李蕊聯(lián)等

[摘要]目的：比較點(diǎn)陣CO2激光和Nd：YAG激光（準(zhǔn)長(zhǎng)脈寬1 064nm波長(zhǎng)）對(duì)老化昆明小鼠真皮重塑的作用，并探討二者嫩膚作用機(jī)制，為臨床選擇治療方法提供理論依據(jù)。方法：應(yīng)用兩種波長(zhǎng)激光照射自然老化昆明小鼠背部脫毛皮膚，通過(guò)HE染色進(jìn)行成纖維細(xì)胞計(jì)數(shù)及真皮厚度測(cè)量，飽和苦味酸-天狼猩紅染色觀察皮膚Ⅰ型、Ⅲ型膠原纖維的表達(dá)及Gomori醛品紅染色觀察彈力纖維的變化。結(jié)果：兩組照射組中真皮厚度、成纖維細(xì)胞計(jì)數(shù)和彈力纖維容積分?jǐn)?shù)的值均高于正常對(duì)照組（P均<0.05）；點(diǎn)陣CO2激光組均高于Nd：YAG激光（準(zhǔn)長(zhǎng)脈寬1064nm波長(zhǎng)）組（P均<0.05）；兩組照射組中Ⅰ型及Ⅲ型膠原蛋白容積分?jǐn)?shù)均高于正常對(duì)照組（P均<0.05），但照射兩組間差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：點(diǎn)陣CO2激光和Nd：YAG激光（準(zhǔn)長(zhǎng)脈寬1064nm波長(zhǎng)）均可引發(fā)小鼠真皮重塑，前者效果優(yōu)于后者。

[關(guān)鍵詞]點(diǎn)陣CO2激光；Nd：YAG激光（準(zhǔn)長(zhǎng)脈寬1064nm波長(zhǎng)）；自然老化小鼠；真皮重塑

[中圖分類(lèi)號(hào)]R616.4R332[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[文章編號(hào)]1008-6455（2012）10-0-0

激光醫(yī)學(xué)的迅速發(fā)展，已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于皮膚科的臨床實(shí)踐中。近幾年，非剝脫性激光以及點(diǎn)陣激光的發(fā)展更為迅速，已經(jīng)占有了一席之地[1-2]。雖然有關(guān)兩者作用機(jī)制的研究也有報(bào)道[3-4]，但是二者針對(duì)皮膚組織結(jié)構(gòu)作用機(jī)制的比較研究卻鮮見(jiàn)報(bào)道。通過(guò)對(duì)二者作用的靶組織或細(xì)胞變化的深入比較研究，可以進(jìn)一步揭開(kāi)二者作用差異的面紗，為臨床制定具體治療方法提供理論依據(jù)。因此，本實(shí)驗(yàn)旨在分析點(diǎn)陣CO2激光及Nd：YAG激光（準(zhǔn)長(zhǎng)脈寬1 064nm波長(zhǎng)）對(duì)昆明小鼠真皮的影響并進(jìn)行對(duì)比研究，以進(jìn)一步明確其作用機(jī)制的差異。

1材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：清潔級(jí)雌性自然老化昆明小白鼠24只，體重（45±7）g，鼠齡11～12個(gè)月，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2儀器設(shè)備：點(diǎn)陣CO2激光治療儀（上?？祳W），Nd：YAG激光（準(zhǔn)長(zhǎng)脈寬1 064nm波長(zhǎng)）（韓國(guó)Lutronic S6）；石蠟切片機(jī)（德國(guó)Leica）；偏振光顯微鏡（奧林巴斯）；光學(xué)顯微鏡及醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)（麥克奧迪）。

