孫黔云，李 敏，葉巧玲，李紅玲

(1.貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2.貴州省人民醫(yī)院呼吸疾病研究所，貴州貴陽 550002)

補(bǔ)體是免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在機(jī)體天然防御、免疫調(diào)控中發(fā)揮重要作用［1－2］。但補(bǔ)體的過度激活會(huì)引發(fā)炎癥和組織損傷［2－4］，尤其是補(bǔ)體替代途徑的過度激活在一系列疾病和病征的發(fā)生發(fā)展中扮演了重要角色［5－6］。而補(bǔ)體引發(fā)炎癥和組織損傷的關(guān)鍵在于其激活后對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞所產(chǎn)生的作用。以往報(bào)道的補(bǔ)體作用內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)研究多為關(guān)注單一補(bǔ)體活化成分影響臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的作用，而對(duì)病理生理?xiàng)l件下補(bǔ)體激活產(chǎn)物作用和影響微血管內(nèi)皮細(xì)胞的研究報(bào)道極少。為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)和理解補(bǔ)體過度激活對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響及在相關(guān)病理中的作用，為相關(guān)新藥的篩選和評(píng)價(jià)提供參考依據(jù)以及合適的細(xì)胞模型，本文報(bào)道了補(bǔ)體替代途徑的激活對(duì)人微血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的活化和損傷作用。

1 材料與方法

1.1材料人微血管內(nèi)皮細(xì)胞株HMEC由本實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)，DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基和胎牛血清為美國Hyclone公司產(chǎn)品;人 P-selectin、E-selectin、ICAM-1、MCP-1、IL-8測定ELISA試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司;乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所;一氧化氮(nitric oxide，NO)檢測試劑盒為江蘇碧云天生物技術(shù)研究所產(chǎn)品;caspase-8螢光檢測試劑盒為美國Promega公司產(chǎn)品;健康人混合血清(normal human serum，NHS)由本實(shí)驗(yàn)室健康志愿者獻(xiàn)血制備，分裝保存于－80℃，經(jīng)補(bǔ)體活性檢測后備用;滅活人血清(inactivated normal human serum，INHS)采用標(biāo)準(zhǔn)方法制備;眼鏡蛇毒因子(cobra venom factor，CVF)的制備和活力單位測定同已發(fā)表文獻(xiàn)［7］。其它試劑均為符合實(shí)驗(yàn)要求的國產(chǎn)或進(jìn)口試劑。

1.2主要儀器設(shè)備Forma 3111 CO2培養(yǎng)箱和Revco超低溫冰箱(美國Thermo公司);Nikon TS100倒置相差顯微鏡(日本Nikon公司);GloMax化學(xué)發(fā)光檢測儀(美國Promega公司);Bio-Rad 550酶標(biāo)儀(美國 Bio-Rad公司)。5810R冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf公司);Elix純水系統(tǒng)和Milli Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)。

1.3方法

1.3.1補(bǔ)體激活物的制備將NHS與CVF(6.5×104U·L－1)等體積混合，37℃水浴孵育 30 min，將孵育物(CVF-activated complement，以下簡稱CAC)分裝，凍存于 －80℃?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)中采用 INHS與CVF的孵育混合物作為CAC的對(duì)照。

1.3.2補(bǔ)體激活誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)P-selectin的作用

1.3.2.1量效作用測定 將HMEC細(xì)胞以4.5×103cells·well－1接種于 96 孔板，培養(yǎng) 24 h，棄培養(yǎng)液，加入含體積分?jǐn)?shù)分別為5%、10%、20%、30%、40%CAC 的無血清DMEM 培養(yǎng)基200 μl，37℃ 培養(yǎng)20 min，取培養(yǎng)上清，2 000 r·min－1離心 10 min，取上清液，按試劑盒推薦步驟進(jìn)行P-selectin測定。

