張大貴等

[摘要] 目的 探討三種脫鈣液對骨組織免疫組化染色的影響。 方法 選擇12例骨組織，隨機分為3組。A組用14%硝酸脫鈣液進行處理，B、C組分別用EDTA脫鈣液、PLANK脫鈣液進行處理，同時對CD3、CD68、Ki—67 和TTF—1染色。 結果 室溫條件下，硝酸脫鈣液的脫鈣時間最短，但對組織損傷最大。PLANK脫鈣液和EDTA脫鈣液脫鈣效果較好，組織結構完整，形態(tài)清晰，免疫組化染色較好。 結論 室溫條件下，三種脫鈣液中PLANK脫鈣液和EDTA脫鈣液對骨組織脫鈣及免疫組化染色效果較好。但由于EDTA脫鈣液脫鈣時間過長，PLANK脫鈣液脫鈣均勻，速度快，更適合用于臨床病理檢查。硝酸脫鈣液脫鈣最快，但是免疫組化染色效果較差。

[關鍵詞] 脫鈣液；骨組織；免疫組化染色

[中圖分類號] R446.4+1[文獻標識碼] B[文章編號] 1673—9701（2012）24—0101—03

骨組織內含有大量無機鈣鹽，結締組織堅硬，難以直接制片[1]。如果強制切片，在藍色鈣鹽背景下，往往無法看清細胞結構，所以需要選擇一種能保持骨組織形態(tài)結構和染色后有利于保持細胞結構清晰度和對比度的脫鈣液。本文研究14%（體積分數）硝酸脫鈣液、EDTA脫鈣液、PLANK脫鈣液對骨組織免疫組化染色的影響，以期尋找一種效果比較理想的脫鈣液，對病理診斷工作提供幫助。

1 材料與方法

1.1 標本選擇

12例骨組織標本均來源于我院，切成1 cm×1 cm×0.3 cm的骨塊，在福爾馬林中性液內固定24 h，用于脫鈣及免疫組化染色實驗。

1.2 三種脫鈣液

①脫鈣液Ⅰ：14%（體積分數）硝酸脫鈣液，配制方法為14 mL濃硝酸加入86 mL蒸餾水；②脫鈣液Ⅱ：EDTA脫鈣液，配制方法為EDTA10 g，蒸餾水100 mL，加NaOH充分攪拌溶解，在用10 mol/L的HCl調pH為8.0，最后加入4%甲醛15 mL。③脫鈣液Ⅲ：PLANK脫鈣液，配制方法為氯化鋁10 g，甲酸50 mL，10%福爾馬林10 mL，冰乙酸1.5 mL，加蒸餾水至總體積100 mL。

1.3試劑和儀器

硝酸、鹽酸、EDTA等化學試劑均購自廣州化學試劑一廠，CD3、CD68、Ki—67和TTF—1等抗體購自福建邁新公司，EnVision二步法試劑盒購自DAKO公司。切片機、染色機和切片刀購自英國shandan公司。

1.4 方法

1.4.1 脫鈣處理三組骨組織分別按以下方法進行脫鈣處理：將12例骨組織標本平均分為A、B、C三組，并確定所選每份骨組織性質一樣，分別將A、B、C組標本放入相對應的脫鈣液中，間隔一定時間后更換脫鈣液，以標本肉眼觀察至半透明狀，手感有彈性，大頭針可順利刺進骨組織，無砂粒感為脫鈣完成，結合X射線確定脫鈣終點。接著進行石蠟切片、免疫組化染色。

1.4.2 免疫組化染色步驟骨組織固定、脫鈣后，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋及制成4 μm厚的連續(xù)切片，裱片后進行70℃烤片1 h，脫蠟至乙醇溶液，3%（體積分數）甲醇—H2O2封閉內源性過氧化酶10 min，高壓鍋枸櫞酸緩沖液法修復2 min，加入Ⅰ抗，37℃孵育1 h，加入EnVisionⅡ抗，再于37℃孵育30 min，DAB顯色1 min，蘇木精復染（圖像分析所用的切片未染色），脫水，透片，封片，光鏡觀察。

1.4.3 免疫組化染色結果判定CD3陽性信號位于細胞膜、CD68陽性信號位于細胞漿、Ki—67和TTF—1陽性信號位于細胞核。于光鏡下觀察三種脫鈣液脫鈣骨組織免疫組化標記的結果，未復染的切片做圖像定量分析，其方法為：將每種抗體免疫組化染色后的切片放在顯微鏡下，在同一組的每張切片相同的部位觀察10個視野（4種抗體×10=40個視野），被測物質的各種信息通過攝像機將所測目標轉換成數字圖像，傳遞到計算機系統(tǒng)，標定組織片空白處入射光的光密度值（OD值），在監(jiān)視器上用不同的分割方法和編輯功能，計算免疫組化染色陽性細胞平均OD值，其值代表了切片中相應抗原性的相對強度。

