(三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北宜昌443002)

脂溢性角化病(SK)又名老年疣、脂溢性疣及基底細(xì)胞乳頭瘤，是表皮和真皮結(jié)締組織共同增生構(gòu)成的良性腫瘤。由于SK臨床和組織病理表現(xiàn)與HPV感染引起的病毒疣有眾多相似之處，國(guó)內(nèi)外學(xué)者開始研究SK與HPV之間的關(guān)系，但并沒(méi)有達(dá)成共識(shí)［1～6］。本研究的目的是通過(guò)檢測(cè)SK組織中高危型HPV16和18的存在情況，以確定這兩型HPV是否與SK發(fā)病有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 材料 收集宜昌市第一人民醫(yī)院病理科2009～2011年的SK石蠟標(biāo)本43例份(觀察組)，組織來(lái)源均為非生殖器部位，其中取自四肢17例、頭面部23例、軀干3例;患者年齡為38～78歲，＞50歲者35例。正常皮膚組織標(biāo)本(對(duì)照組)15例份來(lái)源于整形美容科，其中取自軀干7例、面部5例、四肢3例;年齡為 20 ～ 45 歲。查閱文獻(xiàn)［7，8］設(shè)計(jì)引物，由上海生工合成。PCR Master Mix，DNA marker;小鼠抗HPV L1單克隆抗體，檢測(cè)型別為 HPV1、6、11、16、18、31;DyLight549 標(biāo)記山羊抗小鼠 IgG，DAPI染色液，其他相關(guān)試劑均為進(jìn)口或者分析純。儀器包括HM340E石蠟切片機(jī)、ECLIPSE TE2000-S倒置熒光顯微鏡、DMR型圖像分析系統(tǒng)、MJMini梯度PCR儀、DYCP-31DN型電泳儀、Gel Logic 100凝膠成像系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 HPV L1蛋白檢測(cè)方法 將石蠟組織連續(xù)切片，每片4μm;采用免疫組化法檢測(cè)HPVL1蛋白，按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。設(shè)置尖銳濕疣病理標(biāo)本為陽(yáng)性對(duì)照，熒光顯微鏡下555 nm激發(fā)，出現(xiàn)紅色熒光為陽(yáng)性;將一抗改為PBS的空白對(duì)照，無(wú)可見(jiàn)紅色熒光;正常皮膚組織為陰性對(duì)照。

1.2.2 HPV16、18 DNA檢測(cè)方法 采用 PCR法。采用簡(jiǎn)單裂解法從組織中提取總 DNA［9～11］。－20℃保存?zhèn)溆?。PCR步驟參照文獻(xiàn)［7，8］進(jìn)行。取5μL的PCR反應(yīng)產(chǎn)物與1μL的溴酚藍(lán)上樣緩沖液混勻，2%瓊脂糖凝膠電泳。在KODAK凝膠成像儀上掃描，照相。提取到的總DNA首先進(jìn)行β-globin擴(kuò)增，以保證提取方法及反應(yīng)條件的正確性和可靠性，并設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照(CaSik細(xì)胞、HeLa細(xì)胞)和陰性對(duì)照(HaCat細(xì)胞);瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)目的條帶:βglobin目的條帶為126 bp，HPV16 E6目的條帶為397 bp，HPV18 E6目的條帶為322 bp。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。組間比較用確切概率法。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HPV L1蛋白檢測(cè)結(jié)果 觀察組陽(yáng)性部位主要在上皮角化層及深部的角化珠內(nèi)，角化層陽(yáng)性反應(yīng)一般呈中等強(qiáng)度的熒光反應(yīng)，細(xì)胞核存在的部位多數(shù)無(wú)紅色熒光出現(xiàn)，呈負(fù)染狀態(tài)。觀察組出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)20例，陽(yáng)性率為46.51%;對(duì)照組陽(yáng)性4例，陽(yáng)性率為26.67%。兩組比較，P ＞0.05。

2.2 HPV16、18 DNA檢測(cè)結(jié)果 觀察組和對(duì)照組HPV16 E6和HPV18 E6均無(wú)陽(yáng)性結(jié)果，見(jiàn)圖1～3。

3 討論

HPV屬乳多空科病毒衣殼包含L1、L2兩種結(jié)構(gòu)蛋白。根據(jù)完全L1序列的開放讀碼框，可以將HPV分類編制成進(jìn)化分支圖［12］。其分類可以分為屬、種、型三級(jí)，共有 α、β、γ、δ等 18個(gè)屬。根據(jù)HPV感染人類組織的不同，又可將其分為兩型。皮膚相關(guān)型 HPV 主要有 HPV1、2、3、4、7、10、26 ～29、41、49、57、60、63、65、75 ～77 等;黏膜相關(guān)型 HPV 根據(jù)致癌性的大小又可分為高危型(HPV16、18)、中危型(HPV31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73、82、83)、低危型(HPV6、11、26、30、32、40、42 ～44、53 ～55、62、6、70、72、81)。

