楊 靜，萬(wàn)志榮，杜繼臣

（航天中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,北京 100049）

實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）是多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）的理想動(dòng)物模型，后者是以中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)脫髓鞘病變?yōu)樘攸c(diǎn)的自身免疫性疾病，呈慢性病程且傾向于年輕人罹患，是重要的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一。但目前用于治療MS的藥物大多由于療效局限、缺乏特異性、毒副作用大等原因限制了其臨床應(yīng)用。因此在EAE的基礎(chǔ)上尋找療效可靠、不良反應(yīng)小且廉價(jià)的藥物是我們目前研究的主要方向。1995年，Kobashigawa[1]等最早發(fā)現(xiàn)他汀類藥物具有免疫調(diào)節(jié)作用。之后美國(guó)加州大學(xué)的Zamvil等[2]通過(guò)對(duì)他汀類藥物的全面研究，欣喜地發(fā)現(xiàn)廣泛用來(lái)降低膽固醇的他汀類藥物也許能夠治療 MS。但目前國(guó)內(nèi)應(yīng)用他汀類藥物治療 EAE/MS的研究報(bào)道很少。本實(shí)驗(yàn)是在建立EAE模型的基礎(chǔ)上，探討不同劑量的阿托伐他汀對(duì)EAE神經(jīng)功能的保護(hù)作用及其可能的機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供重要的理論和實(shí)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Wistar大鼠，6～8周齡，體質(zhì)量 180～200g，雌性；豚鼠，體質(zhì)量（400±50）g，雌雄不限。

1.2 主要試劑

立普妥（阿托伐他汀鈣片，大連輝瑞制藥有限公司），碾成粉末狀，用蒸餾水溶解；白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-4放射免疫試劑盒（解放軍總醫(yī)院科技開(kāi)發(fā)中心放射免疫所）；羊毛脂、液體石蠟油（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；卡介苗（北京生物制品研究所）等。

1.3 免疫抗原及動(dòng)物模型的制備[3]

取新鮮豚鼠脊髓，與冰生理鹽水制成50%（質(zhì)量/體積）的脊髓生理鹽水勻漿，后與完全福氏佐劑（CFA，每毫升含6mg卡介苗）混合成油包水抗原乳劑。取上述抗原乳劑 0.5ml，分別注入 Wistar大鼠的四足掌膠質(zhì)墊及背部皮下。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組及藥物干預(yù)

未做免疫誘導(dǎo)的大鼠（10只）為正常對(duì)照組。免疫誘導(dǎo)后的大鼠（90只）隨機(jī)分為 EAE模型組，小劑量治療組和大劑量治療組，每組30只。每組分別于免疫誘導(dǎo)后第1天開(kāi)始以生理鹽水、2mg/kg及8mg/kg計(jì)算的阿托伐他汀灌胃。各組又根據(jù)病程分為14d、21d、28d三個(gè)亞組，每小組10只大鼠。

1.5 癥狀觀察及神經(jīng)功能評(píng)分

觀察大鼠每日體質(zhì)量變化、精神狀態(tài)及活動(dòng)情況，并進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，采用Hooper的7分評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[4]：0分：正常；1分：被毛不光整，尾部無(wú)力；2分：尾部癱瘓；3分：尾部癱瘓+后肢無(wú)力；4分：尾部癱瘓+后肢部分癱瘓；5分：后肢完全癱瘓；6分：四肢癱瘓；7分：瀕死狀態(tài)或死亡。

1.6 留取標(biāo)本

各組均于免疫誘導(dǎo)后第14天（發(fā)病期）、第21天（恢復(fù)期）、第28天（復(fù)發(fā)期）處死動(dòng)物，留取血清并保存。

1.7 觀察阿托伐他汀對(duì)EAE病情的影響

分別記錄各組發(fā)病率、發(fā)病時(shí)間、大鼠的體質(zhì)量變化并進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。

1.8 觀察阿托伐他汀對(duì)EAE病理?yè)p傷的影響

留取的脊髓組織經(jīng)處理切片，行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察組織中血管周圍炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的情況。

1.9 IL-4的測(cè)定

取各組大鼠血清，應(yīng)用IL-4放射免疫試劑盒，按實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，用GC-911γ放射免疫計(jì)數(shù)器測(cè)定大鼠血清中IL-4的含量。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所得數(shù)據(jù)經(jīng)SAS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；多組計(jì)量資料均數(shù)的比較應(yīng)用方差分析；各組之間率的比較用卡方檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 EAE模型的建立情況