1.5 統(tǒng)計學分析

圖像分析結果以均數±標準差（x±s）表示，采用SPSS 13.0作方差分析。

2 結果

2.1 不同脫鈣液對骨組織脫鈣時間及效果比較

2.1.1脫鈣時間14%硝酸脫鈣液脫鈣時間最短。14%硝酸脫鈣液

2.1.2脫鈣效果14%硝酸脫鈣液脫鈣效果最好。14%硝酸脫鈣液﹥PLANK脫鈣液﹥EDTA脫鈣液（表1）。

2.1.3對組織損傷 EDTA脫鈣液對組織損傷最小。EDTA脫鈣液

2.2 不同脫鈣液脫鈣對骨組織免疫組化染色結果比較

見表2 。三種脫鈣液免疫組化染色圖像結果用方差分析進行兩兩比較，其結果為硝酸脫鈣液和PLANK、EDTA脫鈣液比較有顯著性差異，EDTA脫鈣液和PLANK脫鈣液比較無顯著差異。硝酸脫鈣液對組織損傷較大，切片顏色欠鮮艷，細胞核著色弱，組織結構欠清晰。PLANK和EDTA脫鈣液脫鈣效果較好，顯微鏡下觀察組織結構完整、清晰，色澤鮮艷，對比度較好。

2.3 脫鈣后免疫組化染色效果

見表2。見圖1～3。

3 討論

脫鈣是指用化學或物理方法將骨組織中的鈣鹽和膠原纖維分離，除去鈣鹽，獲得完整的膠質纖維成分[2]。骨組織含有大量的鈣鹽和無機鹽，需經過脫鈣處理，使組織軟化后才能進行切片處理。常用的脫鈣劑主要包括單純酸類、混合酸類、螯合劑等。免疫組織化學對臨床病理檢查非常重要，因而應選擇較好的脫鈣液對所選骨組織標本進行較好的脫鈣處理，且不破壞細胞和組織結構，形態(tài)清楚，進而確保免疫組化染色的效果較好并合適臨床需要。

14%硝酸脫鈣液是常用于臨床脫鈣液之一，具有脫鈣能力最強、脫鈣時間最短等優(yōu)點。但是，對骨組織脫鈣程度較難把握，容易造成過度脫鈣現象；同時脫鈣后易出現組織腫脹及細胞結構不完整清晰的不良現象。硝酸在脫鈣過程產生CO2，氣泡從組織中溢出將導致結締組織分離。另一方面，硝酸對組織進行脫鈣時還酸化組織，造成細胞核著色能力下降而返藍困難進而變成淡紅色，對比度差，由于亞硝酸形成使組織變黃而影響其后的染色[3]，在室溫條件下更明顯。硝酸在溶解骨組織鈣鹽時也對抗原物質具有破壞性，因而抗原免疫活性降低，免疫組化染色效果不佳[4]。結合本實驗驗證硝酸脫鈣液脫鈣后較易影響其后的免疫組化染色效果。

EDTA是科研中常用的脫鈣劑，能夠與羥基磷灰石結晶的外層鈣結合，同時促進內層結合鈣向外轉移，進而溶解鈣鹽，是脫鈣和免疫組化染色理想的脫鈣劑[5]。本實驗觀察到EDTA脫鈣液對骨組織脫鈣效果較好，能保持完整的組織結構，且不破壞抗原物質，免疫組化染色陽性細胞數量多、著色深、背景淡。然而，在室溫條件下，其脫鈣時間過長，脫鈣后組織稍微變硬，不太適合臨床電鏡快速診斷的要求，且其價格較貴，綜合而言不利于臨床檢查工作。目前認為，應用微波技術可促進EDTA的螯合作用，縮短脫鈣時間[6]。使用微波技術時應注意固定實驗條件、調整微波功率和時間、溫度也不能超過60℃等。

本研究表明，與硝酸、EDTA脫鈣液比較，PLANK脫鈣液具有常溫脫鈣時間較短、脫鈣效果較好，免疫組化染色著色鮮艷、對比度佳、陽性細胞數多等優(yōu)點。PLANK脫鈣液[7]是一種氯化鋁、甲酸、甲醛和冰乙酸組成的混合脫鈣液，其中甲酸和溶液中的鋁離子對組織影響較小，免疫組化染色效果優(yōu)良。甲醛可加強對組織的固定并具有抗酸浸蝕的作用。冰乙酸能較好保持染色體結構，并能減少酸對細胞核的破壞。其配制成分中，通過增加甲酸的濃度并用冰乙酸輔助，可以加快脫鈣速度。常溫下PLANK脫鈣液快速軟化組織，對組織抗原損傷較少，細胞結構清晰完整，加之其脫鈣時間較短、配制簡單、經濟等有利條件，較適合用于臨床檢查工作[8]。

CD3、CD68、Ki—67和TTF—1等細胞因子多在腫瘤組織中表達，快速準確的病理診斷有利于患者的臨床診治。因而，選擇合適的脫鈣液成為重要工作環(huán)節(jié)之一。本實驗通過比較14%硝酸脫鈣液、EDTA脫鈣液和PLANK脫鈣液的脫鈣和免疫組化染色效果，綜合評價認為PLANK脫鈣液較適合用于臨床快速病理診斷。

[參考文獻]

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[3]謝玲，鄒麗宜，張志平，等.改良脫鈣液制作脫鈣骨石蠟切片與傳統(tǒng)方法的比較[J].中國組織工程研究與臨床康復，2008，12（11）：2125—2128.

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[8]連麗琴，夏凌志，鐘惠霞.三種脫鈣液對骨組織脫鈣后切片染色效果分析[J].武警醫(yī)學，2008，19（10）：937—938.

（收稿日期：2012—08—18）