沈曉龍，周許輝，劉 洋，田 野，東 人，袁 文

建立理想的脊柱側(cè)凸動物模型是探索其發(fā)病機制、治療方法的重要步驟，同時為特發(fā)性脊柱側(cè)凸的深入研究提供參考。A型肉毒毒素(botulinum toxin A，BTX-A)能阻礙突觸前膜乙酰膽堿的釋放，使神經(jīng)肌肉接頭傳導(dǎo)受阻，從而導(dǎo)致肌肉松弛，甚至癱瘓［1］。本研究組前期研究發(fā)現(xiàn)BTX-A注射至雙足鼠一側(cè)椎旁肌，致椎旁肌力量失衡，可成功建立脊柱側(cè)凸模型。然而，BTX-A肌肉注射作用維持時間有限，一般注射后2～5 d起效，4周后肌肉可發(fā)生短暫顫動，13周后神經(jīng)肌肉接頭功能基本恢復(fù)，肌肉可正常收縮［2］。隨著BTX-A的作用消失，雙足鼠脊柱側(cè)凸角度該如何變化，追加注射側(cè)凸?fàn)顟B(tài)是否能夠復(fù)現(xiàn)，本研究將就這些問題做進(jìn)一步探討。

1 材料和方法

1.1 雙足鼠模型制備

30只4周齡雌性 SD大鼠(SPF級)，體重(94.8±5.4)g，由第二軍醫(yī)大學(xué)動物中心提供。采用10%水合氯醛，按照3 mL/kg的劑量對大鼠行腹腔注射麻醉。取雙側(cè)上肢環(huán)形切口，分離肌肉筋膜，結(jié)扎大血管，肩關(guān)節(jié)處截除上肢，止血后縫扎切口。所有大鼠術(shù)后即刻行高籠喂養(yǎng)，將飼料槽及飲水瓶懸高，根據(jù)大鼠身長情況，動態(tài)調(diào)整懸吊高度(見圖1)。雙足鼠模型建立1周后注射BTX-A。

圖1 雙足鼠站立取水 圖2 右側(cè)椎旁肌注射BTX-A，“×”為注射點Fig.1 Rats were able to stand immediately after the amputations of forelimbs Fig.2 BTX-A was injected at the 8 sites pointed by“ × ”within paraspinal muscle(5 mm apart)

1.2 模型分組

大鼠隨機分為3組，每組10只。BTX-A(蘭州生物制品研究所生產(chǎn))，白色干粉，每支100U，注射前臨時配制。腹腔注射麻醉下，于胸腰段后凸頂點向下切開皮膚1 cm，向上切開皮膚2 cm，分離筋膜，充分顯露右側(cè)椎旁肌，于大鼠胸椎后凸頂點上下各1 cm處多點注射(見圖2)，A、B組雙足鼠胸椎右側(cè)肌肉多點注射 6.25 U/100 g的 BTX-A，0.5 mL;C組雙足鼠右側(cè)椎旁肌多點注射0.9%的生理鹽0.5 mL。注射完畢縫扎切口，普通籠喂養(yǎng)，3 d后轉(zhuǎn)入高籠喂養(yǎng)。B組雙足鼠于首次注射6周后追加注射6.25 U/100 g的BTX-A 1次A組及C組注射等量生理鹽水。注射完畢縫扎切口，普通籠喂養(yǎng)，3 d后轉(zhuǎn)入高籠喂養(yǎng)。

1.3 X 線檢查

首次BTX-A注射2周、4周、6周、8周、12周后分別行X線檢查。腹腔麻醉下將大鼠放置特制盒內(nèi)，保持大鼠正中直立狀態(tài)，避免骨盆及雙肩傾斜，拍攝正側(cè)位X線片。

1.4 統(tǒng)計分析

相關(guān)數(shù)據(jù)輸入 SPSS 16.0軟件(SPSS Inc.，美國)，計量資料用(±s)表示，采用一般線性模型實現(xiàn)重復(fù)測量資料的方差分析，用Multivariate實現(xiàn)組間兩兩比較，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 雙足鼠模型