圖1 臨床標(biāo)本中β-globin基因引物擴(kuò)增電泳結(jié)果

圖2 脂溢性角化病標(biāo)本中HPV16 E6引物擴(kuò)增凝膠電泳結(jié)果

圖3 脂溢性角化病標(biāo)本HPV18 E6引物擴(kuò)增凝膠電泳結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)對(duì)HPV 16E6、HPV 18E6引物行PCR擴(kuò)增，觀察組及對(duì)照組標(biāo)本中均無(wú)陽(yáng)性結(jié)果。我們認(rèn)為，HPV16、HPV18不是非生殖器部位SK的致病因素。Akiyo等［6］應(yīng)用原位雜交、PCR、DNA 雜交等方法檢測(cè)104例SK病變組織中的HPV DNA，同時(shí)對(duì)原位雜交陽(yáng)性的標(biāo)本進(jìn)行免疫組化法檢測(cè)病毒衣殼蛋白，檢測(cè)型別包括黏膜型HPV(HPV6、11、16、18、30、31、33、35、45、51、52、56、58)和皮膚型HPV(HPV1、2)。結(jié)果顯示，28.8%的 SK 標(biāo)本中存在HPV DNA，原位雜交的陽(yáng)性反應(yīng)在表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的胞核內(nèi);免疫組化結(jié)果顯示，在顆粒層和角質(zhì)層的角蛋白細(xì)胞核內(nèi)有HPV蛋白的表達(dá);PCR結(jié)果顯示，HPV18感染率為 83.7%，HPV6感染率為77.9%，HPV18和 HPV6混合感染者占到70.2%，而 HPV1(7.7%)和 HPV2(14.4%)的感染率相對(duì)較低。作者推測(cè)，HPV很可能在SK的發(fā)病機(jī)制中起到重要的作用，其作用是通過(guò)混合感染HPV18和HPV6或者某些其他型別而實(shí)現(xiàn)的。Bai等［6］的研究結(jié)果顯示，外陰部位SK中HPV DNA的陽(yáng)性率達(dá)72%，主要為低危組的HPV6、11;HPV DNA呈陽(yáng)性的標(biāo)本中，Ki-67相應(yīng)的單克隆抗體Mib-1全部陽(yáng)性，與其他女陰部病損相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Mib-1作為目前較為肯定的核增殖標(biāo)志，其陽(yáng)性大致可反映皮損中HPV的存在。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述研究存在差異的原因可能是取材部位不同，我們主要選擇非生殖器部位的SK標(biāo)本，而Akiyo［4］及Bai等［6］的標(biāo)本來(lái)源于生殖器部位。非生殖器部位與HPV的感染有無(wú)相關(guān)性也存在爭(zhēng)論，Tsambaos等［2］應(yīng)用原位雜交的方法檢測(cè)173例非生殖器部位SK中的HPV，HPV陽(yáng)性率達(dá)到19.65%，在34例陽(yáng)性標(biāo)本中15 例 HPV6、11 陽(yáng)性，14 例 HPV31、33、35 陽(yáng)性，另有5例陽(yáng)性顯示是其他型別感染;因此作者認(rèn)為，非生殖器部位的SK中相當(dāng)一部分病例與HPV的感染有相關(guān)。而Lee等［3］應(yīng)用原位PCR探針雜交和PCR法檢測(cè)40例非生殖器部位SK中的HPV6、11、31、33，結(jié)果所有標(biāo)本均是陰性，認(rèn)為HPV6、11、31、33不是非生殖器部位 SK的致病因素。Li等［5］應(yīng)用通用型引物對(duì)55例非生殖器部位SK的活檢組織進(jìn)行巢氏PCR和測(cè)序分型，觀察組疣狀表皮發(fā)育不良相關(guān)性 HPV(HPV 5、8、9、12、14、15、17、19 ～25、36 ～38、47、49)的陽(yáng)性率為 76%，與對(duì)照組比較有顯著性差異;作者認(rèn)為，疣狀表皮發(fā)育不良型HPV在非生殖器部位SK的發(fā)病機(jī)制中起到一定的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)論及Lee等［3］的研究結(jié)果共同證明黏膜型HPV與非生殖器部位的SK沒(méi)有相關(guān)性。

本研究結(jié)果顯示，SK標(biāo)本中HPV L1蛋白的檢出率較高，但與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明SK標(biāo)本中存在HPV的感染，但不是致病因素。蛋白檢測(cè)的結(jié)果與HPV DNA的檢出情況存在差異，其原因可能是我們PCR中所用的HPV引物是針對(duì)黏膜型HPV16、18的，而鼠抗可以檢測(cè)5個(gè)黏膜型HPV L1蛋白(HPV6、11、16、18、31)和 1 個(gè)皮膚型HPV L1蛋白(HPV1)，由此可以推測(cè)免疫熒光法實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)到的HPV L1可能為HPV16、18以外的其他型別HPV，因此說(shuō)明有必要設(shè)計(jì)針對(duì)皮膚型的HPV引物進(jìn)行PCR。

研究［13～15］證實(shí)，上皮的存在對(duì)于 HPV 感染上皮基底層角質(zhì)形成細(xì)胞是必須的，但是病毒DNA的擴(kuò)增只發(fā)生在中上層棘細(xì)胞向最終的扁平鱗狀細(xì)胞分化的過(guò)程中。大部分微小的病毒蛋白，如L1、L2蛋白表達(dá)在上皮的表層，在這個(gè)部位子代病毒顆粒被組裝，最終隨著角化的團(tuán)塊脫落。本實(shí)驗(yàn)SK標(biāo)本的陽(yáng)性反應(yīng)主要表達(dá)在上皮角化部及深部的角化珠內(nèi)，與上述研究結(jié)果相一致。

通過(guò)本實(shí)驗(yàn)我們認(rèn)為非生殖器部位SK中并不存在HPV16、18 DNA，其發(fā)病機(jī)制與高危型HPV不相關(guān)，但是非生殖器部位SK中有HPV1、6、11、31中某一型或者某幾型L1蛋白的存在，屬于非特異性感染。下一步可收集更多的石蠟標(biāo)本應(yīng)用原位雜交的方法檢測(cè)更多的HPV型別與SK的相關(guān)性。

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