楊潔

(菏澤醫(yī)學(xué)?？茖W(xué)校,山東 菏澤 274000)

軀干神經(jīng)嵴干細(xì)胞殼聚糖纖維復(fù)合硅膠管治療坐骨神經(jīng)損傷的實驗研究

楊潔

(菏澤醫(yī)學(xué)?？茖W(xué)校,山東 菏澤 274000)

目的探討體外培養(yǎng)的軀干神經(jīng)嵴干細(xì)胞在殼聚糖纖維上立體培養(yǎng)后復(fù)合硅膠管治療坐骨神經(jīng)損傷的實驗研究。方法采用孕10.5d Wistar大鼠的胚胎神經(jīng)管分離培養(yǎng)軀干神經(jīng)嵴干細(xì)胞，將體外培養(yǎng)48 h的軀干神經(jīng)嵴干細(xì)胞接種在殼聚糖纖維材料上，觀察兩者的組織相容性。應(yīng)用黏附有軀干神經(jīng)嵴干細(xì)胞殼聚糖纖維復(fù)合硅膠管橋接了缺損的大鼠坐骨神經(jīng)，術(shù)后進(jìn)行電生理、組織學(xué)檢測，觀察了周圍神經(jīng)再生及神經(jīng)通路重建的狀況。結(jié)果從神經(jīng)管取材的軀干神經(jīng)嵴干細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基內(nèi)可以大量擴(kuò)增；將軀干神經(jīng)嵴干細(xì)胞接種在殼聚糖纖維支架材料上行掃描電鏡觀察，可見軀干神經(jīng)嵴干細(xì)胞貼附在殼聚糖纖維表面，存活良好，表明軀干神經(jīng)嵴干細(xì)胞與殼聚糖纖維支架材料有良好的相容性；橋接手術(shù)后，電生理檢測結(jié)果顯示，含軀干神經(jīng)嵴干細(xì)胞的殼聚糖-硅膠管橋接組坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)潛速率及波幅值顯著好于單純硅膠管橋接組(均P＜0.01)；甲苯胺藍(lán)染色光鏡觀察及圖像分析結(jié)果均顯示含軀干神經(jīng)嵴干細(xì)胞的殼聚糖-硅膠管橋接組再生軸突的髓鞘化更明顯，再生纖維密度及直徑等各檢測指標(biāo)均優(yōu)于單純硅膠管橋接組（均P＜0.01）。結(jié)論殼聚糖纖維支架材料與軀干神經(jīng)嵴干細(xì)胞構(gòu)建的橋接管具有良好的生物相容性，其中軀干神經(jīng)嵴干細(xì)胞可分化為施萬細(xì)胞，以此橋接缺損的周圍神經(jīng)，可促進(jìn)其再生和修復(fù)。