免疫誘導(dǎo)后的大鼠于第 14天左右陸續(xù)出現(xiàn)肢體無(wú)力、癱瘓等癥狀，第17天左右疾病達(dá)高峰，病程持續(xù) 7～9d。EAE總發(fā)病率達(dá) 76.67%，其中經(jīng)阿托伐他汀治療后發(fā)病率明顯下降至33.33%（表 1）。在觀察時(shí)間較長(zhǎng)（第 28天）的條件下大鼠發(fā)病率達(dá)100%，復(fù)發(fā)率也達(dá)到了70%，而經(jīng)阿托伐他汀治療后復(fù)發(fā)率降至 30%（表 2）。

表1 各組大鼠第14天EAE發(fā)病情況Table 1 Establishment of EAE rat models in different groups on day 14

表2 第28天組大鼠EAE復(fù)發(fā)情況Table 2 EAE rats in different groups on day 28

2.2 阿托伐他汀對(duì)EAE大鼠神經(jīng)功能的影響

表3結(jié)果表明，大劑量治療組的最高評(píng)分均值和總和評(píng)分均值都顯著低于EAE模型組（P＜0.05），因此，8mg/kg阿托伐他汀治療可使 EAE大鼠神經(jīng)功能損傷明顯減輕。

表3 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較Table 3 Neurological deficits score in different groups(n=30,±s)

表3 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較Table 3 Neurological deficits score in different groups(n=30,±s)

注: 小劑量治療組: 2mg/kg阿托伐他汀; 大劑量治療組: 8mg/kg阿托伐他汀。與EAE模型組比較,*P＜0.05

組別 最高評(píng)分均值 總和評(píng)分均值EAE模型組 3.3±0.5 42.1±25.7小劑量治療組 2.8±0.3 39.6±14.7大劑量治療組 1.8±0.2* 22.2±14.4*

2.3 阿托伐他汀對(duì)EAE病理?yè)p傷的影響

圖 1表明，發(fā)病第 14天時(shí)光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)EAE大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)形成血管袖套，三組比較，EAE模型組炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)目明顯高于大劑量治療組（P＝0.01），而與小劑量治療組之間炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)目的差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.08）。

圖1 各組大鼠脊髓組織病理改變Figure 1 Spinal histopathological changes of rats in different groups (HE ×100)

2.4 各組大鼠血清IL-4含量測(cè)定結(jié)果

表4結(jié)果表明，EAE大鼠血清內(nèi)IL-4含量于疾病復(fù)發(fā)期（第28天）時(shí)最低，恢復(fù)期（第21天）增加到最高值。大劑量（8mg/kg）阿托伐他汀可明顯增加機(jī)體內(nèi)的血清IL-4含量（P＜0.05）。

表4 各組大鼠IL-4測(cè)定結(jié)果Table 4 Serum IL-4 levels in different groups (n=30,μg/L,±s)

表4 各組大鼠IL-4測(cè)定結(jié)果Table 4 Serum IL-4 levels in different groups (n=30,μg/L,±s)

注: 小劑量治療組: 2mg/kg阿托伐他汀; 大劑量治療組:8mg/kg阿托伐他汀。與EAE模型組比較,*P＜0.05; 與第14天比較,#P＜0.05; 與第21天比較,△P＜0.05

組別 第14天 第21天 第28天EAE 模型組 0.42±0.18△ 0.57±0.33# 0.19±0.13△小劑量治療組 0.41±0.27△ 0.52±0.33# 0.21±0.02△大劑量治療組 0.51±0.27△ 0.78±0.59# 0.48±0.35*△

3 討 論

他汀類藥物對(duì)于MS的療效主要來(lái)自對(duì)其動(dòng)物模型EAE的研究。Youssef等[5]及Nath等[6]先后在EAE模型的基礎(chǔ)上觀察了他汀類藥物對(duì)MS的治療作用，之后一系列人類免疫細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)[7]和多中心的臨床研究[8]都證明他汀類藥物參與免疫反應(yīng)的多個(gè)環(huán)節(jié)對(duì) MS有治療作用。臨床常用的他汀類藥物種類較多，本實(shí)驗(yàn)選用了不良反應(yīng)發(fā)生率較低的阿托伐他汀進(jìn)行治療，同時(shí)它也是各種他汀類藥物中參與免疫反應(yīng)環(huán)節(jié)最多的一種[9]。

