彭洪薇，袁向飛，李真真，顏次慧，李雙靜，張硯君

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院·北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院血液病醫(yī)院血液學(xué)研究所，實驗血液學(xué)國家重點實驗室，天津 300020)

腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性(multidrug resistance，MDR)是臨床腫瘤治療中一個導(dǎo)致化療失敗的主要原因之一［1］。靛玉紅是當(dāng)歸龍薈丸的一種有效抗腫瘤成分，人們將當(dāng)歸龍薈丸用于治療慢性粒細(xì)胞性白血病，取得了一定的療效［2］。PHⅡ-7是我們實驗室在前期的工作中從靛玉紅衍生物中篩選得到的有較好抗腫瘤活性和較低毒性的化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)見Fig 1。與靛玉紅相比，PHⅡ-7抗瘤譜更廣，對腫瘤細(xì)胞的抑制作用也更強(qiáng);更為突出的是，PHⅡ-7不僅對多種人腫瘤細(xì)胞有效，而且對數(shù)種人耐藥腫瘤細(xì)胞也有效［3］。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)，PHⅡ-7對CML(chronic myeloid leukemia，CML)耐藥細(xì)胞株K562/A02及其親代敏感細(xì)胞K562具有相同的殺傷作用，但其相關(guān)的機(jī)制并不明確。

Fig 1 The chemical structure of PHⅡ-7

近年來，一些研究表明某些化療藥具有升高腫瘤細(xì)胞內(nèi)ROS的作用［4］。不僅傳統(tǒng)的臨床應(yīng)用化療藥具有升高細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平的作用，一些具有能克服腫瘤細(xì)胞耐藥的新型化療藥也證實可以升高ROS水平，并且ROS水平的升高與多藥耐藥相關(guān)蛋白(MDR-1)表達(dá)的下調(diào)呈正相關(guān)［5－6］。我們試圖從ROS出發(fā)，旨在探討 PHⅡ-7對白血病CML細(xì)胞系K562及其相應(yīng)的耐藥細(xì)胞系K562/A02殺傷機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1培養(yǎng)基RPMI 1640培養(yǎng)基購自 Gibco公司;胎牛血清購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院天津血研所科技公司。

1.1.2藥物PHⅡ-7由我室合成，原藥以 DMSO溶解，配制成50 g·L－1貯存液，分裝后 －20℃貯存?zhèn)溆?，溶解后藥物溶液中DMSO的終濃度＜1‰。

1.1.3其他試劑二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司，活性氧探針DCFH-DA及NAC購自江蘇海門碧云天生物研究所，細(xì)胞凋亡檢測試劑盒apoptosis I購自美國碧迪公司。Cell counting kit-8 reagent購自日本同仁化學(xué)研究所，抗PARP、caspase-3、caspase-9及GAPDH抗體均為Cell Signaling Technology公司產(chǎn)品。

1.1.4細(xì)胞株及細(xì)胞培養(yǎng)人白血病細(xì)胞株K562，及其相對應(yīng)的耐藥細(xì)胞株K562/A02由本室保存。于10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基中，5%CO2，37℃孵箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行試驗。

1.1.5試驗儀器CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，德國Heraeus公司;酶標(biāo)儀(Bio-tek，USA)，流式細(xì)胞儀(BD LSRⅡ，USA)，激光共聚焦顯微鏡(德國Leika)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞活力檢測利用WST-8試劑(Dojindo laboratories，日本同仁化學(xué)研究所)測定腫瘤細(xì)胞對藥物的敏感性。取對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板(每孔15 000個細(xì)胞)，培養(yǎng)過夜，次日每孔加入10 μl相應(yīng)濃度的藥物，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，然后每孔加入10 μl CCK-8 試劑，37℃，5%CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，酶標(biāo)儀450 nm測定吸光度。按下列公式計算細(xì)胞的存活率及生長抑制率:細(xì)胞存活率/%=(加藥組平均 OD值/對照組平均 OD值)×100%;生長抑制率/%=(1－加藥組平均OD值/對照組平均OD值)×100%，按BLISS法計算機(jī)程序求出半數(shù)抑制濃度IC50。以上實驗平行重復(fù)3次。

1.2.2細(xì)胞凋亡檢測取對數(shù)生長期的細(xì)胞，稀釋接種于6孔板中進(jìn)行培養(yǎng)(每孔3×105細(xì)胞)，相應(yīng)濃度藥物處理24 h后收集細(xì)胞。按BD公司AnnexinⅤ-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書操作，冰預(yù)冷的PBS洗細(xì)胞兩遍后，每管加入200 μl稀釋后的1×Binding buffer及 AnnexinⅤ-FITC、碘化丙啶(PI)各5 μl，混勻后室溫避光孵育 15 min。300 ×g離心 5 min，棄上清，用 500 μl冰預(yù)冷的 Binding Buffer重懸細(xì)胞，輕輕混勻后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。

1.2.3ROS檢測取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，稀釋接種于6孔板中培養(yǎng)(每孔3×105細(xì)胞)，對照組(細(xì)胞未經(jīng)藥物處理)和實驗組(藥物處理不同時間或不同劑量)后，用終濃度10 μmol·L－1DCFH-DA染料避光孵育30 min，收集細(xì)胞，冰預(yù)冷的PBS洗滌兩次后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)的ROS水平。

