李 超，李 明

腰痛是臨床常見病之一，據(jù)統(tǒng)計約有85%的人一生中會出現(xiàn)該癥狀，是45歲以上的人喪失勞動能力的主要原因之一。椎間盤退行性疾病(disc degeneration disease，DDD)是腰痛主要的原因之一。傳統(tǒng)的脊柱融合的治療方法能夠有效地緩解疼痛，但會導(dǎo)致脊柱活動度的下降和鄰近椎間盤的退變。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSC)移植治療腰椎退行性疾病作為新型的治療手段，與傳統(tǒng)方法相比有很多優(yōu)勢，在基礎(chǔ)與臨床研究方面都取得了很大的進(jìn)展。

1 DDD的病理改變

DDD作為與年齡密切相關(guān)的疾病，目前的確切病因尚不清楚。各種病因，如年齡、遺傳因素、吸煙等［1］共同作用，導(dǎo)致了椎間盤的病理變化。①細(xì)胞種類的改變:終板多由圓形的軟骨樣細(xì)胞構(gòu)成，而纖維環(huán)多由狹長的軟骨樣細(xì)胞構(gòu)成，這兩部分的細(xì)胞成分較少變化。未成熟的髓核中存在部分脊索細(xì)胞，相對于其他細(xì)胞而言，有著更強(qiáng)的分泌蛋白聚糖與Ⅱ型膠原的能力，隨著年齡的增長(約4～10歲)逐漸被軟骨樣的細(xì)胞替代，脊索細(xì)胞的消失被認(rèn)為是椎間盤退變的重要原因之一［2］。②細(xì)胞老化壞死與細(xì)胞凋亡:Le Maitre等［3］發(fā)現(xiàn)在退化的椎間盤中P16INK4A，β半乳糖苷酶等細(xì)胞老化的標(biāo)志物表達(dá)上升，同時細(xì)胞的增值能力下降。隨著細(xì)胞的老化與營養(yǎng)供應(yīng)的不足，椎間盤的微環(huán)境出現(xiàn)變化，包括氧分壓、PH值、自由基的增加等［4］，微環(huán)境的改變誘導(dǎo)了細(xì)胞的壞死與凋亡。據(jù)報道，退變的椎間盤壞死的細(xì)胞比例可高達(dá)50%［5］。③細(xì)胞表達(dá)的變化:退變的椎間盤細(xì)胞蛋白合成結(jié)構(gòu)與生長因子等均發(fā)生了改變，如Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ、Ⅵ型膠原纖維與白細(xì)胞介素-1α(interleukin-1α，IL-1α)、IL-1β、IL-6、IL-1-RI含量的增加，Ⅱ、Ⅸ型膠原纖維、蛋白聚糖、IL-1-Ra含量的降低［6］，細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)減少。特別是Ⅰ/Ⅱ型膠原蛋白比例的上升和蛋白聚糖、基質(zhì)含量的減少，被認(rèn)為是DDD特征性的病理變化之一。上述細(xì)胞組織在病理狀態(tài)下的改變最終導(dǎo)致椎間盤水含量的降低，凝膠狀髓核逐漸干裂，加之外層纖維環(huán)張力的下降，最終導(dǎo)致了椎間盤高度的下降、纖維環(huán)的破裂和髓核的疝出。

2 MSC的特點

MSC是來自于未成熟的胚胎結(jié)締組織的多能干細(xì)胞，在體內(nèi)或體外特定的誘導(dǎo)條件下可分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶、神經(jīng)、肝、心肌、內(nèi)皮等多種組織細(xì)胞，連續(xù)傳代培養(yǎng)和冷凍保存后仍具有多向分化潛能。在人的骨髓中，MSC的密度約為百萬分之一到萬分之一，其免疫表型表現(xiàn)為CD29+，CD44+，CD71+，CD90+，CD106+，CD14－，CD4－，CD45－，HLA-Ⅱ陰性。MSC移植應(yīng)用于治療DDD有其自身的優(yōu)勢:①MSC來源廣泛，存在于骨髓、脂肪等間質(zhì)組織，相對于自身椎間盤髓核細(xì)胞(nucleus pulposuscell，NPC)移植而言，其提取不會損傷椎間盤，易于提取和培養(yǎng)增殖。②退化的椎間盤中的組織基因表達(dá)改變，合成Ⅱ型膠原與蛋白聚糖的能力下降，MSC不存在此問題。③MSC存在自我復(fù)制和分化的能力，相對于成熟細(xì)胞，MSC更易于誘導(dǎo)分化。④MSCHLA-Ⅱ型抗原陰性，免疫反應(yīng)較弱，為同種異體移植提供了可能。

