陳飛 盧火佺 臧發(fā)榮 周雪鋒

[摘要] 目的 探討血清中l(wèi)et—7、miR—125b—1、miR—21水平與非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）的相關(guān)性。 方法 收集NSCLC患者與健康對(duì)照人群的血清，通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)并比較外周血let—7、miR—125b—1、miR—21的表達(dá)水平。 結(jié)果 let—7、miR—125b—1表達(dá)量在NSCLC患者血清中均低于對(duì)照組，而miR—21表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均為P < 0.01）。其與健康對(duì)照組血清的比值平均為21.1%、13.5%、207.4%。 結(jié)論 外周血let—7、miR—125b—1、miR—21水平可能成為一種新的生物標(biāo)記物用于NSCLC的早期診斷。

[關(guān)鍵詞] 非小細(xì)胞肺癌；miRNA；血清；早期診斷

[中圖分類號(hào)] R734.2[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B[文章編號(hào)] 1673—9701（2012）25—0056—02

Correlation study on serum levels of three miRNA and early diagnosis of non—small cell lung cancer

CHEN Fei LU Huoquan ZANG Farong ZHOU Xuefeng

Department of Respiratory Medicine， Changxing County Peoples Hospital in Zhejiang Province， Changxing 313100， China

[Abstract] Objective To investigate the correlation of let—7， miR—125b—1， miR—21 level in the peripheral blood and non—small cell lung cancer （NSCLC）. Methods Serum of NSCLC patients and healthy control subjects were collected. Let—7， miR—125b—1 and miR—21 levels were detected by fluorescence quantitative PCR and compared. Results Serum let—7， miR—125b—1 levels in NSCLC patients were significantly decreased， while miR—21 expression was significantly increased （both P < 0.01） than that in the healthy controls. The average ratio of let—7， miR—125b—1 and miR—21 level in the patients and the controls were 21.1% 13.5% and 207.4%， respectively. Conclusion Let—7， miR—125b—1 and miR—21 levels in the peripheral blood may be new biomarkers for early diagnosis of NSCLC.

[Key words] Non—small cell lung cancer； miRNA； Serum； Early diagnosis

肺癌的死亡率在很多國(guó)家和地區(qū)居首位，其5年存活率多年來(lái)無(wú)顯著改善，這與缺乏有效的早期診斷與治療手段有關(guān)。miRNA是一種長(zhǎng)度為18—24核苷酸的內(nèi)源性小分子RNA，可與靶基因mRNA的3'端互補(bǔ)區(qū)結(jié)合，調(diào)控靶基因的表達(dá)與翻譯，參與細(xì)胞增殖、分化、發(fā)育、凋亡等一系列生命活動(dòng)。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA還起到原癌基因、抑癌基因的作用，并具有明顯的腫瘤組織特異性與表達(dá)穩(wěn)定性[1]。let—7、miR—125b—1、miR—21等與非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）的關(guān)系密切，在肺癌組織中表達(dá)量顯著異常[2，3]，有望成為NSCLC的早期診斷標(biāo)志物，但其血液中表達(dá)水平與NSCLC的關(guān)系尚不明確。本文即探討let—7、miR—125b—1、miR—21在血液中的表達(dá)水平與NSCLC發(fā)生的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

56例液氮保存的血清標(biāo)本來(lái)自我院2007年2月～2010年10月收治的非小細(xì)胞肺癌患者，其中男43例，女13例，年齡35～71歲，平均53.9歲。患者術(shù)前均未行腫瘤化療。診斷符合WHO非小細(xì)胞肺癌診斷標(biāo)準(zhǔn)（1999年第3版）。另取同期無(wú)肺部病變健康體檢者血清56例作對(duì)照，其中男41例，女15例，年齡22～64歲，平均52.1歲。兩組人群的性別構(gòu)成、平均年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 材料

miRcute miRNA提取分離試劑盒購(gòu)自天根公司：逆轉(zhuǎn)錄試劑盒與SYBR Green熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司。let—7、miR—125b—1、miR—21及表達(dá)內(nèi)參miR—22引物均購(gòu)自廣州市銳博生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 RNA樣本的制備凍存的血清標(biāo)本快速?gòu)?fù)溫，取400 μL融解血清按照miRcute miRNA提取分離試劑盒說(shuō)明書(shū)要求提取，RNA最終用DEPC水溶解，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)提取的RNA純度，OD260/OD280比值>1.8。

1.3.2 逆轉(zhuǎn)錄以逆轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)擴(kuò)增目標(biāo)基因，采用20 μL反應(yīng)體系：dNTP mix（100 mmol/L）0.2 μL，Multiscribe逆轉(zhuǎn)錄酶（50 U/μL）1.0 μL，10×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液2 μL，RNA酶抑制劑（20 U/μL）1 μL，去核酸酶水9.8 μL，混合逆轉(zhuǎn)引物1 μL引物，5 μL RNA。根據(jù)TaKaRa公司試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，輕輕混勻，短暫離心，冰上放置。RT—PCR反應(yīng)條件：16℃，30 min；42℃，30 min；85℃，5 min；4℃保存。