軀干神經(jīng)嵴干細(xì)胞；組織工程；殼聚糖纖維；神經(jīng)再生

周圍神經(jīng)的損傷，再生和功能重建一直是外科領(lǐng)域中的難題之一。多年來臨床常規(guī)的治療方法是自體神經(jīng)移植,但自體神經(jīng)移植不僅會給供區(qū)帶來新的創(chuàng)傷，而且常采用的供體—皮神經(jīng)較細(xì)小，不能滿足臨床需要。絕大多數(shù)的周圍神經(jīng)是混合神經(jīng)，它們含有多種纖維成分，所以當(dāng)神經(jīng)損傷后導(dǎo)致?lián)p傷近端及遠(yuǎn)端神經(jīng)的對位關(guān)系紊亂從而影響神經(jīng)的再生和功能修復(fù)[1]。雖然現(xiàn)在的顯微外科技術(shù)十分發(fā)達(dá)，但是周圍神經(jīng)損傷的治療一直沒有得到很好的解決。近年來，隨著組織工程學(xué)的進(jìn)展為周圍神經(jīng)損傷掀開了新的一頁。神經(jīng)嵴干細(xì)胞是一種多潛能神經(jīng)干細(xì)胞，是周圍神經(jīng)系統(tǒng)的原基，也是施萬細(xì)胞的祖細(xì)胞。神經(jīng)嵴干細(xì)胞分為顱和軀干部兩種，其中軀干神經(jīng)嵴干細(xì)胞主要分化為周圍神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)。將軀干神經(jīng)嵴干細(xì)胞作為種子細(xì)胞應(yīng)用于組織工程的研究報道較少。殼聚糖是一種在體內(nèi)有良好組織相容性、無毒副作用、可自然降解吸收的生物材料，殼聚糖的結(jié)構(gòu)和某些理化性質(zhì)與細(xì)胞外基質(zhì)中的主要成分氨基多糖極其相似，且表面高密度的正電荷有利于黏附帶負(fù)電荷的細(xì)胞，常被應(yīng)用于組織工程。本實驗通過組織植塊法體外培養(yǎng)軀干神經(jīng)嵴干細(xì)胞并擴(kuò)增，將體外培養(yǎng)的軀干神經(jīng)嵴干細(xì)胞的細(xì)胞懸液滴加在殼聚糖纖維上共培養(yǎng)；建立大鼠坐骨神經(jīng)損傷模型，行黏附有軀干神經(jīng)嵴干細(xì)胞的殼聚糖纖維—硅膠管橋接大鼠坐骨神經(jīng)；并對周圍神經(jīng)的再生及再生后神經(jīng)通路重建的觀察。這項實驗研究顯示了種植有軀干神經(jīng)嵴干細(xì)胞的殼聚糖纖維引導(dǎo)軸突再生的可能性，為使用組織工程修復(fù)周圍神經(jīng)損傷提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 Wistar大鼠，由山東大學(xué)實驗動物中心提供；DMEM/F12（1：1）、胎牛血清、MTT、DMSO、多聚賴氨酸（PLL）、5-溴脫氧尿核苷（BrdU）購自Sigma公司；S-100、B27、bFGF購自Gibco公司；小鼠抗大鼠nestin單克隆抗體購自Boster公司；FITC標(biāo)記抗兔IgG、TRITC標(biāo)記抗小鼠IgG、OCT凍存液購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；殼聚糖纖維，由上海高純生物股份有限公司提供，殼聚糖纖維經(jīng)γ射線消毒后備用；硅膠管購自山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院。

1.2 軀干神經(jīng)嵴干細(xì)胞的取材、培養(yǎng)及鑒定 無菌條件下取孕10.5 d大鼠胚胎，解剖顯微鏡下剖離神經(jīng)管，切取其軀干部即近尾側(cè)端10個體節(jié)長度的神經(jīng)管。使用0.75 mg/mL膠原酶消化1 min，用含10%胎牛血清的DMEM/F12沖洗組織以抑制膠原酶的活性。將取出的神經(jīng)管種植于預(yù)先用鼠尾膠包被的培養(yǎng)皿中，放入37℃培養(yǎng)箱孵育30 min后，加入5 ml含有10 ng/ml bFGF、10ng/ml EGF培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h后去除神經(jīng)管。

1.3 神經(jīng)嵴干細(xì)胞種植在殼聚糖纖維上的光鏡和電鏡觀察 原代細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，在37℃條件下，用0.125%胰蛋白酶溶液消化培養(yǎng)皿中的細(xì)胞3 min，10%胎牛血清的DMEM/F12終止消化，吹打后，1000 r/min離心5 min,棄上清液，加入含10 ng/ml bFGF、10 ng/mlEGF的神經(jīng)嵴干細(xì)胞培養(yǎng)液，充分吹打成細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液滴加在殼聚糖纖維上培養(yǎng)，隔日加含血清的neuregulin生長因子，培養(yǎng)7d。7d后，在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞在殼聚糖纖維上的生長、遷徙和分化情況。用含2.5%戊二醛0.1 mol/L的PBS固定2 h，作掃描電鏡觀察。