1.3.2.2時(shí)效作用測定 將HMEC細(xì)胞以4.5×103cells·well－1接種于 96 孔板，培養(yǎng) 24 h，棄培養(yǎng)液，加入含30%CAC的無血清DMEM培養(yǎng)基200 μl，37℃分別培養(yǎng) 5、10、20、30、60 min，取培養(yǎng)上清，2 000 r·min－1離心 10 min，取上清液，測定 P-selectin。

1.3.3補(bǔ)體激活對(duì)HMEC表達(dá)E-selectin、ICAM-1、MCP-1和IL-8的影響將HMEC細(xì)胞以4.5×103cells·well－1接種于 96 孔板，培養(yǎng) 24 h，棄培養(yǎng)液，加入含30%CAC的無血清DMEM培養(yǎng)基200 μl，37℃培養(yǎng)不同時(shí)間，取培養(yǎng)上清，按試劑盒推薦步驟進(jìn)行E-selectin、ICAM-1、MCP-1和IL-8測定。

1.3.4補(bǔ)體激活對(duì)HMEC的損傷情況將HMEC細(xì)胞以4.5×103cells·well－1接種于96孔板，培養(yǎng)24 h，棄培養(yǎng)液，加入含30%CAC的無血清DMEM培養(yǎng)基200 μl，各組別分別培養(yǎng)不同時(shí)間，按試劑盒推薦步驟分別檢測細(xì)胞釋放LDH、NO和caspase-8活化的情況，并采用MTT法測定細(xì)胞增殖活性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示。采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1補(bǔ)體激活誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)P-selectin補(bǔ)體激活產(chǎn)物能刺激內(nèi)皮細(xì)胞瞬時(shí)釋放P-selectin。在血清體積分?jǐn)?shù)為15%、作用時(shí)間為20 min時(shí)，這種釋放作用達(dá)到最大(Fig 1)。

Fig 1 P-selectin expressed by endothelial cells after exposure to activated complement(n=3)

2.2補(bǔ)體激活誘導(dǎo)HMEC表達(dá)E-selectin、ICAM-1、MCP-1和IL-8的作用補(bǔ)體激活產(chǎn)物能刺激內(nèi)皮細(xì)胞上調(diào)表達(dá) E-selectin、ICAM-1、MCP-1和IL-8(Fig 2)。

2.3補(bǔ)體激活對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷作用補(bǔ)體旁路激活能導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞釋放LDH增加(Fig 3)，凋亡信號(hào)caspase-8的活化出現(xiàn)上調(diào)，在6～12 h有明顯的增強(qiáng)(Fig 4)。同時(shí)，NO釋放下調(diào)(Fig 5)。經(jīng)激活的補(bǔ)體作用后，內(nèi)皮細(xì)胞的生長受到一定程度的抑制(Fig 6)。

Fig 2 Expression of proinflammatory molecules in endothelial cells after exposure to activated complement(n=3)

Fig 3 LDH released from endothelial cells after exposure to activated complement(n=4)

Fig 4 Activation of caspase-8 in endothelial cells after exposure to activated complement(n=4)

3 討論

補(bǔ)體的激活分為經(jīng)典、替代和凝集素途徑，而不同的活化途徑均有共同的活化末端路徑(C5-C9)。因此，獲得補(bǔ)體替代途徑激活所產(chǎn)生的所有特異性產(chǎn)物是本研究目標(biāo)達(dá)成的關(guān)鍵。為此，我們采用了CVF來激活血清補(bǔ)體。CVF是來源于眼鏡蛇毒的一種高度特異的補(bǔ)體替代途徑激活蛋白。在血清環(huán)境中，CVF與補(bǔ)體B因子特異結(jié)合，形成CVFB復(fù)合物，CVFB經(jīng)D因子的特異識(shí)別和酶切，形成替代途徑C3/C5轉(zhuǎn)化酶CVFBb，CVFBb可持續(xù)激活補(bǔ)體替代途徑。這種激活模式與病理生理?xiàng)l件下體內(nèi)補(bǔ)體替代途徑的過度激活高度一致，其產(chǎn)物對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用和影響可以很好地模擬體內(nèi)補(bǔ)體旁路過度激活對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的效應(yīng)。因此，這個(gè)組合的實(shí)驗(yàn)體系也為開展與補(bǔ)體相關(guān)的內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)及活性物質(zhì)篩選研究提供了一個(gè)合適的細(xì)胞模型。同時(shí)，通過該細(xì)胞模型的研究，也有助于認(rèn)識(shí)CVF高效激活補(bǔ)體導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷和炎癥的作用在眼鏡蛇蛇傷毒性機(jī)制中所扮演的角色。