大鼠雙側(cè)上肢截除手術(shù)時間為(12.3±1.6)min。大鼠麻醉完全蘇醒后可雙足行走、站立。雙足鼠模型建立1周后體重為(97.8±6.6)g。

2.2 X線檢查結(jié)果

注射BTX-A 2周、4周、6周、8周、12周后分別行X線檢查，X線片提示雙足鼠出現(xiàn)脊柱側(cè)凸，且凸向注射側(cè)(見圖3)，C組未發(fā)現(xiàn)明顯脊柱側(cè)凸，各組側(cè)凸Cobb角測量結(jié)果見表1。

圖3 注射BTX-A后X線檢查結(jié)果(右側(cè)為注射側(cè))Fig.3 X-ray results of spine curveafter injection of BTX-A(The right were injection sites)

表1 雙足鼠脊柱側(cè)凸角度變化Tab.1 Mean Cobb’s angles at different times

重復(fù)測量數(shù)據(jù)滿足 Huynh-Feldt條件(P=0.556)，接受“球形假設(shè)”。方差分析提示A、B組與C組測量結(jié)果差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=473.996，P＜0.05)，且不同時間的側(cè)凸角度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(multivariate tests，F(xiàn)=51.968，P＜0.05)，組間與組內(nèi)因素存在交互作用(F=38.453，P＜0.05)。

各時間點兩兩比較用多元方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。A、B組在注射后2周、4周、6周側(cè)凸角度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);8周及12周時A組側(cè)凸角度與B組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);A組12周后側(cè)凸角度與C組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05，見表2)。

表2 各時間點X線檢查結(jié)果組間比較的P值Tab.2 Comparison(P value)of mean Cobb’s angles among groups

B組大鼠的側(cè)凸角度趨勢分析提示首次注射后隨時間的推移，側(cè)凸角度逐漸下降;追加注射，側(cè)凸角度可增大;隨后角度再次逐漸減小(見圖4)。

圖4 不同時間點各組大鼠側(cè)凸角度的趨勢分析Fig.4 Trend analysis of mean Cobb’s angles at different time points among groups

3 討 論

3.1 大鼠側(cè)凸模型的建立

大鼠脊柱側(cè)凸模型的研究一直是學(xué)者們關(guān)注的熱點。Sarwark等［3］報道利用絲線栓系大鼠肩胛骨下角及同側(cè)骨盆制造側(cè)凸模型，研究發(fā)現(xiàn)至少栓系6周才能出現(xiàn)結(jié)構(gòu)性脊柱側(cè)凸。Joe［4］最先通過電刺激大鼠一側(cè)椎旁肌的方法建立脊柱側(cè)凸模型，研究發(fā)現(xiàn)凸側(cè)位于非刺激側(cè)，側(cè)凸角度隨著時間的累積而不斷加大，3周時側(cè)凸角度平均為18.6°，停止電刺激后側(cè)凸角度沒有明顯丟失。日本學(xué)者M(jìn)achida等［5-6］通過截除雙上肢建立直立的雙足鼠模型，發(fā)現(xiàn)松果體切除(阻斷褪黑素分泌)的雙足鼠出現(xiàn)脊柱側(cè)凸，而松果體切除的四足鼠和保留松果體的雙足鼠并未發(fā)生脊柱側(cè)凸。這與Oyama等［7］的實驗結(jié)果類似，其認(rèn)為褪黑素缺乏及直立姿勢是鼠類模型脊柱側(cè)凸發(fā)生、發(fā)展的重要條件。Smith等［8］報道通過栓系兔T4～10的一側(cè)椎板，制造出緩慢進(jìn)展的結(jié)構(gòu)性側(cè)凸動物模型。此后，通過栓系等純機械外力的造模方式不斷被研究者采用。Newton等［9］報道了經(jīng)右側(cè)胸腔入路鋼絲栓系小牛的T6，7或T7，8椎體前外側(cè)，12周后發(fā)現(xiàn)小牛出現(xiàn)12°的胸椎側(cè)凸。Braun等［10-11］通過對山羊 T5～L1脊柱左后方栓系聯(lián)合左側(cè)肋骨捆綁及右側(cè)肋骨切除建立動物模型，由于此模型有椎體及椎間盤楔形變、椎體旋轉(zhuǎn)及側(cè)凸進(jìn)展等表現(xiàn)，能很好的模擬特發(fā)性脊柱側(cè)凸的特點，此方法建模為今后研究特發(fā)性脊柱側(cè)凸提供了實驗基礎(chǔ)。國內(nèi)不少學(xué)者通過栓系雙足鼠肋骨或肩胛骨與髂骨建立脊柱側(cè)凸模型［12-14］。