1.4 坐骨神經(jīng)切損及橋接 隨機(jī)將38只健康雄性Wistar大鼠，分為兩組，每組19只。對兩組實驗動物進(jìn)行橋接手術(shù)：將大鼠腹腔注射水合氯醛（30 mg/kg）麻醉后固定動物，備皮后，常規(guī)進(jìn)行消毒與鋪洞巾，用手指觸摸確定大鼠股骨位置后，將實驗動物的右腿后部作一個橫行正中切口，沿切口處切開皮膚后使用手術(shù)剪鈍性分離肌肉，充分暴露大鼠右側(cè)的坐骨神經(jīng)。使用手術(shù)剪將其坐骨神經(jīng)剪斷，剪斷前用顯微針線在損傷坐骨神經(jīng)外膜掛線，使用顯微線縫神經(jīng)纖維膜向前穿行一段距離，剪斷后生成1 cm的缺口。使用黏附有軀干神經(jīng)嵴干細(xì)胞的殼聚糖纖維-硅膠管將受損神經(jīng)的斷端縫合，將剪斷的神經(jīng)斷端套入硅膠管中結(jié)扎，向前平行縫合2針，在受損坐骨神經(jīng)的另一側(cè)掛線后結(jié)扎，然后按順序縫合肌肉與皮膚，術(shù)后動物常規(guī)飼養(yǎng)。

1.5 術(shù)后觀察及檢測

1.5.1 動物大體觀察 橋接術(shù)后，每周定期觀察手術(shù)部位傷口愈合及大鼠的行走情況。

1.5.2 電生理檢測 術(shù)后8周及14周，實驗組和對照組各隨機(jī)抽取9只動物，水合氯醛（30 mg/kg）腹腔麻醉。使用keypoint肌電圖儀，將刺激電極置于坐骨結(jié)節(jié)與大轉(zhuǎn)子之間的坐骨神經(jīng)表淺部位，記錄電極插入小腿三頭肌中，地線接于皮膚上，對再生神經(jīng)進(jìn)行電刺激誘發(fā)再生神經(jīng)產(chǎn)生動作電位，記錄產(chǎn)生動作電位的傳導(dǎo)潛速率，測量再生神經(jīng)的動作電位與振幅，檢測兩組動物的功能恢復(fù)情況。

1.5.3 灌注、取材 大鼠飼養(yǎng)48 h后，水合氯醛（30 mg/kg）腹腔麻醉，經(jīng)左心室常規(guī)灌注。用剪刀沿脊柱兩側(cè)剪開皮膚及與之相連的肌肉等軟組織，用咬骨鉗咬開椎管，小心分離脊髓，取L4－6節(jié)段脊髓，置于4%的多聚甲醛PBS溶液中進(jìn)行后固定，6 h后放入30%的蔗糖PBS溶液中。待脊髓沉到底部，用OCT凍存液包埋，置于-20℃低溫冰箱內(nèi)冷凍12 h，然后轉(zhuǎn)入-80℃超低溫冰箱內(nèi)凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.4 冰凍切片及觀察 應(yīng)用恒冷切片機(jī)連續(xù)橫斷面切片，片厚20μm，直接貼片法收集切片，封片后直接置于熒光顯微鏡下觀察。

1.5.5 甲苯胺藍(lán)染色、透射電鏡觀察 術(shù)后8周及14周，取再生神經(jīng)的遠(yuǎn)端5 mm，2.5%戊二醛固定24 h,磷酸緩沖液沖洗三次，10 min/次；1%鋨酸4℃后固定2 h，雙蒸水4℃沖洗10 min/次，共三次；梯度乙醇脫水，50%→70%→90%，各10 min，100%兩次，各15 min；置換環(huán)氧丙烷兩次，各15 min；環(huán)氧丙烷：樹脂＝1：1，1 h，室溫；環(huán)氧丙烷：樹脂＝1：4，1 h，室溫；純樹脂浸透2 h，室溫；純樹脂包埋，聚合：35℃，16 h；45℃，8 h；55℃，4 h；60℃,48 h；修塊，半薄切片，甲苯胺藍(lán)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察，每個標(biāo)本取8張切片，對切片使用IPP圖像處理系統(tǒng)進(jìn)行處理，計算實驗組和對照組的再生神經(jīng)纖維密度、直徑及再生髓鞘的厚度；超薄切片，醋酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛染色。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 通過SAS軟件包進(jìn)行統(tǒng)計分析和處理，實驗所得數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗對兩組間的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 軀干神經(jīng)嵴干細(xì)胞在殼聚糖纖維上的生長觀察