Fig 5 Effect of complement activation on production of NO by endothelial cells(n=4)

Fig 6 Effect of complement activation on cell proliferation(n=3)

據(jù)此，本研究觀察了補(bǔ)體旁路激活對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的影響和作用。結(jié)果表明，補(bǔ)體旁路激活導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞瞬時(shí)釋放P-selectin，并上調(diào)表達(dá)黏附分子E-selectin、ICAM-1和趨化因子 MCP-1、IL-8，使內(nèi)皮細(xì)胞釋放LDH增加，caspase-8活化上調(diào)，NO表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞生長受到抑制。補(bǔ)體作為機(jī)體天然防御系統(tǒng)的重要一員，其正?？煽氐幕罨菍?shí)現(xiàn)免疫防御和調(diào)控作用的前提。但在諸多病理生理情況下，補(bǔ)體的活化會(huì)失控，從而引發(fā)炎癥和損傷。補(bǔ)體的激活，尤其是旁路激活，在一系列疾病和病理損傷中扮演了重要角色。而血管內(nèi)皮細(xì)胞無疑會(huì)成為補(bǔ)體激活后的重要靶標(biāo)。在本研究中可以看到，補(bǔ)體旁路激活后首先會(huì)導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)P-selectin，這種表達(dá)在數(shù)分鐘內(nèi)即有明顯的變化，在20 min時(shí)升至高峰。隨后數(shù)小時(shí)內(nèi)，內(nèi)皮細(xì)胞開始上調(diào)表達(dá)E-selectin、ICAM-1、MCP-1、IL-8 這類通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控表達(dá)的黏附分子和炎癥介質(zhì)。補(bǔ)體替代途徑的激活，會(huì)產(chǎn)生C3a、C3b、C5a以及攻膜復(fù)合物(membrane attack complex，MAC)等多種活化產(chǎn)物。C5a不僅能刺激臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞快速表達(dá)P-selectin，而且還能使多種黏附分子、細(xì)胞因子和趨化因子上調(diào)表達(dá)［8］。亞溶胞劑量的攻膜復(fù)合物 MAC能誘導(dǎo) E-selectin、ICAM-1、MCP-1、IL-8 的表達(dá)上調(diào)［9－10］，而沒有溶胞活性的iTCC(inactive terminal complement complex)也具有同樣的作用［11］。P-selectin、E-selectin、ICAM-1是順序介導(dǎo)中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞黏附及跨膜遷移的重要分子，MCP-1和IL-8則具有促進(jìn)中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞聚集和黏附的功能。本研究結(jié)果顯示，在受到補(bǔ)體旁路激活產(chǎn)物的刺激后，人微血管內(nèi)皮細(xì)胞順序出現(xiàn)了典型的內(nèi)皮細(xì)胞I型和II型活化［12］。血管內(nèi)皮細(xì)胞不僅構(gòu)成了血管平滑肌組織與血液間的物理性屏障，而且還是具有諸多重要生理調(diào)節(jié)活性的功能細(xì)胞。上述的活化刺激會(huì)導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)與功能的變化，而這種活化一旦持續(xù)，就會(huì)使內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)損傷和凋亡，從而破壞血管內(nèi)皮的完整性，引發(fā)后續(xù)的炎癥和損傷。