1.2實(shí)驗(yàn)方法：10%水合氯醛（4ml/kg）腹腔麻醉。小鼠背部皮膚脫毛后，以脊柱為縱線(xiàn)和垂直于脊柱縱線(xiàn)的二分之一處為橫線(xiàn)將背部皮膚分為四個(gè)區(qū)。左側(cè)為對(duì)照區(qū)，不做任何處理；右側(cè)頭部區(qū)為點(diǎn)陣CO2激光照射區(qū)（簡(jiǎn)稱(chēng)點(diǎn)陣區(qū)），尾部區(qū)為Nd：YAG激光（準(zhǔn)長(zhǎng)脈寬1 064nm波長(zhǎng)）照射區(qū)（簡(jiǎn)稱(chēng)長(zhǎng)脈寬區(qū)）。照射區(qū)皮膚用1‰新潔爾滅常規(guī)消毒后自然干燥。點(diǎn)陣CO2激光照射的能量為50mJ/cm2，正方形光斑（4mm×4mm），脈寬2ms，密度100/cm2，光斑之間不重疊照射一遍；Nd：YAG激光（準(zhǔn)長(zhǎng)脈寬1064nm波長(zhǎng)）照射的能量為14.1mJ/cm2，圓形光斑（3.0mm），脈寬0.3ms，光斑重疊1/3，照射兩遍；兩組照射面積均約2cm×2cm。24只小鼠激光照射4次，每次間隔10天，全部照射結(jié)束后，分別在第2周、1個(gè)月、3個(gè)月各處死8只小鼠，分別取每只小鼠四個(gè)部位的皮膚用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

1.3 組織學(xué)觀察：每只小鼠的四塊樣本，以10%甲醛溶液固定，乙醇梯次濃度逐級(jí)脫水，石蠟包埋，切片。常規(guī)HE切片用于計(jì)算成纖維細(xì)胞計(jì)數(shù)及測(cè)量真皮厚度；飽和苦味酸-天狼猩紅染色切片用偏振光顯微鏡照相以分析Ⅰ型、Ⅲ型膠原纖維含量；Gomori醛品紅染色切片用于分析彈力纖維含量。以上所有切片標(biāo)本均以每張切片隨機(jī)選取三個(gè)視野，用Motic醫(yī)學(xué)圖像分析軟件分析，最后取均值作為該切片的分值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：所有數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。相關(guān)表格均由Microsoft Excel 2007繪制。計(jì)量資料采用x±s進(jìn)行描述，資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)及方差齊性檢驗(yàn)后， Wilcoxon秩檢驗(yàn)或t檢驗(yàn)用于兩組間的比較，方差分析比較各時(shí)間段之間的差別，兩兩比較采用LSD法，規(guī)定檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P<0.05為差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

肉眼觀察可見(jiàn)點(diǎn)陣CO2激光照射自然老化昆明小白鼠后，照射區(qū)域皮膚表面即刻呈現(xiàn)均勻的黃褐色點(diǎn)狀結(jié)痂，輕度水腫，次日水腫消失，點(diǎn)狀結(jié)痂3～7日脫落。脫痂后皮膚表面光滑，無(wú)瘢痕及色素異常；Nd：YAG激光（準(zhǔn)長(zhǎng)脈寬1064nm波長(zhǎng)）照射區(qū)域皮膚表面微紅，無(wú)結(jié)痂，次日皮膚基本恢復(fù)正常。

2.1 點(diǎn)陣CO2激光及Nd：YAG激光（準(zhǔn)長(zhǎng)脈寬1 064nm波長(zhǎng)）照射對(duì)成纖維細(xì)胞數(shù)量及真皮厚度的影響：點(diǎn)陣CO2激光和Nd：YAG激光（準(zhǔn)長(zhǎng)脈寬1064nm波長(zhǎng)）照射自然老化昆明小白鼠后2周、1個(gè)月及3個(gè)月，HE染色標(biāo)本顯示兩種激光照射區(qū)相對(duì)于對(duì)照區(qū)成纖維細(xì)胞計(jì)數(shù)及真皮厚度均顯著增加，點(diǎn)陣CO2激光照射較Nd：YAG激光（準(zhǔn)長(zhǎng)脈寬1064nm波長(zhǎng)）照射效果明顯（見(jiàn)表1、表2、圖2）。在照射后一個(gè)月，點(diǎn)陣CO2激光較Nd：YAG激光（準(zhǔn)長(zhǎng)脈寬1 064nm波長(zhǎng)）成纖維細(xì)胞計(jì)數(shù)及真皮厚度差別顯著（見(jiàn)圖1）。