將軀干神經(jīng)嵴干細(xì)胞接種在殼聚糖纖維上，培養(yǎng)24 h可見殼聚糖纖維上的細(xì)胞多數(shù)呈梭形，胞體飽滿，立體感強(qiáng)，有2～3個突起，突起首尾相連形成串珠樣結(jié)構(gòu)，沿殼聚糖纖維遷徙（圖1-A、B）。培養(yǎng)48 h可見有大量細(xì)胞黏附。

圖1 聯(lián)合培養(yǎng)24 h后，軀干神經(jīng)嵴干細(xì)胞呈首尾相連黏附在殼聚糖纖維上（←）倒置相差顯微鏡觀察A（×400）B（× 200）

2.2 掃描電鏡觀察結(jié)果 掃描電鏡可見殼聚糖纖維上有細(xì)胞黏附,細(xì)胞呈梭形或橢圓形，胞體較小，末端有兩個細(xì)長的突起（圖2-A）。許多細(xì)胞聚集在一起，呈現(xiàn)“端對端”，“肩并肩”的串珠樣排列，細(xì)胞密集的部位可重疊在一起（圖2-B）。

圖2 軀干神經(jīng)嵴分化的施萬樣細(xì)胞在殼聚糖纖維上的生長狀態(tài)，掃描電鏡下觀察。

2.3 動物一般觀察結(jié)果 術(shù)后兩組動物均行動困難，右后肢拖曳行走，足背觸地，少數(shù)實驗動物切口化膿感染，未經(jīng)處理自行于兩周后結(jié)痂；術(shù)后14周，兩組動物跛行減輕，實驗組動物活動度較對照組靈敏。

2.4 電生理檢測結(jié)果 術(shù)后8周，兩組動物能記錄到微弱的動作電位,波幅較小。術(shù)后14周，兩組動物均記錄到復(fù)合肌肉動作電位,兩組動物神經(jīng)傳導(dǎo)潛速率及波幅值統(tǒng)計結(jié)果顯示有顯著差異。術(shù)后8周再生神經(jīng)傳導(dǎo)潛速率、波幅值比較。單純硅膠管橋接組神經(jīng)傳導(dǎo)潛速率（10.35±3.27）m/s，波幅值（7.135±1.378）mv；含軀干神經(jīng)嵴干細(xì)胞的殼聚糖纖維-硅膠管橋接組神經(jīng)傳導(dǎo)潛速率（13.24±3.91）m/s，波幅值（8.819±1.265）mv。(P＜0.01)。

術(shù)后14周再生神經(jīng)傳導(dǎo)潛速率、波幅值比較。單純硅膠管橋接組神經(jīng)傳導(dǎo)潛速率（23.08±4.29）m/s，波幅值（6.035±1.158）mv；含軀干神經(jīng)嵴干細(xì)胞的殼聚糖纖維-硅膠管橋接組神經(jīng)傳導(dǎo)潛速率（28.50±3.81）m/s，波幅值（9.699±1.325）mv(P＜0.01)。

2.5 甲苯胺藍(lán)染色及透射電鏡觀察結(jié)果 術(shù)后8周甲苯胺藍(lán)染色顯示，兩組實驗動物再生軸突的髓鞘化不太明顯，有髓纖維數(shù)目較少；術(shù)后14周甲苯胺藍(lán)染色顯示，單純硅膠管橋接組有髓纖維數(shù)目較少，分布不均勻；含軀干神經(jīng)嵴干細(xì)胞的殼聚糖-硅膠管橋接組橋接組再生軸突的髓鞘化更明顯，有髓纖維數(shù)目較多，排列緊密。

3 討論

在臨床上外傷，腫瘤等常常導(dǎo)致周圍神經(jīng)損傷，導(dǎo)致患者致殘，喪失勞動和生活能力，如何修復(fù)受損的周圍神經(jīng)一直困擾著專家學(xué)者。在早期的研究中，人們常常使用自體神經(jīng)移植進(jìn)行周圍神經(jīng)缺損的修復(fù)治療，但是自體神經(jīng)并不能很好的解決神經(jīng)缺損帶來的不良后果，比如神經(jīng)再生后的功能重建問題等，而且自體神經(jīng)的來源和取材較為困難[2-3]。所以使用組織工程的方法構(gòu)建具有種子細(xì)胞活性的組織工程化人工神經(jīng)，以促進(jìn)周圍神經(jīng)損傷的修復(fù)成為近年來研究的熱點。