激活的補(bǔ)體旁路產(chǎn)物不僅刺激內(nèi)皮細(xì)胞活化，而且也對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生損傷。從本實(shí)驗(yàn)看到，內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)CAC作用后，LDH釋放增加，提示內(nèi)皮細(xì)胞膜出現(xiàn)損傷和泄漏。這可能是CAC與內(nèi)皮細(xì)胞接觸后在細(xì)胞膜上生成了少量具有溶胞活性的MAC所致。而caspase-8的活化上調(diào)，表明CAC對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的刺激和作用會(huì)導(dǎo)致一定程度的凋亡，使內(nèi)皮細(xì)胞的增殖受到一定程度抑制。同時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞分泌NO明顯減少。NO是體內(nèi)重要的信號(hào)分子，具有多種重要的生理或病理生理作用［13］。血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的紊亂，會(huì)導(dǎo)致NO的合成障礙［13］。以上結(jié)果提示，補(bǔ)體旁路激活會(huì)影響和損傷內(nèi)皮細(xì)胞的正常功能，進(jìn)而產(chǎn)生相關(guān)的病理生理效應(yīng)。而在相關(guān)疾病和病理損傷中，采用合適有效的補(bǔ)體抑制劑阻斷補(bǔ)體相關(guān)激活產(chǎn)物的形成，從而抑制或減輕內(nèi)皮細(xì)胞的活化和損傷，則成為干預(yù)和治療的關(guān)鍵。因此，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果有助于進(jìn)一步加深對(duì)補(bǔ)體激活引發(fā)炎癥和損傷效應(yīng)的認(rèn)識(shí)和理解，為補(bǔ)體相關(guān)疾病及病理損傷的機(jī)制和干預(yù)治療新策略以及相關(guān)新藥的研究提供有益的參考和依據(jù)。

［1］Dunkelberger J R，Song W C.Complement and its role in innate and adaptive immune responses［J］.Cell Res，2010，20(1):34－50.

［2］Sarma J V，Ward P A.The complement system［J］.Cell Tissue Res，2011，343(1):227 －35.

［3］Wagner E，F(xiàn)rank M M.Therapeutic potential of complement modulation［J］.Nat Rev Drug Discov，2010，9(1):43 － 56.

［4］Ricklin D，Hajishengallis G，Yang K，Lambris J D.Complement:a key system for immune surveillance and homeostasis［J］.Nat Immunol，2010，11(9):785 －97.

［5］Thurman J M，Holers V M.The central role of the alternative complement pathway in human disease［J］.J Immunol，2006，176(3):1305－10.

［6］Holers V M.The spectrum of complement alternative pathway-mediated diseases［J］.Immunol Rev，2008，223(1):300 －16.

［7］孫黔云，葉巧玲，閆銀萍.小鼠血清補(bǔ)體替代途徑溶血活性測定的新方法［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2011，27(11):1619 －22.

［7］Sun Q Y，Ye Q L，Yan Y P.A new method for measurement of the alternative pathway activity of mouse serum complement［J］.Chin Pharma Bull，2011，27(11):1619 －22.

［8］Albrecht E A，Chinnaiyan A M，Varambally S，et al.C5a-induced gene expression in human umbilical vein endothelial cells［J］.Am J Pathol，2004，164(3):849 －59.

［9］Kilgore K S，Shen J P，Miller B F，et al.Enhancement by the complement membrane attack complex of tumor necrosis factor-alpha-induced endothelial cell expression of E-selectin and ICAM-1［J］.J Immunol，1995，155(3):1434 －41.

［10］Kilgore K S，F(xiàn)lory C M，Miller B F，et al.The membrane attack complex of complement induces interleukin-8 and monocyte chemoattractant protein-1 secretion from human umbilical vein endothelial cells［J］.Am J Pathol，1996，149(3):953 －61.

［11］Bossi F，Bulla R，Tedesco F.Endothelial cells are a target of both complement and kinin system［J］.Int Immunopharmacol，2008，8(2):143－7.

［12］Zhang J，Defelice A F，Hanig J P，Colatsky T.Biomarkers of endothelial cell activation serve as potential surrogate markers for drug-induced vascular injury［J］.Toxicol Pathol，2010，38(6):856－71.

［13］Gkaliagkousi E，F(xiàn)erro A.Nitric oxide signalling in the regulation of cardiovascular and platelet function［J］.Front Biosci，2011，16:1873－97.