1.2.4激光共聚焦實驗分別收集對照組和實驗組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×108·L－1，取干凈的載玻片，于甩片機(jī)中甩片30 s，觀察甩片后細(xì)胞形態(tài)正常后于濕盒中放置過夜。取前1 d已晾干的載玻片，在細(xì)胞團(tuán)塊上滴加20 μl固定液固定13 min，后用PBS用洗兩遍，加入終濃度1 mg·L－1的DAPI染色5 min，PBS洗滌后可于共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.5Western bolt檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)變化取處于對數(shù)生長期的K562及K562/A02細(xì)胞，稀釋接種于6孔板中培養(yǎng)，其中實驗組分別進(jìn)行如下處理:2 μmol·L－1PHⅡ-7 孵育 24 h;5 mmol·L－1NAC 孵育24 h 或5 mmol·L－1NAC 與2 μmol·L－1PHⅡ-7共孵育24 h，分別收集對照組和處理組細(xì)胞，RIPA裂解后蛋白定量并用于Western blot檢測。首先進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白樣品轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素(NC)膜，封閉后分別孵育PARP-1抗體(1 ∶1 000)、caspase-3、caspase-9抗體(稀釋比例均為1∶1 000)及GAPDH抗體(1∶2 000)室溫孵育2 h，再與二抗室溫孵育1 h，化學(xué)發(fā)光法發(fā)光曝片。

1.2.6統(tǒng)計學(xué)處理所有數(shù)據(jù)均以±s表示，結(jié)果重復(fù)3次，顯著性檢驗采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1PHⅡ-7對K562和K562/A02細(xì)胞增殖的影響K562/A02是本室建立的對多種化療藥具有交叉耐受性的腫瘤細(xì)胞株，經(jīng)檢測，它對阿霉素的IC50為其親代細(xì)胞K562的約100倍［7］。本研究中測定了K562和K562/A02對PHⅡ-7的敏感性，WST-8試驗表明，PHⅡ-7對K562和K565/A02的細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用，呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性，其IC50值分別為(2.78±0.31)和(1.97 ±0.38)μmol·L－1(Fig 2)。

Fig 2 Effect of PHⅡ-7 on K562 and K562/A02 cell’s proliferation

2.2PHⅡ-7作用后細(xì)胞內(nèi)ROS水平的變化2 μmol·L－1PHⅡ-7分別作用K562和K562/A02細(xì)胞0、0.5、1、2、3、4、6、8、9.5、11、24 h 后，流式細(xì)胞儀測定ROS水平發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)的ROS水平發(fā)生了明顯變化(Fig 3A):在處理2 h后明顯升高，處理11 h后升高至峰值(Fig 3B)，上述結(jié)果說明PHⅡ-7處理后確實會促使細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高。

Fig 3 ROS production generated by PHⅡ-7

2.3PHⅡ-7誘導(dǎo)K562、K562/A02細(xì)胞凋亡及與ROS的關(guān)系PHⅡ-7處理 K562、K562/A02細(xì)胞后，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示，PHⅡ-7可以誘導(dǎo)上述兩種細(xì)胞凋亡，并且呈劑量時間及劑量關(guān)系(Fig 4A，B);加入 5 mmol·L－1的 NAC 與藥物共孵育后，完全抑制了PHⅡ-7引起的細(xì)胞凋亡(Fig 3B)。同時，加入不同濃度的 NAC(0、0.625、1.25、2.5 和 5 mmol·L－1)與 2 μmol·L－1的 PHⅡ-7 共孵育，24 h后測定細(xì)胞存活率。結(jié)果顯示，NAC與PHⅡ-7共孵育可以抑制PHⅡ-7引起的細(xì)胞凋亡，且隨NAC濃度的增加，細(xì)胞的生存率逐漸提高，且單用NAC對細(xì)胞的生存率沒有明顯影響(Fig 4C)。

2.4抗氧化劑NAC可以抑制PHⅡ-7作用引起的細(xì)胞殺傷效應(yīng)2 μmol·L－1PHⅡ-7作用 K562、K562/A02細(xì)胞后，用1 mg·L－1的 DAPI進(jìn)行細(xì)胞核染色，激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，與對照相比，細(xì)胞核形態(tài)發(fā)生明顯改變，出現(xiàn)凋亡小體;在PHⅡ-7與5 mmol·L-1NAC共孵育組，未見明顯的細(xì)胞核形態(tài)改變及凋亡小體的出現(xiàn)(Fig 5A)。進(jìn)一步說明PHⅡ-7可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而與NAC聯(lián)用之后，PHⅡ-7引起的細(xì)胞凋亡作用被抑制。Western blot分析顯示，PHⅡ-7可以引起凋亡信號通路分子PARP-1及caspase-3、caspase-9的切割，提示細(xì)胞內(nèi)凋亡信號系統(tǒng)已經(jīng)激活。與NAC聯(lián)用之后，PHⅡ-7引起的上述蛋白質(zhì)變化消失，而單用NAC對上述細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白無影響(Fig 5B)，提示抗氧化劑NAC可以抑制PHⅡ-7作用引起的細(xì)胞凋亡，從而進(jìn)一步說明PHⅡ-7引起的細(xì)胞凋亡作用與ROS的升高有極大的關(guān)聯(lián)性。