3 MSC分化的誘導(dǎo)

3.1 生物支架

生物支架能夠模擬椎間盤的微環(huán)境，提高M(jìn)SC移植效率。Merceron等［7］提出生物支架必須兼?zhèn)渖锝M織相容性，體內(nèi)降解能力，三維的內(nèi)部構(gòu)像，合適的機(jī)械強(qiáng)度等條件。目前常用的有藻酸鹽凝膠、聚氨基葡萄糖凝膠、藻酸丙二醇酯、膠原海綿等多種，哪種支架能夠提供最佳的生物學(xué)效果目前尚無定論［4］。Gruber等［8］對比了膠原海綿、膠原凝膠、瓊脂糖、藻酸鹽，發(fā)現(xiàn)膠原海綿支架有著良好的誘導(dǎo)細(xì)胞增殖與基因表達(dá)能力，但是盡管膠原凝膠支架中的細(xì)胞增殖能力最強(qiáng)，其合成基質(zhì)的能力較低，限制了其應(yīng)用。Richardson等［9］報道了復(fù)合左旋乳酸支架能夠誘導(dǎo)MSC向椎間盤中NPC分化，隨后的研究發(fā)現(xiàn)殼聚糖-甘油磷酸酯凝膠可誘導(dǎo)MSC向軟骨樣細(xì)胞分化，并表達(dá)膠原與蛋白聚糖。Vinatier等［10］通過動物實驗證實了水凝膠類支架有著良好的效果，其誘導(dǎo)效果與其他支架相近，其可注射的特點使其在臨床應(yīng)用中有著更廣闊的前景。

3.2 MSC培養(yǎng)的微環(huán)境

正常人體組織中椎間盤的環(huán)境可以誘導(dǎo)MSC細(xì)胞向NPC分化，其作用與通過膠原等大分子和MSC膜表面的信號通路接觸有關(guān)，目前認(rèn)為NPC的存在可以誘導(dǎo)MSC細(xì)胞向NPC分化，而MSC也可促進(jìn)NPC自身的修復(fù)與表達(dá)。Allon等［11］將 MSC與NPC共同培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)MSC在保持自身數(shù)量的同時存在向軟骨樣細(xì)胞分化的現(xiàn)象，其結(jié)構(gòu)全部為外層的軟骨樣細(xì)胞包裹內(nèi)層的MSC細(xì)胞，并在培養(yǎng)基中呈微衛(wèi)星放射樣分布。Sobajima等［12］將MSC與NPC按照不同的比例混合培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)NPC與MSC比例為75∶25或50∶50時培養(yǎng)基產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)含量最高。MSC培養(yǎng)的物理環(huán)境，如低氧、PH值等可誘導(dǎo)MSC向能夠分泌蛋白聚糖及基質(zhì)的軟骨樣細(xì)胞分化。Felka等［13］通過MSC的體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)低氧能夠誘導(dǎo)MSC向軟骨樣細(xì)胞分化，并增加細(xì)胞外基質(zhì)的分泌。Wuertz等［14］提取兔MSC在體外培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)酸性環(huán)境可抑制MSC的分化與增殖。

3.3 細(xì)胞因子

細(xì)胞因子可以調(diào)節(jié)MSC的增殖、分化和基質(zhì)的合成［15］，Steck 等［16］提取人 MSC 在含轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGT-β)藻酸鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)TGF-β可促進(jìn)MSC表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子9分泌，并提高膠原與聚糖蛋白的表達(dá)。Yang等［17］將54只椎間盤損傷模型兔隨機(jī)分為3組，分別予纖維凝膠-MSC-TGF-β1、纖維凝膠-TGF-β1 及空白對照處理，發(fā)現(xiàn)第1組可有效減緩?fù)米甸g盤退變。IGF-1可以誘導(dǎo)MSC向軟骨組織的分化，Ehlicke等［18］在體外以不同細(xì)胞因子誘導(dǎo)MSC向NPC分化3周，以熒光免疫法檢測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)、成纖維生長因子-2(fibroblast growth factor-2，F(xiàn)GF-2)，血小板衍生生長因子(platelet derived growth factor-BB，PDGF-BB)有誘導(dǎo)MSC分化與基質(zhì)合成的作用。Shen等［19］以 TGF-β3 同骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)誘導(dǎo)MSC分化，發(fā)現(xiàn)TGF-β3明顯增加蛋白聚糖及Ⅱ型膠原的表達(dá)，而這一作用可被BMP-2加強(qiáng)。Chiou等［20］的研究發(fā)現(xiàn)FGF-2可能通過MAPK信號旁路誘導(dǎo)MSC向軟骨樣細(xì)胞分化。Imai等［21］將人NPC在含重組人成 骨 蛋 白-1(recombination human osteegenic protein-1，rhOP-1)培養(yǎng)基中培養(yǎng)14 d，發(fā)現(xiàn)rhOP-1可促進(jìn)細(xì)胞增殖與產(chǎn)物表達(dá)。在MSC與NPC共培養(yǎng)的過程中，MSC與NPC可相互促進(jìn)這些細(xì)胞因子的分泌，并以此誘導(dǎo)MSC向NPC分化、NPC的增殖及產(chǎn)物的表達(dá)。