1.3.3 熒光定量PCR總反應(yīng)體系為20μL：2×SYBR Green熒光定量預(yù)混液10 μL，上述擴(kuò)增的cDNA（1∶20稀釋）2 μL，去核酸酶水7.0 μL，引物1 μL。通過(guò)Roche Light Cyeler 480實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。反應(yīng)參數(shù)：95℃，1 min；95℃，15 s；60℃，45 s共40個(gè)循環(huán)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3種miRNA表達(dá)結(jié)果以miR—22的表達(dá)水平為內(nèi)參，隨機(jī)以其中一個(gè)血清樣品為陽(yáng)性對(duì)照。利用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析，表達(dá)量的相對(duì)比值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

NSCLC患者與健康人群的血清RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增后，行熒光定量PCR檢測(cè)各miRNA的表達(dá)量，以miR—22為內(nèi)參計(jì)算其相對(duì)比值。let—7、miR—125b—1表達(dá)量在NSCLC患者血清中均低于對(duì)照組，miR—21表達(dá)量顯著高于對(duì)照組（均為P < 0.01），見(jiàn)表1。其與健康對(duì)照者血清的比值平均為21.1%、13.5%、207.4%，見(jiàn)圖1。提示let—7、miR—125b—1、miR—21的表達(dá)水平可能成為NSCLC患者的血清標(biāo)記物。

表1 三種miRNA在NSCLC患者與健康人群血清表達(dá)量（x±s）

圖1 三種miRNA在NSCLC患者與健康人群血清中的表達(dá)

3 討論

腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)與治療是降低其死亡率的關(guān)鍵。但多數(shù)腫瘤缺乏高度敏感和特異的標(biāo)記物[4]，因此尋找腫瘤早期發(fā)生的標(biāo)記物一直是腫瘤學(xué)研究的熱點(diǎn)。外周血腫瘤標(biāo)記物的檢測(cè)具有幾乎無(wú)創(chuàng)、可進(jìn)行重復(fù)多次測(cè)定的優(yōu)點(diǎn)，是腫瘤診斷的較理想手段。研究發(fā)現(xiàn)，外周血miRNA的表達(dá)具有腫瘤相關(guān)性與組織特異性的特點(diǎn)[5]。miRNA對(duì)外周血核糖核酸酶穩(wěn)定，因此較RNA更為穩(wěn)定，甚至在室溫下過(guò)夜、反復(fù)凍存—解凍、煮沸、過(guò)酸或過(guò)堿等條件下仍能穩(wěn)定表達(dá)[6]。故外周血miRNA可能是較理想的腫瘤標(biāo)記物。

let—7是研究最多的與肺癌密切相關(guān)的miRNA。超過(guò)60%的肺癌組織與80%的肺癌細(xì)胞株中l(wèi)et—7的表達(dá)水平顯著降低[7]，并且let—7低表達(dá)的肺癌患者預(yù)后不良。國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)，let—7在胚胎末期表達(dá)上調(diào)，在腫瘤早期表達(dá)降低[8]，且表達(dá)減少在NSCLC更為常見(jiàn)。Scott等發(fā)現(xiàn)let—7低表達(dá)是相對(duì)早期癌癥的標(biāo)識(shí)[1]。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，let—7在KRAS 3′端非翻譯區(qū)的基因突變與NSCLC的好發(fā)有關(guān)[9]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，let—7在NSCLC患者外周血的水平僅為正常健康人群的21.1%，提示外周血let—7可能是一種較好的與NSCLC有關(guān)的腫瘤標(biāo)記物。

miR—125b—1與肺癌的發(fā)生相關(guān)。此miRNA定位于11q23—24雜合型缺失的微小區(qū)域，后者在肺部、乳腺和卵巢腫瘤中存在突變或缺失。miRNA基因的突變或缺失可影響其表達(dá)水平。國(guó)內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，miR—125b—1在癌旁正常肺組織中無(wú)異常，在肺癌組織中存在基因突變，且miR—125b—1基因突變與癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期呈顯著正相關(guān)[10]。在本研究中，外周血miR—125b—1在肺癌患者中顯著降低，僅為健康人群的13.5%，提示miR—125b—1與肺癌的發(fā)生高度相關(guān)。

miR—21在多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)異常。在大多數(shù)腫瘤中，如惡性膠質(zhì)瘤、肺癌、乳腺癌、膽道癌、胰腺癌、直腸癌、膀胱癌及食管癌細(xì)胞或組織中，miR—21的表達(dá)均顯著升高。但在少數(shù)腫瘤，如卵巢癌、促腎上腺皮質(zhì)素分泌型垂體瘤等中表達(dá)明顯降低。研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)miR—21區(qū)分膽管癌與正常組織的靈敏度可達(dá)95%，提示miR—21可用于膽管癌的診斷[11]。通過(guò)計(jì)算miR—21與miR—205的表達(dá)量比值，可對(duì)侵襲性與非侵襲性的膀胱癌細(xì)胞進(jìn)行有效的判別，其臨床靈敏度和特異性可分別達(dá)到100%和78%。在本研究中，NSCLC患者外周血miR—21大幅升高，提示其與肺癌的發(fā)生密切相關(guān)。但由于miR—21在多種腫瘤中高表達(dá)，其在外周血的表達(dá)水平與其他腫瘤的相關(guān)性尚需進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2011—03—07）