2.2 點(diǎn)陣CO2激光及Nd：YAG激光（準(zhǔn)長(zhǎng)脈寬1 064nm波長(zhǎng)）照射對(duì)膠原增生的影響：點(diǎn)陣CO2激光及Nd：YAG激光（準(zhǔn)長(zhǎng)脈寬1064nm波長(zhǎng)）照射自然老化昆明小白鼠后，經(jīng)偏振光鏡檢飽和苦味酸-天狼猩紅切片可見(jiàn)Ⅰ型膠原纖維呈紅黃色，較粗大，而Ⅲ型膠原纖維呈綠色細(xì)絲狀，交織于Ⅰ型膠原纖維間。在兩波長(zhǎng)激光分別照射后2周、1個(gè)月及3個(gè)月，照射區(qū)與對(duì)照區(qū)相比，Ⅰ型及Ⅲ型膠原纖維容積分?jǐn)?shù)增加明顯（見(jiàn)表3、表4、圖4）。點(diǎn)陣CO2激光與Nd：YAG激光（準(zhǔn)長(zhǎng)脈寬1 064nm波長(zhǎng)）照射后一個(gè)月的Ⅰ型及Ⅲ型膠原纖維容積分?jǐn)?shù)差別不明顯（見(jiàn)圖3）。

2.3點(diǎn)陣CO2激光及Nd：YAG激光（準(zhǔn)長(zhǎng)脈寬1 064nm波長(zhǎng)）照射對(duì)彈力纖維增生的影響：點(diǎn)陣CO2激光及Nd：YAG激光（準(zhǔn)長(zhǎng)脈寬1064nm波長(zhǎng)）照射自然老化昆明小白鼠后2周、1個(gè)月及3個(gè)月，Gomori醛品紅染色標(biāo)本顯示照射區(qū)彈力纖維染色深，呈較長(zhǎng)細(xì)絲狀，波浪狀交織于增生膠原纖維間（見(jiàn)圖5箭頭所示），而對(duì)照區(qū)真皮彈力纖維短、染色淺；在激光照射后一個(gè)月，點(diǎn)陣CO2激光較Nd：YAG激光（準(zhǔn)長(zhǎng)脈寬1064nm波長(zhǎng)）照射區(qū)的彈力纖維容積分?jǐn)?shù)增加明顯（見(jiàn)表5、圖6）。

2.4 點(diǎn)陣CO2激光及Nd：YAG激光（準(zhǔn)長(zhǎng)脈寬1 064nm波長(zhǎng)）照射區(qū)在不同時(shí)間段的方差：分析比較：（見(jiàn)表6）。

3討論

2004年Manstein等[2]發(fā)表點(diǎn)陣式光熱作用（fractional photothermolysis， FP）理論，并迅速應(yīng)用于臨床，減少了治療風(fēng)險(xiǎn)，并顯現(xiàn)出良好的療效。點(diǎn)陣CO2激光照射的是小部分皮膚，為三維的熱治療區(qū)域（Microscopic treatment zones，MTZs），每個(gè)MTZ形成熱損傷區(qū)域（10～100μm），其外周為未損傷的正常組織。點(diǎn)狀的損傷可以通過(guò)周?chē)嬖诘奈词軗p細(xì)胞遷移使表皮細(xì)胞迅速修復(fù)，從而使治療后皮膚能快速恢復(fù)，無(wú)需休假，避免了傳統(tǒng)剝脫性治療的風(fēng)險(xiǎn)[5]。Nd：YAG激光（準(zhǔn)長(zhǎng)脈寬1 064nm波長(zhǎng)）幾乎不損傷表皮細(xì)胞即可達(dá)到嫩膚的作用[6]。