3 討論

CML是由于多潛能干細(xì)胞的異常增殖引起的疾病。盡管酪氨酸激酶抑制劑及一些化療藥物的使用已經(jīng)極大的提高了CML病人的存活率，仍然有許多病人在治療一段時間后產(chǎn)生了對上述化療藥的耐藥性(MDR)。MDR是導(dǎo)致臨床上化療失敗的主要原因之一。引起多藥耐藥的原因有很多，其中最為人們熟知的是細(xì)胞膜表面 P-糖蛋白的高表達(dá)［8］。P-糖蛋白(MDR1)是mdr1基因的編碼產(chǎn)物，其是一種依賴ATP供能的跨膜外排泵。P-糖蛋白高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞會通過其的外排功能減少細(xì)胞內(nèi)的藥物蓄積，從而表現(xiàn)為對常規(guī)化療劑量無效。目前，尋找有效的MDR調(diào)節(jié)劑(或稱抑制劑，逆轉(zhuǎn)劑)，將之與其他化療藥物聯(lián)用是臨床治療中一個很有希望的治療策略。PHⅡ-7是我們實驗室在前期的工作中從靛玉紅衍生物中篩選得到的有較好抗腫瘤活性和較低毒性的化合物，我們發(fā)現(xiàn)，其對許多組織來源不同的腫瘤細(xì)胞均有抑制作用，是一個很有希望的抗腫瘤藥物［9－10］。此外，我們還發(fā)現(xiàn)其對許多耐藥腫瘤細(xì)胞有效［3，9］，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)其可以通過下調(diào) c-fos基因進(jìn)而降低膜表面MDR1的表達(dá)［11］。然而，其對腫瘤細(xì)胞的殺傷機(jī)制仍然未明，尤其是其對耐藥與相應(yīng)的親代敏感細(xì)胞殺傷機(jī)制是否有異同仍然是個問號，因此，探尋PHⅡ-7在敏感和耐藥的腫瘤細(xì)胞中的具體殺傷機(jī)制具有重要意義。

ROS根據(jù)其分子類型的不同可分為離子型和非離子型，它們均因分子內(nèi)含有未配對的電子而具有較高的反應(yīng)性。細(xì)胞內(nèi)ROS水平的變化可以引起許多下游基因的變化，如NF-κB和AP-1是已經(jīng)證實能被 ROS 調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子［5－6，12］。多年來的研究表明，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中，細(xì)胞內(nèi)的氧化還原系統(tǒng)往往發(fā)生異常，造成腫瘤細(xì)胞內(nèi)ROS水平的升高。升高的ROS水平一方面有利于腫瘤細(xì)胞獲得更多的基因突變，另一方面使得腫瘤細(xì)胞對進(jìn)一步升高的ROS水平較正常細(xì)胞更為敏感［12－13］。一旦細(xì)胞內(nèi)的氧化—還原平衡被破壞至細(xì)胞不能承受的程度，細(xì)胞將會走向死亡。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)外界刺激后，細(xì)胞內(nèi)ROS水平的升高可以下調(diào)bcl-2的水平，進(jìn)而下降線粒體膜電位，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［14］。許多化療藥也被發(fā)現(xiàn)具有升高細(xì)胞內(nèi) ROS的作用，并與其誘導(dǎo)凋亡的作用相關(guān)［5，15］。本研究中發(fā)現(xiàn)，PHⅡ-7 對 K562/A02 及其親代K562細(xì)胞有相當(dāng)?shù)募?xì)胞增殖抑制作用，呈劑量依賴關(guān)系。PHⅡ-7處理細(xì)胞之后能引起細(xì)胞內(nèi)明顯的ROS的升高，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。與抗氧化劑NAC共孵育之后，可以極大的抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生，提高細(xì)胞的存活率。故我們認(rèn)為PHⅡ-7很可能是通過升高細(xì)胞內(nèi)的ROS水平引起了腫瘤細(xì)胞的死亡。

Fig 4 Apoptosis induced by PHⅡ-7 in K562 and K562/A02，and the effect eliminated by NAC

Fig 5 Effect of NAC on the apoptotic effect of PHⅡ-7 on K562 and K562/A02 cell lines

綜上所述，PHⅡ-7可能通過升高腫瘤細(xì)胞內(nèi)的ROS水平達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。更讓人興奮的是，它對耐藥的腫瘤細(xì)胞K562/A02同樣有效，雖然我們已經(jīng)證實其與PHⅡ-7下調(diào)P-gp和升高它的ROS水平有關(guān)，但ROS水平的升高與P-gp調(diào)控之間的關(guān)系以及對細(xì)胞內(nèi)糖代謝水平的影響仍然未知。下一步我們將就以上兩個方面進(jìn)行深入研究，為PHⅡ-7的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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