組織工程學(xué)是一門利用組織學(xué)與工程學(xué)的方法研究生物可替代物的科學(xué)。這種生物可替代物包括細(xì)胞、器官與組織。組織工程器官包括骨、皮膚、血管及輸尿管等。組織工程化人工神經(jīng)的關(guān)鍵因素是種子細(xì)胞的培養(yǎng)與擴(kuò)增、支架材料的選擇以及神經(jīng)生長的微環(huán)境。Fansa等[4]最先將體外培養(yǎng)的施萬細(xì)胞植入經(jīng)過去除細(xì)胞成分的骨骼肌后，橋接于坐骨神經(jīng)的損傷處，促進(jìn)了損傷神經(jīng)的再生。在病理生理過程中，施萬細(xì)胞參與周圍神經(jīng)的修復(fù)首先是形成Büngner條帶[5-8]，從而引導(dǎo)軸突延伸。實驗證明單純移植施萬細(xì)胞雖對神經(jīng)再生有效。國內(nèi)很多學(xué)者利用施萬細(xì)胞結(jié)合相關(guān)生物材料修復(fù)周圍神經(jīng)離斷損傷取得了滿意的實驗效果[9]。

施萬細(xì)胞作為一種神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞可以在周圍神經(jīng)損傷后可分泌營養(yǎng)因子，這種營養(yǎng)因子對神經(jīng)的再生和修復(fù)起誘導(dǎo)及營養(yǎng)的作用。有研究顯示：在周圍神經(jīng)的損傷時施萬細(xì)胞起了調(diào)控再生神經(jīng)生長的作用。但是施萬細(xì)胞作為一種終末期的細(xì)胞，其數(shù)量及分化能力是非常有限的。

近年來，國外學(xué)者對神經(jīng)嵴干細(xì)胞進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)嵴干細(xì)胞在體內(nèi)、外均可以分化成為施萬樣細(xì)胞，為周圍神經(jīng)損傷后的再生提供有利的微環(huán)境[9]，這為篩選構(gòu)建組織工程化人工神經(jīng)的種子細(xì)胞提供了新思路。

神經(jīng)嵴是在胚胎發(fā)育早期，外胚層與神經(jīng)溝邊緣之間的神經(jīng)外胚層細(xì)胞在神經(jīng)管的背外側(cè)構(gòu)成與神經(jīng)管平行排列的兩條帶狀的細(xì)胞索，從中腦平面一直延伸至尾部。根據(jù)其位置，又可分為顱神經(jīng)嵴和軀干神經(jīng)嵴兩部分。由神經(jīng)嵴分化出的細(xì)胞稱為神經(jīng)嵴干細(xì)胞。神經(jīng)嵴干細(xì)胞主要分化成為脊髓和腦的感覺神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和內(nèi)臟神經(jīng)節(jié)后神經(jīng)元以及神經(jīng)膜細(xì)胞、衛(wèi)星細(xì)胞、施萬細(xì)胞等周圍神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，并可分化成為濾泡旁細(xì)胞、頸動脈體Ⅰ型細(xì)胞、黑色素細(xì)胞、腎上腺髓質(zhì)的嗜鉻細(xì)胞等[10-11]。本實驗將體外培養(yǎng)的軀干神經(jīng)嵴干細(xì)胞吹打成細(xì)胞懸液種植于殼聚糖纖維上，共培養(yǎng)24 h后使用倒置相差顯微鏡觀察，可見殼聚糖纖維上的細(xì)胞多數(shù)呈梭形，有2～3個突起，胞體飽滿，立體感強(qiáng)，沿殼聚糖纖維遷徙。培養(yǎng)48 h后可見有大量細(xì)胞黏附于殼聚糖纖維上。掃描電鏡觀察，可見殼聚糖纖維上有大量的細(xì)胞黏附，細(xì)胞大部分呈梭形，胞體較小，末端有兩個細(xì)長的突起，細(xì)胞密集的部位可重疊在一起，部分細(xì)胞末端呈扁平樣膨大，并伸出爪形偽足緊緊貼附于纖維的表面，胞體表面可見顆粒狀隆起和絨毛樣突起。以上實驗充分說明了體外擴(kuò)增培養(yǎng)的軀干神經(jīng)嵴干細(xì)胞與殼聚糖纖維的生物相相容性良好。