皮膚老化常表現(xiàn)為皺紋、皮膚彈性下降、色素?fù)p害、毛細(xì)血管擴(kuò)張等。顯微鏡下組織學(xué)改變表現(xiàn)為膠原纖維、彈力纖維減少，真皮層變薄。真皮層的主要結(jié)構(gòu)為大量的成束的縱橫交錯(cuò)的膠原纖維和少量的彈性纖維組織。因此，所謂的真皮重塑主要表現(xiàn)或者指標(biāo)也就是Ⅰ型及Ⅲ型膠原纖維合成的重新啟動(dòng)。諸多的研究已證實(shí)激光照射后Ⅰ型及Ⅲ型膠原纖維合成大于降解[7，8]。點(diǎn)陣激光照射后Ⅲ型膠原纖維3天開(kāi)始合成[9]，7天可見(jiàn)Ⅲ型膠原纖維沉積[10]。點(diǎn)陣CO2激光治療面部萎縮性痤瘡瘢痕[11]及手背部皮膚[12]，發(fā)現(xiàn)1個(gè)月時(shí)痤瘡疤痕及皮膚光老化改善明顯，有新的膠原沉積。國(guó)內(nèi)羅瑤佳等[13]用超脈沖二氧化碳點(diǎn)陣激光治療皮膚痤瘡瘢痕，于1個(gè)月及3個(gè)月時(shí)觀察療效滿(mǎn)意。Chiba等[4]在用Nd：YAG激光進(jìn)行面部嫩膚治療后發(fā)現(xiàn)改善皺紋，皮膚質(zhì)地及松弛效果明顯，真皮乳頭層膠原纖維沉積明顯。以上報(bào)道基本與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符[14]。本實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象為自然老化小鼠，與人類(lèi)的自然老化有相同之處，通過(guò)對(duì)其研究可以為人類(lèi)臨床美膚提供科學(xué)理論依據(jù)[15]。本研究發(fā)現(xiàn)2周時(shí)在照射區(qū)域出現(xiàn)Ⅰ型膠原纖維沉積，1月時(shí)達(dá)到最高值，3月時(shí)沉積較前減少，但仍高于對(duì)照區(qū)，這些結(jié)果有助于我們了解激光照射后刺激膠原纖維合成的時(shí)間；而Ⅲ型膠原纖維至3月時(shí)仍呈現(xiàn)明顯沉積趨勢(shì)，其合成大于降解[9]，可能與Ⅲ型膠原纖維在老化皮膚沉積較多有關(guān)[16]；同時(shí)，彈力纖維亦呈現(xiàn)出時(shí)間依賴(lài)性沉積關(guān)系[17]；均表明其臨床治療間隔可以在三個(gè)月以后進(jìn)行。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，點(diǎn)陣CO2激光及Nd：YAG激光（準(zhǔn)長(zhǎng)脈寬1 064nm波長(zhǎng)）照射均可明顯引發(fā)真皮重塑，前者較后者具有更好的照射效果，造成這種差異的可能原因在于點(diǎn)陣CO2激光的波長(zhǎng)（10600nm）高于Nd：YAG激光波長(zhǎng)（1 064nm）。相比而言，較長(zhǎng)的點(diǎn)陣CO2激光波長(zhǎng)穿透能力強(qiáng)，可達(dá)真皮的中層，能夠更好的將機(jī)械效應(yīng)及光熱效應(yīng)作用于真皮中上層的成纖維細(xì)胞及真皮血管，激活組織自我修復(fù)，其中成纖維細(xì)胞和真皮血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子可能參與組織修復(fù)，刺激成纖維細(xì)胞增殖，使膠原蛋白發(fā)生重組和增生；Nd：YAG激光（準(zhǔn)長(zhǎng)脈寬1064nm波長(zhǎng)）其作用機(jī)理可能是真皮及其血管受激光光熱效應(yīng)及機(jī)械效應(yīng)損傷，膠原蛋白熱變性，繼而激活組織修復(fù)過(guò)程，引發(fā)成纖維細(xì)胞增殖，引起膠原蛋白重組增生以達(dá)到真皮重塑的目的[6]。點(diǎn)陣CO2激光照射后的成纖維細(xì)胞數(shù)目及真皮厚度在1個(gè)月時(shí)較Nd：YAG激光（準(zhǔn)長(zhǎng)脈寬1064nm波長(zhǎng)）照射效果明顯，但其長(zhǎng)期效果并不具有明顯優(yōu)勢(shì)，說(shuō)明二者均能有效改善皮膚質(zhì)地、增加皮膚彈性，是進(jìn)行真皮重塑的很好的選擇。比較多位學(xué)者的治療結(jié)果，發(fā)現(xiàn)點(diǎn)陣CO2激光效果雖好，但點(diǎn)陣CO2激光治療時(shí)患者的疼痛感高于Nd：YAG激光（準(zhǔn)長(zhǎng)脈寬1064nm波長(zhǎng)），且恢復(fù)期也較長(zhǎng)[4，11]。相對(duì)臨床而言，二者皆可作為治療皮膚光老化進(jìn)行真皮重塑的良好選擇[3，18]，Nd：YAG激光（準(zhǔn)長(zhǎng)脈寬1 064nm波長(zhǎng)）損傷小，停工期短，更適合現(xiàn)在的快節(jié)奏生活，但對(duì)于較重的老化皮膚或?qū)Ο熜в袕?qiáng)烈愿望，建議用點(diǎn)陣CO2激光。本實(shí)驗(yàn)未明確真皮發(fā)生變化的分子機(jī)理，有待于在今后的學(xué)習(xí)中進(jìn)一步研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Laubach H， Chan H H， Rius F， et al. Effects of skin temperature on lesion size in fractional photothermolysis[J]. Lasers Surg Med， 2007，39（1）：14-18.

