宋石磊 王莉 趙勇 張萬琴

癲癇是常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一。目前對于癲癇的研究主要還是采用動物模型，其中海仁酸(KA)所致的癲癇模型已廣泛用于癲癇發(fā)作的研究，被認(rèn)為是經(jīng)典的癲癇動物模型［1］。長期以來對于癲癇所致學(xué)習(xí)記憶障礙的研究主要集中在海馬腦區(qū)，并且肯定了海馬腦區(qū)與癲癇學(xué)習(xí)記憶障礙的相關(guān)性，但是對于扣帶會在這方面的研究甚少。本研究通過對難治性癲癇大鼠腦內(nèi)扣帶回腦區(qū)C-Jun免疫反應(yīng)性變化的觀察，初步探討扣帶回與難治性癲癇空間學(xué)習(xí)記憶障礙的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 制備及分組 KA誘發(fā)癲癇急性發(fā)作及癲癇持續(xù)狀態(tài)取20只大鼠，一次頸部皮下注射驚厥劑量(10 mg/kg，2 ml/kg)的KA誘發(fā)SD大鼠出現(xiàn)癲癇急性發(fā)作及癲癇持續(xù)狀態(tài)。癲癇的嚴(yán)重程度按Racine［2］描述的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行1～5級分級，在本實驗中有12只大鼠有4級以上發(fā)作并呈持續(xù)狀態(tài)，其中有5只死亡，7只存活大鼠被采用為癲癇模型即模型組。剩余未達(dá)到四級以上發(fā)作的10只大鼠有4只死亡，6只存活大鼠作為模型對照組，另取同批SD大鼠(n=6)頸部皮下注射等容積(2.0 ml/kg)的生理鹽水即為空白對照組。

1.2 Morris水迷宮行為學(xué)測定 SD大鼠在分組完成后30 d采用Morris水迷宮通過隱藏平臺獲得實驗及空間搜索實驗對大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力進(jìn)行測定。

1.3 灌流固定

1.3.1 4%水合氯醛400 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，開胸暴露心臟。

1.3.2 16 g注射針頭刺入左室尖部，止血鉗固定，剪開左心耳，先后以0.9%氯化鈉注射液200 ml和4%多聚甲醛400 ml先快速后緩慢進(jìn)行灌注，至肝臟、四肢及頭尾變硬。

1.3.3 斷頭取腦，于4℃4%多聚甲醛中后固定。

1.4 腦片制備及免疫組織化學(xué)實驗 將固定好的鼠腦放入含30%蔗糖的磷酸緩沖液中4℃過夜，振動切片機切取50 μm厚的冠狀腦片，PBS漂洗10 min×2，與1%BSA孵育30 min;加入第一抗體(C-jun-Ab，1∶500)4℃孵育過夜，PBS漂洗10 min×2;加入生物素化羊抗兔(1∶400)室溫振蕩孵育1 h，PBS漂洗10 min 2;與卵白素生物素復(fù)合物A:B:PBS(1∶1∶400)室溫振蕩孵育2 h，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)法顯色;適時用0.01 m PBS終止反應(yīng);明膠裱片，風(fēng)干;梯度酒精脫水:70%、80%、90%、95%、100%、100%酒精各脫水 5 min;二甲苯透明，中性樹膠封片、晾干。

1.5 圖像分析 采用HPIAS系列彩色病理圖文分析系統(tǒng)對C-Jun免疫陽性細(xì)胞進(jìn)行定量計數(shù)，采用Olympus-BX51型顯微攝像系統(tǒng)對目標(biāo)腦區(qū)進(jìn)行攝像。分析方法:選取扣帶回為目標(biāo)腦區(qū)，分別在扣帶回5個不同層面分別選取4個寬度 和高度分別為213、289 μm的計數(shù)區(qū)，在顯微鏡下進(jìn)行觀察，計數(shù)C-Jun陽性細(xì)胞數(shù)目，取其平均值。并分別攝片。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 實驗采用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計處理。免疫組化數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，各組腦片之間的免疫活性差異采用單因素方差分析;不同處理組間的兩兩比較采用單因素方差分析S-N-K法;檢驗標(biāo)準(zhǔn)為P＜0.05。

2 實驗結(jié)果

2.1 Morris水迷宮行為學(xué)測定結(jié)果

2.1.1 隱匿平臺獲得實驗 模型組大鼠的尋找潛伏期在各個時間段都明顯長于其它2組大鼠。并且其在學(xué)習(xí)測試的4 d中每天的尋找潛伏期沒有明顯差異(P＞0.05)。模型對照組與空白對照組的尋找潛伏期在各個時間段差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