目前文獻(xiàn)報道的造模方法存在明顯不足，如模型動物與人類種屬差異太大、不能模擬人類直立姿勢、模型椎體無明顯旋轉(zhuǎn)、通過栓系等外力牽拉作用限制了脊柱的活動范圍、模型側(cè)凸范圍過大等［15］。

本研究組通過對雙足鼠一側(cè)椎旁肌注射BTX-A建立脊柱側(cè)凸模型，該模型具有以下優(yōu)點:①雙足鼠模擬人類直立姿勢;②大鼠局部脊柱椎旁肌注射不累及整個脊柱;③大鼠脊柱活動性完好，脊柱各方向活動不受外力影響;④側(cè)凸伴有椎體旋轉(zhuǎn);⑤相對于栓系等方法創(chuàng)傷更小。

3.2 BTX-A 特性

BTX-A通過阻斷膽堿能神經(jīng)末端的鈣離子通道，進(jìn)而阻止突觸前膜乙酰膽堿的釋放，阻斷神經(jīng)沖動的傳遞，起到了化學(xué)去神經(jīng)作用，最終造成肌肉無法收縮，出現(xiàn)局部肌肉麻痹無力［16］。目前已上市的醫(yī)用 BTX-A有 Botox(Allergan，美國)、Dysport(Ipsen、Medicis，法國、美國)及衡力(蘭州生物制品研究，中國)。Botox注射后一般2～5 d起效，2周左右注射區(qū)域出現(xiàn)軸突出芽現(xiàn)象，4周后可傳遞神經(jīng)沖動，肌肉僅可發(fā)生短暫顫動，9周后軸突停止出芽，13周后神經(jīng)肌肉接頭功能基本恢復(fù)，肌肉可正常收縮［2］。

本實驗組發(fā)現(xiàn)BTX-A椎旁肌注射2周時側(cè)凸最嚴(yán)重，隨后側(cè)凸角度逐漸減輕，至注射后12周側(cè)凸基本完全消失，側(cè)凸角度隨時間推移呈線性關(guān)系減小。追加注射BTX-A側(cè)凸可加重，提示BTX-A注射導(dǎo)致大鼠椎旁肌力量失衡進(jìn)而導(dǎo)致的脊柱側(cè)凸是非結(jié)構(gòu)性的，當(dāng)BTX-A作用消失，雙足鼠兩側(cè)椎旁肌力量逐漸平衡，側(cè)凸將逐漸減小直至消失，追加注射BTX-A后椎旁肌力量再次失衡，脊柱側(cè)凸明顯加重。該實驗有力地證明了椎旁肌力量失衡可導(dǎo)致脊柱側(cè)凸的發(fā)生。

研究椎旁肌力量與脊柱側(cè)凸的關(guān)系，可能為脊柱側(cè)凸患者，特別是特發(fā)性脊柱側(cè)凸患者的病因?qū)W研究及治療提供參考。本實驗尚存在一些不足之處，如觀察時間間隔較大，未能明確BTX-A注射后側(cè)凸角度精確的變化趨勢;如反復(fù)追加注射BTX-A，大鼠側(cè)凸能否繼續(xù)維持，是否能轉(zhuǎn)變?yōu)榻Y(jié)構(gòu)性側(cè)凸。本實驗僅是課題研究的一部分，上述問題與注射BTX-A后椎旁肌的顯微結(jié)構(gòu)變化、相關(guān)蛋白表達(dá)分析將在今后的實驗做進(jìn)一步研究。

雙足鼠椎旁肌力量失衡可導(dǎo)致脊柱側(cè)凸的發(fā)生。一側(cè)椎旁肌注射BTX-A，雙足鼠可出現(xiàn)脊柱側(cè)凸，隨時間推移側(cè)凸逐漸減輕，追加注射BTX-A側(cè)凸可加重。

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