4 MSC體內(nèi)植入研究

Zhang等［22］報道了MSC與髓核細(xì)胞混合培養(yǎng)后植入山羊椎間盤退變模型中，經(jīng)過6個月后發(fā)現(xiàn)實驗組椎間盤中蛋白聚糖濃度較對照組(只注入培養(yǎng)基)高45%。Yang等［17］將家兔椎間盤退變模型分為MSC-TGF-β1聯(lián)合注入組，單純 TGF-β1注入組和空白組，結(jié)果顯示相對于單純TGF-β1注入組，MSC有效減緩椎間盤退變，膠原及蛋白多糖的積聚明顯多于空白組與單純 TGF-β1注入組。Sakai等［23］在家兔退變椎間盤模型制成2周后，分別移植入MSC，24周后檢查正常椎間盤、模擬手術(shù)椎間盤和移植后椎間盤的X線片椎間盤高度、MRI T2信號的改變，組織學(xué)、免疫組織化學(xué)和基質(zhì)關(guān)聯(lián)的基因表達(dá)。結(jié)果顯示移植MSCs組椎間盤的高度為正常對照組的91%、T2信號強(qiáng)度為正常對照組81%，免疫組織化學(xué)和基因表達(dá)分析有蛋白多糖積聚。而模擬手術(shù)椎間盤只有正常對照組的61%和60%。Crevensten等［24］將白鼠異體MSC以透明質(zhì)酸凝膠為支架注入尾骨椎間盤內(nèi)，單獨注射凝膠為對照組。2周后以免疫熒光法可觀察到存活MSC細(xì)胞，4周后發(fā)現(xiàn)實驗組椎間盤較對照組有增高趨勢。Sobajima等［12］以 β-半乳糖苷酶標(biāo)記兔 MSC，分別注入12只兔L2/L3/L4/L5髓核內(nèi)，在3周、6周、12周及24周觀察干細(xì)胞情況，發(fā)現(xiàn)24周時MSC存活良好，未發(fā)現(xiàn)不良反應(yīng)，并且在周圍纖維環(huán)中觀測到MSC的存在。Wang 等［25］對獼猴 L3/L4、L5/L6椎間盤摘除術(shù)后，隨機(jī)分組做陶瓷椎間盤、自體髂骨移植融合及骨髓MSC陶瓷混合融合等3種替代治療，3個月分析融合及基質(zhì)、膠原產(chǎn)生情況，結(jié)果顯示混合組融合最佳，相對于其他2組膠原與蛋白聚糖的積累有顯著差異。Hiyama等［26］將犬分為不作處理對照組，髓核摘除組和MSC組，其中MSC組在髓核摘除4周后給予MSC注入，12周后觀察結(jié)果，發(fā)現(xiàn)MSC組椎間盤退變較其他組緩慢，其作用可能是通過表達(dá)人凋亡相關(guān)因子配體以維持髓核免疫豁免狀態(tài)。Yang等［27］將異體鼠MSC注入鼠退變椎間盤內(nèi)，觀察12周，發(fā)現(xiàn)NPC蛋白聚糖基因表達(dá)上調(diào)，而原位雜交與免疫組化分析可發(fā)現(xiàn)MSC向NPC分化的現(xiàn)象，證實MSC可通過分化與增殖為NPC并促進(jìn)NPC產(chǎn)物表達(dá)在體內(nèi)發(fā)揮其保護(hù)椎間盤的作用。Henriksson等［28］將椎間盤退變豬分為2組，分別給予人MSC與人MSC-水凝膠，在1個月、3個月和6個月觀察，MRI發(fā)現(xiàn)所有椎間盤均出現(xiàn)退變，但人MSC-水凝膠組退變較慢，證實水凝膠類在機(jī)體內(nèi)仍可發(fā)揮其促進(jìn)MSC分化與基因表達(dá)的作用，同時探討了異種MSC用于治療DDD的可能性。Wei等［29］將熒光標(biāo)記人MSC分為CD34+組與CD34－組注入鼠尾骨椎間盤，42 d后發(fā)現(xiàn)MSC存活情況良好，在21 d后發(fā)現(xiàn)CD34－組MSC存在向NPC分化現(xiàn)象，而CD34+無此現(xiàn)象，且在所有椎間盤內(nèi)均無炎細(xì)胞的聚集，證實異種MSC可存活、分化、表達(dá)且有免疫豁免。由于MSC治療DDD開展時間相對較短，其安全性尚有待進(jìn)一步驗證，臨床報道的人體實驗很少。Yoshikawa等［30］報道了2名腰椎椎管狹窄合并椎間盤退行性變的病例，在髂骨取MSC在體外含自體血清的培養(yǎng)基增殖后，以膠原海綿為支架植入退化椎間盤內(nèi)，2年后行MRI檢查，椎間盤無退化跡象。