雖然殼聚糖在組織工程中有許多的優(yōu)勢，但是單純使用殼聚糖纖維作為支架材料并不理想。原因是殼聚糖的硬度低，易塌陷，作為支架材料必須具有抵抗外部組織的擠壓，同時為再生神經(jīng)向遠(yuǎn)處生長提供較為寬闊的空間。為了達(dá)到這一目的，我們使用殼聚糖纖維復(fù)合硅膠管的方法制成橋接管。硅膠管的硬度及韌性良好，我們事先將硅膠管剪成1cm的小管，沿其縱軸剪開后內(nèi)腔平鋪種植有軀干神經(jīng)嵴干細(xì)胞的殼聚糖纖維，利用硅膠管的韌性回縮力使其自然卷縮成管狀。實驗證明硅膠管為損傷的坐骨神經(jīng)的修復(fù)提供了空間，利用其硬度可以保護(hù)再生神經(jīng)免于受到周圍組織的壓迫，但是作為支架材料，硅膠管的可降解性差，在應(yīng)用時還需二次手術(shù)，這一問題在以后的研究中需要進(jìn)一步的探討。

神經(jīng)傳導(dǎo)潛速率代表了神經(jīng)沖動在神經(jīng)干、神經(jīng)肌肉接頭上的傳導(dǎo)速率，所以可更好地表示運動神經(jīng)纖維再生后與肌肉重建的聯(lián)系及其功能恢復(fù)情況，而且此方法操作簡便，對神經(jīng)的刺激較少，并可重復(fù)實驗[12]。所以我們在觀察再生神經(jīng)功能恢復(fù)時，采用肌電圖測定神經(jīng)傳導(dǎo)潛速率的方法。術(shù)后8、14周肌電圖檢測結(jié)果顯示實驗組再生神經(jīng)的運動傳導(dǎo)潛速率及波幅值均明顯好于對照組，說明含實驗組再生神經(jīng)的運動傳導(dǎo)功能恢復(fù)要好于使用對照組。

術(shù)后8周，取橋接區(qū)再生神經(jīng)超薄切片透射電鏡觀察，實驗組動物的再生神經(jīng)髓鞘數(shù)量多于對照組；但半薄切片甲苯胺藍(lán)染色顯示實驗組和對照組再生神經(jīng)纖維的髓鞘不明顯；術(shù)后14周取橋接區(qū)再生神經(jīng)超薄切片透射電鏡觀察，實驗組動物的再生神經(jīng)顯微髓鞘數(shù)量要明顯多于對照組，再生的神經(jīng)纖維髓鞘較厚；半薄切片甲苯胺藍(lán)染色顯示實驗組再生的神經(jīng)纖維的數(shù)量和排列均優(yōu)于對照組。

本實驗研究結(jié)果表明，軀干神經(jīng)嵴干細(xì)胞與殼聚糖纖維具有良好的組織相容性，軀干神經(jīng)嵴干細(xì)胞不僅黏附于殼聚糖纖維上生長，還可以分化成為施萬樣細(xì)胞。我們將神經(jīng)嵴干細(xì)胞作為種子細(xì)胞種植于殼聚糖纖維上，并與硅膠管一起制作成組織工程橋接管，為周圍神經(jīng)提供了一個有利的再生微環(huán)境，實驗證明其能促進(jìn)周圍神經(jīng)修復(fù)，具有很好的應(yīng)用前景和深入研究的價值

[1] Soichiro Itoh,Masumi,Suzuki,et al.Develoment of a Never Scaffold Using a Tendon chitosan Tube[J]..International Society for Artificial Organs,2003,27(12):1079-1088.

[2] Jorge B.Aquino,Jens Hjerling-Leffler,Martion Koltzenburg,et al.In vitro and in vivo differentiation of boundary cap neural crest stem cells into mature Swchann[J].Experimental Neurology,2006,198:438-449.

[3] Ju W,Yang Y,Tao Q,et al.Interleukin-18 gene transfer increase antitumor effects of suicide gene therapy through efficient induction of antitumor immunit[J].Y Gene Thera,2000,7(19)：1672-1679.