我們?cè)趯?duì)國(guó)內(nèi)外 EAE模型進(jìn)行了大量研究的基礎(chǔ)上[10]，選用國(guó)內(nèi)數(shù)量充足，價(jià)格便宜的 Wistar大鼠進(jìn)行誘導(dǎo)，增加了免疫原的用量，并提高了完全福氏佐劑中卡介苗的含量，使得EAE總的發(fā)病率達(dá)76.67%，28天組由于觀察時(shí)間較長(zhǎng)，發(fā)病率達(dá)到100%，復(fù)發(fā)率也高達(dá)70%，成功地建立了多病程的EAE模型，為進(jìn)一步的研究分析奠定了基礎(chǔ)，也使我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加真實(shí)可信。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察EAE的整體發(fā)病情況：大鼠在免疫誘導(dǎo)后14天左右發(fā)病，17天時(shí)達(dá)高峰，21天左右緩解，28天時(shí)部分大鼠處于疾病的復(fù)發(fā)期。阿托伐他汀可以明顯降低EAE的發(fā)病率和復(fù)發(fā)率，縮短病程，但不能顯著推遲首次發(fā)病的時(shí)間。對(duì)大鼠神經(jīng)功能評(píng)分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)各組分值高低與病程一致，而將不同組中每只患病大鼠高峰期時(shí)評(píng)分進(jìn)行比較，結(jié)果顯示大劑量治療組評(píng)分明顯低于模型組，證實(shí)阿托伐他汀可以明顯降低疾病的嚴(yán)重程度，減輕其臨床癥狀。但應(yīng)用小劑量阿托伐他汀治療后不能明顯改善大鼠的神經(jīng)功能，考慮其對(duì)EAE的治療必須在足夠濃度下才能發(fā)揮作用，這一結(jié)果與國(guó)外報(bào)道相符[11]。

IL-4主要由Th2細(xì)胞產(chǎn)生，曾被命名為B細(xì)胞生長(zhǎng)因子-1，不僅能促進(jìn)B細(xì)胞的分化與增殖；還能夠誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞增殖，促使Th0淋巴細(xì)胞向Th2淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，并促使Th2類細(xì)胞因子的產(chǎn)生[12,13]。在EAE的研究中 Khoury等[14]發(fā)現(xiàn)IL-4能抑制Th1細(xì)胞的活化及炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，進(jìn)而促使EAE的恢復(fù)，故是EAE的負(fù)向調(diào)節(jié)因子。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為三個(gè)時(shí)間點(diǎn)比較顯示，第 21天組大鼠血清中 IL-4含量明顯高于第14天和第28天組（P＜0.05），而第14天與第28天組大鼠血清中IL-4含量之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。三組比較，EAE模型組 IL-4含量明顯低于大劑量治療組（P＜0.05），而與小劑量治療組比較IL-4含量的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。本實(shí)驗(yàn)中EAE模型組血清IL-4含量的分析顯示，當(dāng)動(dòng)物處于發(fā)病初期時(shí)血清中IL-4含量與空白對(duì)照組相比顯示出明顯的降低，說(shuō)明IL-4在疾病早期就發(fā)揮了一定作用。而當(dāng)?shù)?21天時(shí)，動(dòng)物多處于疾病的緩解期，神經(jīng)功能缺損程度也明顯好轉(zhuǎn)時(shí)，IL-4水平也出現(xiàn)明顯升高且與空白對(duì)照組已無(wú)差異。當(dāng)?shù)?8天時(shí)，模型組10只動(dòng)物中有7只出現(xiàn)了臨床癥狀的二次發(fā)作，并且在處死時(shí)大部分仍然處于疾病的活動(dòng)期，IL-4水平出現(xiàn)下降，且明顯低于空白對(duì)照組的水平。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，動(dòng)物血清中細(xì)胞因子IL-4參與了疾病損傷的修復(fù)過(guò)程，而且IL-4的水平變化和疾病的活動(dòng)性呈負(fù)相關(guān)。在兩個(gè)治療組中也分別對(duì)第 14天、第 21天、第 28天三個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行比較，小劑量治療組IL-4水平在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別和EAE模型組相比均有數(shù)值上的升高，但沒(méi)有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。大劑量阿托伐他汀治療后，可以顯著提高疾病各個(gè)時(shí)期IL-4的表達(dá)，在整個(gè)疾病過(guò)程中起到保護(hù)機(jī)體，促進(jìn)神經(jīng)損傷恢復(fù)的作用，也體現(xiàn)了藥物作用的持續(xù)性[15]。

綜合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，阿托伐他汀可以明顯降低EAE的發(fā)病率和復(fù)發(fā)率，縮短病程，減少疾病對(duì)機(jī)體的神經(jīng)功能損害，促進(jìn)病情緩解。而這些作用與其提高機(jī)體中IL-4的含量緊密相關(guān)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀對(duì)EAE的治療作用是劑量相關(guān)性的，只有足夠大的藥物濃度才能達(dá)到其治療目的，但僅通過(guò)本實(shí)驗(yàn)還不能確定其安全有效的用藥劑量。因此要實(shí)現(xiàn)將他汀類藥物應(yīng)用于 MS的治療，仍需進(jìn)行大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床實(shí)踐。

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