[2]Manstein D， Herron G S， Sink R K， et al. Fractional photothermolysis： a new concept for cutaneous remodeling using microscopic patterns of thermal injury[J]. Lasers Surg Med， 2004，34（5）：426-438.

[3]Helbig D， Paasch U. Molecular changes during skin aging and wound healing after fractional ablative photothermolysis[J]. Skin Res Technol， 2011，17（1）：119-128.

[4]Chiba C， Usui A， Hara H， et al. Clinical experience in skin rejuvenation treatment in Asians using a long-pulse Nd：YAG laser[J]. J Cosmet Laser Ther， 2009，11（3）：134-138.

[5]Geronemus R G. Fractional photothermolysis： current and future applications[J]. Lasers Surg Med， 2006，38（3）：169-176.

[6]Orringer J S， Voorhees J J， Hamilton T， et al. Dermal matrix remodeling after nonablative laser therapy[J]. J Am Acad Dermatol， 2005，53（5）：775-782.

[7]Orringer J S， Rittie L， Baker D， et al. Molecular mechanisms of nonablative fractionated laser resurfacing[J]. Br J Dermatol， 2010，163（4）：757-768.

[8]Dang Y，Ye X，Weng Y，et al.Effects of the 532-nm and 1，064-nm Q-switched Nd：YAG lasers on collagen turnover of cultured human skin fibroblasts： a comparative study[J]. Lasers Med Sci， 2010，25（5）：719-726.

[9]Helbig D，Bodendorf MO， Grunewald S，et al.Immunohistochemical investigation of wound healing in response to fractional photothermolysis[J]. J Biomed Opt， 2009，14（6）：64044.

[10]Laubach HJ，Tannous Z，Anderson RR，et al.Skin responses to fractional photothermolysis[J]. Lasers Surg Med，2006，38（2）：142-149.

[11]Manuskiatti W，Triwongwaranat D，Varothai S，et al. Efficacy and safety of a carbon-dioxide ablative fractional resurfacing device for treatment of atrophic acne scars in Asians[J]. J Am Acad Dermatol，2010，63（2）：274-283.

[12]Sadick N S， Smoller B. A study examining the safety and efficacy of a fractional laser in the treatment of photodamage on the hands[J]. J Cosmet Laser Ther， 2009，11（1）：29-33.

[13]羅瑤佳，吳嚴(yán)，高興華，等. 超脈沖二氧化碳點(diǎn)陣激光治療痤瘡瘢痕的臨床觀察[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué)， 2011（1）：93-95.

[14]Rerknimitr P，Pongprutthipan M，Sindhuphak W.Fractional photothermolysis for the treatment of facial wrinkle in Asians[J]. J Med Assoc Thai， 2010，93 Suppl 7：S35-S40.

[15]叢敬，吳景東.老化皮膚成纖維細(xì)胞的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)美容醫(yī)學(xué)， 2009（5）：736-738.

[16]Lovell C R， Smolenski K A， Duance V C， et al. Type I and III collagen content and fibre distribution in normal human skin during ageing[J]. Br J Dermatol， 1987，117（4）：419-428.

[17]Lee J Y， Kim Y K， Seo J Y， et al. Loss of elastic fibers causes skin wrinkles in sun-damaged human skin[J]. J Dermatol Sci， 2008，50（2）：99-107.

[18]Wattanakrai P，Rojhirunsakool S，Pootongkam S.Split-face comparison of long-pulse-duration neodymium-doped yttrium aluminum garnet （Nd：YAG） 1，064-nm laser alone and combination long-pulse and Q-switched Nd：YAG 1，064-nm laser with carbon photoenhancer lotion for the treatment of enlarged pores in Asian women[J].Dermatol Surg， 2010，36（11）：1672-1680.

[收稿日期]2012-06-15[修回日期]2012-08-21

編輯/張惠娟