范海燕，李勝棉，張瑞星，楊 華，郭占軍*，高詠梅

（1.河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院消化內科，河北石家莊 050011；2.河北北方學院附屬第一醫(yī)院消化內科，河北張家口 075000）

線粒體D-loop區(qū)單核苷酸多態(tài)性與食管鱗狀細胞癌患者發(fā)病年齡關系的研究

范海燕1，李勝棉1，張瑞星1，楊 華1，郭占軍1*，高詠梅2

（1.河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院消化內科，河北石家莊 050011；2.河北北方學院附屬第一醫(yī)院消化內科，河北張家口 075000）

目的探討線粒體D-1oop區(qū)單核苷酸多態(tài)性與食管鱗狀細胞癌患者發(fā)病年齡關系。方法2003—2005年在河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院完成食管鱗狀細胞癌患者線粒體D-1oop區(qū)測序55例，單核苷酸多態(tài)性與患者發(fā)病年齡的關系分析采用Kap1an-Meier法，組間比較使用Log-rank檢驗。結果經(jīng)Log-rank檢驗，單核苷酸多態(tài)位點16266C/T基因型與發(fā)病年齡有關，多態(tài)位點16266T基因型患者發(fā)病早于16266C基因型患者，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結論線粒體DNA D-1oop區(qū)基因多態(tài)性位點可作為食管鱗狀細胞癌患者發(fā)病年齡的預測標記，同時線粒體D-1oop區(qū)多態(tài)性位點有助于識別早發(fā)的食管鱗狀細胞癌患者。

食管腫瘤；多態(tài)性，單核苷酸；線粒體

食管癌是人類常見的惡性腫瘤之一，年發(fā)病率＞125/100 000［1］。食管癌的確切病因和發(fā)病機制至今尚未明確，到目前為止關于基因和腫瘤發(fā)病年齡關系的研究甚少［2-3］。人類線粒體基因組為環(huán)狀DNA分子，線粒體DNA處在活性氧自由基和其他自由基包圍之中，缺乏組蛋白保護，且其內缺乏完整的修復系統(tǒng)，與核內基因相比，線粒體DNA很容易發(fā)生突變［4］；近來研究發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中可見線粒體DNA存在廣泛變異，因此包括食管癌在內的多種腫瘤中線粒體（disp1acement 1oop，D-1oop）區(qū)已成為基因突變和多態(tài)性研究的熱點區(qū)域［5］。我們參照線粒體數(shù)據(jù)庫（www.mitomap.org）已經(jīng)完成食管鱗狀細胞癌患者線粒體D-1oop區(qū)域的測序，其中共發(fā)現(xiàn)了88個單核苷酸多態(tài)位點，并且已經(jīng)探討了單核苷酸多態(tài)位點與食管鱗狀細胞癌疾病預后的關系［6-7］；本研究旨在探討線粒體D-1oop區(qū)單核苷酸多態(tài)性與食管鱗狀細胞癌患者發(fā)病年齡的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料：2003—2005年河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院胸外科住院食管鱗狀細胞癌患者55例，均來自中國河北食管癌高發(fā)病地區(qū)，男性34例，女性21例，年齡39～76歲，平均（59.3±8.56）歲，其中≤40歲患者1例（男性1例），＞40～50歲患者6例（男性5例，女性1例），＞51～60歲患者29例（男性17例，女性12例），＞60歲患者19例（男性11例，女性8例），患者術前未進行任何臨床治療。術前均空腹抽取外周靜脈血，外周血標本當天提取線粒體后置于-80℃恒溫冰箱保存，病理類型由2名資深病理專家確認。

1.2 研究方法：使用全血線粒體DNA萃取試劑盒迅速提取線粒體DNA，PCR擴增線粒體DNA的D-1oop 區(qū)， 上 游 引 物 為 5’ -CCCCATGCTTACAAGCAAGT-3’，下游引物為5’-GCTTTGAGGAGGTAAGCTAC-3’，擴增的目的片段長度為982bp，PCR的具體參數(shù)參照PCR預混試劑盒說明，將PCR產(chǎn)物純化測序，測序使用美國ABI PRISM 3100 DNA序列分析儀，同一標本采用雙向重復測序，隨后檢測血標本線粒體D-1oop區(qū)單核苷酸多態(tài)性。

1.3 統(tǒng)計學方法：應用SPSS11.5軟件分析數(shù)據(jù)，每個單核苷酸多態(tài)位點與發(fā)病年齡之間的關系分析使用Kap1an-Meier法，組間比較采用Log-rank檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

本研究將單核苷酸多態(tài)性最小等位基因頻率＜5%的位點剔除，共得到16個單核苷酸多態(tài)位點進一步分析?；诿總€單核苷酸位點基因型的不同將食管鱗狀細胞癌患者分為16266T基因型和16266C基因型2組。采用 Kap1an-Meier法，通過 1ogrank檢驗發(fā)現(xiàn)多態(tài)位點16266與食管鱗狀細胞癌患者的發(fā)病年齡之間有關（圖1），多態(tài)位點16266T基因型患者發(fā)病早于16266C基因型患者，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖1 16266位點與食管鱗狀細胞癌患者發(fā)病年齡之間的關系Figure 1 Comparison of age onset of ESCC patients by 16266 genotype in the D-1oop