應(yīng)用MSC治療DDD，針對病因治療，避免了傳統(tǒng)治療手段脊椎活動受限、相鄰節(jié)段椎間盤退變等并發(fā)癥，在動物實驗中已取得了良好的效果，擁有廣闊的臨床應(yīng)用前景［31］。然而，還有許多問題亟待解決:①細(xì)胞因子與髓核細(xì)胞誘導(dǎo)MSC分化的機(jī)制及分子生物學(xué)基礎(chǔ)尚不明確。②缺乏嚴(yán)密設(shè)計的人體相關(guān)試驗，臨床安全性未得到評估。③MSC移植作為治療手段，在臨床應(yīng)用的時機(jī)有待確定。相信在醫(yī)務(wù)工作者的不懈努力下，這些問題不日將得到解決，MSC將在治療椎間盤退變性疾病方面發(fā)揮更大的作用。

［1］ Kalichman L，Hunter DJ.The genetics of intervertebral disc degeneration.Familial predisposition and heritability estimation［J］.Joint Bone Spine，2008，75(4):383-387.

［2］ Guehring T，Wilde G，Sumner M，et al.Notochordal intervertebral disc cells:sensitivity to nutrient deprivation［J］.Arthritis Rheum，2009，60(4):1026-1034.

［3］ Le Maitre CL，F(xiàn)reemont AJ，Hoyland JA.Accelerated cellular senescence in degenerate intervertebral discs:a possible role in the pathogenesis of intervertebral disc degeneration［J］.Arthritis Res Ther，2007，9(3):R45.

［4］ Woods BI，Sowa G，Vo N，et al.A Change in Strategy:The Use of Regenerative Medicine and Tissue Engineering to Augment the Course of Intervertebral Disc Degeneration［J］.Oper Tech Orthop，2010，20(2):144-153.

［5］ Reza AT，Nicoll SB.Characterization of novel photocrosslinked carboxymethylcellulose hydrogels for encapsulation of nucleus pulposus cells［J］.Acta Biomater，2010，6(1):179-186.

［6］ Zhao CQ，Wang LM，Jiang LS，et al.The cell biology of intervertebral disc aging and degeneration［J］.Ageing Res Rev，2007，6(3):247-261.

［7］ Merceron C，Vinatier C，Clouet J，et al.Adipose-derived mesenchymal stem cells and biomaterials for cartilage tissue engineering［J］.Joint Bone Spine，2008，75(6):672-674.

［8］ Gruber HE，Leslie K，Ingram J，et al.Cell-based tissue engineering for the intervertebral disc:in vitro studies of human disc cell gene expression and matrix production within selected cell carriers［J］.Spine J，2004，4(1):44-55.

［9］ Richardson SM，Hughes N，Hunt JA，et al.Human mesenchymal stem cell differentiation to NP-like cells in chitosan-glycerophosphate hydrogels［J］.Biomaterials，2008，29(1):85-93.

［10］ Vinatier C，Mrugala D，Jorgensen C，et al.Cartilage engineering:a crucial combination of cells，biomaterials and biofactors［J］.Trends Biotechnol，2009，27(5):307-314.

［11］ Allon AA，Aurouer N，Yoo BB，et al.Structured coculture of stem cells and disc cells prevent disc degeneration in a rat model［J］.Spine J，2010，10(12):1089-1097.

［12］ Sobajima S，Vadala G，Shimer A，et al.Feasibility of a stem cell therapy for intervertebral disc degeneration［J］.Spine J，2008，8(6):888-896.

