實驗提供了安全性證據(jù)。

［1］ Chang MW，Grillari J，Mayrhofer C，et al.Comparison of early passage，senescent and hTERT immortalized endothelial cells［J］.Exp Cell Res，2005，309(1):121-136.

［2］ Robertson DM，Li L，F(xiàn)isher S，et al.Characterization of growth and differentiation in a telomerase immortalized human corneal epithelial cell line［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2005，46(2):470-478.

［3］ Daya S，Berns KI.Gene therapy using adeno-associated virus vectors［J］.Clin Microbiol Rev，2008，21(4):583-593.

［4］ Cheung KM，Karppinen J，Chan D，et al.Prevalence and pattern of lumbar magnetic resonance imaging changes in a population study of one thousand forty-three individuals［J］.Spine(Phila Pa 1976)，2009，34(9):934-940.

［5］ 陳國仙，葉道明，王萬明，等.椎間盤退變機制研究進展［J］.脊柱外科雜志，2006，4(3):174-178.

［6］ 任大江，李放，孫天勝，等.腰椎間盤退變性下腰痛的病理生理學及治療對策的研究進展［J］.脊柱外科雜志，2008，6(4):246-248.

［7］ Allon AA，Aurouer N，Yoo BB，et al.Structured coculture of stem cells and disc cells prevent disc degeneration in a rat model［J］.Spine J，2010，10(12):1089-1097.

［8］ Yang X，Li X.Nucleus pulposus tissue engineering:a brief review［J］.Eur Spine J，2009，18(11):1564-1572.

［9］ Minogue BM，Richardson SM，Zeef LA，et al.Characterization of the human nucleus pulposus cell phenotype and evaluation of novel marker gene expression to define adult stem cell differentiation［J］.Arthritis Rheum，2010，62(12):3695-3705.

［10］ Harley CB.Telomerase therapeutics for degenerative diseases［J］.Curr Mol Med，2005，5(2):205-211.

［11］ Wu Z，Asokan A，Grieger JC，et al.Single amino acid changes can influence titer，heparin binding，and tissue tropism in different adeno-associated virus serotypes ［J］.J Virol，2006，80(22):11393-11397.

［12］ Wu Z，Asokan A，Samulski RJ.Adeno-associated virus serotypes:vector toolkit for human gene therapy［J］.Mol Ther，2006，14(3):316-327.

［13］ Grieger JC，Samulski RJ.Adeno-associated virus as a gene therapy vector:vector development，production and clinical applications［J］.Adv Biochem Eng Biotechnol，2005，99:119-145.

［14］ Dinculescu A，Glushakova L，Min SH，et al.Adeno-associated virus-vectored gene therapy for retinal disease［J］.Hum Gene Ther，2005，16(6):649-663.

［15］ Mao XG，Wang JH，Su WT，et al.Karyotypic evolution in family Hipposideridae(Chiroptera，Mammalia)revealed by comparative chromosome painting， G-and C-banding ［J］.Dongwuxue Yanjiu，2010，31(5):453-460.

［16］ Funakoshi-Tago M，Tago K，Sumi K，et al.The acute lymphoblastic leukemia-associated JAK2 L611S mutant induces tumorigenesis in nude mice［J］.J Biol Chem，2009，284(19):12680-12690.

［17］ 程麗，劉梅梅，隋麗華，等.YH-16對宮頸癌Hela細胞及其裸鼠皮下移植瘤作用研究［J］.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學，2008，16(1):7-10.

［18］ 石英愛，趙強，張海英，等.沉默HeLa細胞端粒酶活性對其在裸鼠體內(nèi)移植瘤生長的影響［J］.中國實驗診斷學，2009，13(9):1152-1154.

［20］ Rebecca Skloot.The immortal life of Henrietta Lacks［M］.New York:Crown Publishing Group，2010.