3 討 論

以往研究發(fā)現(xiàn)在本實驗中的線粒體D-1oop區(qū)單核苷酸多態(tài)位點在多種腫瘤中與致癌風險和疾病預后有關［8］，而本研究進一步發(fā)現(xiàn)線粒體D-1oop區(qū)一段連續(xù)的序列（16190～16583位點）中的單核苷酸多態(tài)性與食管鱗狀細胞癌患者發(fā)病年齡有關（P＜0.05）。

我們已經(jīng)在消化道腫瘤對線粒體D-1oop區(qū)單核苷酸多態(tài)性進行了詳細研究［8］，本研究首次發(fā)現(xiàn)線粒體D-1oop區(qū)單核苷酸多態(tài)性不只作為致癌風險因素和疾病預后的預測指標，而且對食管鱗狀細胞癌患者來說也是發(fā)病年齡早晚的一個預測指標，單核苷酸多態(tài)位點16266在線粒體基因組中位于MT-5基因和MT3L基因之間，盡管以往我們通過病例對照研究發(fā)現(xiàn)其與肝癌患者致癌風險有關［8］，但到目前為止其具體的功能尚不明了，最小等位基因16266T基因型與食管鱗狀細胞癌患者早發(fā)病有關，本研究結果顯示，16266T基因型患者發(fā)病年齡曲線迅速下降，患者發(fā)病年齡較早。但仍需大量樣本繼續(xù)研究該多態(tài)位點與食管鱗狀細胞癌患者發(fā)病年齡的關系。

線粒體D-1oop區(qū)在線粒體基因復制和表達過程中起著重要作用，這個區(qū)域內的基因突變有可能影響線粒體DNA復制并導致氧化呼吸鏈的改變，活性氧自由基大量釋放進而損傷細胞核基因組，并最終促使腫瘤的發(fā)生和發(fā)展［9-10］。本研究發(fā)現(xiàn)的單核苷酸多態(tài)位點16266有可能使線粒體基因組轉錄發(fā)生改變，基因組轉錄的改變導致了大量活性氧自由基的產(chǎn)生，這些氧自由基調節(jié)機制異?？赡艽龠M了腫瘤的發(fā)生。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)線粒體D-1oop區(qū)單核苷酸多態(tài)性可作為食管鱗狀細胞癌患者發(fā)病早晚的預測指標，線粒體D-1oop區(qū)單核苷酸多態(tài)性研究有助于早期對食管鱗狀細胞癌患者發(fā)病年齡早晚進行分組，進而確定患者的治療方案。

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（本文編輯：劉斯靜）

SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISMS IN THE MITOCHONDRIAL DISPLACEMENT LOOP AND AGE-AT-ONSET OF ESOPHAGEAL SQUAMOUS CELL CARCINOMA

FAN Haiyan1，LI Shengmian1，ZHANG Ruixing1，YANG Hua1，GUO Zhanjun1*，GAO Yongmei2
（1.Department of Gastroenterologt and Hepatologt，the Fourth Hospital of Hebei Medical Universitt，Shijiazhuang 050011，China；2.Department of Gastroenterologt and Hepatologt，the First Attached Hospital of Hebei Northern Institute，Hebei Province，Zhangjiakou 75000，China）

ObjectiveTo investigate the association of age-at-onset of esophagea1 squamous ce11 carcinnoma（ESCC）patients and sing1e nuc1eotide po1ymorpyisms（SNPs）in mitochondria1 D-1oop.MethodsThe D-1oop region of mtDNA was sequenced in 55 ESCC patients recorded in the Fourth Hospita1 of Hebei Medica1 University between 2003 to 2005.The age-at-onset curve was ca1cu1ated with the Kap1an-Meier method and compared by the Log-rank test at each SNP site.ResultsThe SNP sites of nuc1eotides 16266 C/T were corre1ated with age-at-onset by the Log-rank test. The onset age of patients with 16266T genotype was significant1y younger than that of patients with 16266C at the 16266 site（P＜0.05）.ConclusionGenetic po1ymorphisms in the D-1oop are predictive markers for age-at-onset in ESCC patients.According1y，the ana1ysis of genetic po1ymorphisms in the mitochondria1 D-1oop can he1p to identify ESCC patient subgroups at high risk of ear1y onset.

po1ymorphisms，sing1e nuc1eotide；esophagea1 neop1asms；mitochondria1

R735.1

A

1007-3205（2012）04-0391-03

2011-12-20；

2012-03-29

范海燕（1978-），女，河北石家莊人，河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院主治醫(yī)師，醫(yī)學碩士，從事消化系統(tǒng)疾病診治研究。

*通訊作者。E-mai1：zjguo5886@yahoo.com.cn

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.04.007