［13］ Felka T，Schfer R，Schewe B，et al.Hypoxia reduces the inhibitory effect of IL-1beta on chondrogenic differentiation of FCS-free expanded MSC［J］.Osteoarthritis Cartilage，2009，17(10):1368-1376.

［14］ Wuertz K，Godburn K，Neidlinger-Wilke C，et al.Behavior of mesenchymal stem cells in the chemical microenvironment of the intervertebral disc［J］.Spine(Phila Pa 1976)，2008，33(17):1843-1849.

［15］ Chen WH，Liu HY，Lo WC，et al.Intervertebral disc regeneration in an ex vivo culture system using mesenchymal stem cells and platelet-rich plasma［J］.Biomaterials，2009，30(29):5523-5533.

［16］ Steck E，Bertram H，Abel R，et al.Induction of intervertebral disc-like cells from adult mesenchymal stem cells［J］.Stem Cells，2005，23(3):403-411.

［17］ Yang H，Wu J，Liu J，et al.Transplanted mesenchymal stem cells with pure fibrinous gelatin-transforming growth factor-beta1 decrease rabbit intervertebral disc degeneration［J］.Spine J，2010，10(9):802-810.

［18］ Ehlicke F，F(xiàn)reimark D，Heil B，et al.Intervertebral disc regeneration:influence of growth factors on differentiation of human mesenchymal stem cells(hMSC)［J］.Int J Artif Organs，2010，33(4):244-252.

［19］ Shen B，Wei A，Tao H，et al.BMP-2 enhances TGF-beta3-mediated chondrogenic differentiation of human bone marrow multipotent mesenchymal stromal cells in alginate bead culture［J］.Tissue Eng Part A，2009，15(6):1311-1320.

［20］ Chiou M，Xu Y，Longaker MT.Mitogenic and chondrogenic effects of fibroblast growth factor-2 in adipose-derived mesenchymal cells［J］.Biochem Biophys Res Commun，2006，343(2):644-652.

［21］ Imai Y，Miyamoto K，An HS，et al.Recombinant human osteogenic protein-1 upregulates proteoglycan metabolism of human anulus fibrosus and nucleus pulposus cells［J］.Spine(Phila Pa 1976)，2007，32(12):1303-1309.

［22］ Zhang Y，Drapeau S，Howard SA，et al.Transplantation of goat bone marrow stromal cells to the degenerating intervertebral disc in a goat disc injury model［J］.Spine(Phila Pa 1976)，2011，36(5):372-377.

［23］ Sakai D，Mochida J，Iwashina T，et al.Regenerative effects of transplanting mesenchymal stem cells embedded in atelocollagen to the degenerated intervertebral disc［J］.Biomaterials，2006，27(3):335-345.

［24］ Crevensten G，Walsh AJ，Ananthakrishnan D，et al.Intervertebral disc cell therapy for regeneration:mesenchymal stem cell implantation in rat intervertebral discs［J］.Ann Biomed Eng，2004，32(3):430-434.

［25］ Wang T，Dang G，Guo Z，et al.Evaluation of autologous bone marrow mesenchymal stem cell-calcium phosphate ceramic composite for lumbar fusion in rhesus monkey interbody fusion model［J］.Tissue Eng，2005，11(7-8):1159-1167

［26］ Hiyama A，Mochida J，Iwashina T，et al.Transplantation of mesenchymal stem cells in a canine disc degeneration model［J］.J Orthop Res，2008，26(5):589-600.

［27］ Yang F，Leung VY，Luk KD，et al.Mesenchymal stem cells arrest intervertebral disc degeneration through chondrocytic differentiation and stimulation of endogenous cells［J］.Mol Ther，2009，17(11):1959-1966.

［28］ Henriksson HB，Svanvik T，Jonsson M，et al.Transplantation of human mesenchymal stems cells into intervertebral discs in a xenogeneic porcine model［J］.Spine(Phila Pa 1976)，2009，34(2):141-148.

［29］ Wei A，Tao H，Chung SA，et al.The fate of transplanted xenogeneic bone marrow-derived stem cells in rat intervertebral discs［J］.J Orthop Res，2009，27(3):374-379.

［30］ Yoshikawa T，Ueda Y，Miyazaki K，et al.Disc regeneration therapy using marrow mesenchymal cell transplantation:a report of two case studies［J］.Spine(Phila Pa 1976)，2010，35(11):E475-480.

［31］ 張燕，吳劍宏，王超鋒，等.非接觸式共培養(yǎng)體系對臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向類髓核細(xì)胞的誘導(dǎo)分化效應(yīng)［J］.脊柱外科雜志，2011，9(4):249-252.