[4] Chakraborty NG,Qkino T,Stabach P,et al.Adoptive transfer of activated human autologous macrophages results in regression of transplanted human melanoma cells in SCID mice[J].In vivo,1991,5(6): 609-614.

[5] 盧靜,孫晉浩,張靜,等.軀干神經(jīng)嵴干細(xì)胞體外分離培養(yǎng)及其增殖、分化的實驗研究[J].山東大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2009，9（5）:112-115.

[6] Le Douarin NM,ziller C,Couly GF，et al.Patterning of neural crest derivatives in the avian embryo:in vivo and in vitro studies[J].Dev Biol, 1993,159(1):24-29.

[7] Anne Baroffio,Elisabeth Duptin,Nicole M.Le douarin et al.Common Precursors for neural and mesectodermal derivatives in the cephalic neural crest[J].Development,1991,112(3):301-305.

[8] 劉文靜，孫晉浩，李振華，等.組織工程橋接管治療坐骨神經(jīng)損傷的實驗研究[D].山東大學(xué)，2008，7（5）:33-35.

[9] 丁文龍，汪洋，李鋒,等.Swchann細(xì)胞在殼聚糖纖維上的立體培養(yǎng)[J].解剖學(xué)雜志，2004，27（6）：630-633.

[10] Soichiro Itoh,Isamu Yamaguchi,Masumi Suzuki,et al.Hydroxyapatite-coated tendon chitosan tubes with absorbed laminin peptides facitate nerve regeneration in vivo[J].Brain Research 2003,993（3）: 111-123.

[11] Zhang M，Li X，Gong Y，Zhang N，et al.Properties and biocompatibility of chitosan films modified by blending with[J].Biomaterials 2002,23(2):2641-2648.

[12] Ying Yuan,Peiyn zhang,XiaosongGu,et al.The interaction of施萬cells with chitosan membranes and fibers in vivo[J].Biomaterials 2004,25(1):4273-4278.

An Empirical Study on Repairing the Injury of Sciatic Nerve with the Trunk Neural Creat Stem Cell and Chitosan Fiber to Compound the Slilica Gel-tube

Yang jie
(heze Medical College,heze,shandong,274000)

Neural crest；Stem cell;tissue engineering;chitosan;nerve regeneration

R616;R651.2

A

1008-4118（2012）01-0001-05

10.3969/j.issn.1008-4118.2012.01.01

2011-12-23

菏澤醫(yī)學(xué)?？茖W(xué)校基金研究課題（編號：H11K01）。

Absrract：ObjectiveWe isolate and culture the trunk neural crest stem cell using tissue culture of neural tube in the E10.5 Wistar rat embryo in defined medium,then explore its’biological properties.MethodsThe trunk neural crest stem cells using tissure culture of neural tube in vitro were cultured on the chitosan fiber.Used immunofluoresecence to indentify the trunk neural crest cells.Observed the histocompatibility of them,the trunk neural stem cells were cultured with the chitosan-slilca sebific duct scaffold, the growth of cells was observed by scanning electron microscope.10mm sciatic nerve defects were bridged with chitosan-slilca sebific duct scaffold cultured with trunk neural stem cells,sebific gel tubes without trunk neural stem cells served as controls.After grafting, the regenerated nerves were evaluated by electrophysiological examination,histological staining,retrograde tracing and electron microscope observe.ResultsUsing tissure culture of neural tube,we can isolate and culture the trunk neural crest stem cells.The trunk neural crest stem can grow adhered on the chitosan fiber after inoculation.Scanning elector microscope,the trunk neural crest stem cell were spindle.proliferated and migrated along fiber.There is good histocompatibibity between the chitosan fiber and the trunk neural crest stem cells,the trunk neural crest stem cell can differentiate into Schwann cell..At 8 weeks after surgery,weak action potentials were found in the experiment group only.At 14 weeks after surgery,the conduction velocity and wave amplitude of experiment group was better than the control group,and the difference was evident（P＜0.01）.ConclusionThere is good histocompatibibity between the chitosan fiber and the trunk neural crest stem cells,the trunk neural crest stem cell can differentiate into Schwann cell.They contributed to the promotion of axonal regeneration.