2.1.2 空間探索試驗 模型組大鼠穿越平臺的次數(shù)平均為0.71，而其它2組分別為2.33次、3.29次，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，模型對照組與空白對照組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

2.2 免疫組織化學(xué)結(jié)果 在C-jun的免疫組化結(jié)果中，模型組大鼠扣帶回腦區(qū)C-Jun免疫陽性細(xì)胞數(shù)目較空白對照組組和模型對照組大鼠明顯降低，有顯著差異(P＜0.05)。而模型對照組扣帶回腦區(qū)C-Jun免疫陽性細(xì)胞數(shù)目與空白對照組相比則無明顯差異(P＞0.05)。(圖1、表1)。

圖1 A模型組B模型對照組C空白對照組(200)

表1 各組大鼠扣帶回腦區(qū)C-Jun陽性細(xì)胞數(shù)目

3 討論

C-Jun是一種即刻早期基因(IEGs)，它的表達(dá)受控于突觸的活動，有研究指出其在突觸地可塑性機制(LTP)中發(fā)揮重要的作用，而LTP是目前公認(rèn)的記憶形成基礎(chǔ)［3］。在經(jīng)過記憶訓(xùn)練的大鼠腦內(nèi)可以觀察到C-Jun蛋白表達(dá)的升高［4］，這些研究表明了C-Jun參與了學(xué)習(xí)記憶的形成過程。通過抑制C-Jun氨基末端激酶(JNKs)造成C-Jun mRNA和蛋白質(zhì)合成的損傷，可以改善短時程記憶而阻斷長時程記憶［5］，也說明了C-Jun與學(xué)習(xí)記憶的相關(guān)性。

現(xiàn)在共識的記憶形成的分子機制假說是:刺激發(fā)動長時程記憶的相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)而啟動分子級聯(lián)反應(yīng)，級聯(lián)反應(yīng)又可以調(diào)控IEGs的表達(dá)，最終達(dá)到記憶相關(guān)區(qū)域持久的結(jié)構(gòu)和功能的改變［6］。在這個過程中隨著各種類型的細(xì)胞興奮，C-Jun會被誘導(dǎo)并表達(dá)，C-Jun的免疫反應(yīng)活性可作為神經(jīng)元興奮的標(biāo)志［7］。在大鼠學(xué)習(xí)過程中，學(xué)習(xí)記憶相關(guān)腦區(qū)如果C-Jun表達(dá)降低，就很有可能是該腦區(qū)的學(xué)習(xí)記憶機制受到了損害。

本實驗中通過免疫組化實驗對各組大鼠的扣帶回腦區(qū)進(jìn)行的觀察發(fā)現(xiàn)實驗組大鼠扣帶回腦區(qū)內(nèi)C-Jun有著相對較低的表達(dá)，與此相應(yīng)的是在行為學(xué)實驗中，模型組的學(xué)習(xí)記憶能力與空白組和實驗對照組相比明顯降低，而模型對照組與空白組相比學(xué)習(xí)記憶能力無明顯差異。結(jié)合以上對C-Jun在學(xué)習(xí)記憶形成過程中作用的探討，有理由認(rèn)為實驗組大鼠扣帶回腦區(qū)內(nèi)的學(xué)習(xí)記憶機制發(fā)生了損害。所以癲癇大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改變很可能與扣帶回腦區(qū)學(xué)習(xí)記憶機制損害相關(guān)。

［1］Sperk G.Kainic acid seizures in therat.Prog Neurobiol，1994，42:1.

［2］Racine RJ.Modification of seizure activity by electrical stimulation.Ⅱ.Motor seizure.Electroencephalogr Clin Neurophysiol，1972，32:281.

［3］Herdegen T，Skene P，Bahr M.The c-Jun transcription factorbipotentialmediator of neuronal death，survival and regeneration.Trends Neurosci，1997，20:227-231.

［4］Lisa A，Teather，Mark G，Packard，et al.Differential induction of c-Jun and Fos-like proteins in rat hippocampus and dorsal striatum after training in two water maze tasks.Neurobiology of Learning and Memory，2005，84(2):75-84.

［5］Bevilaqua LR，Kerr DS，Medina JH，et al.Inhibition of hippocampal Jun N-terminal kinase enhances short-term memory but blocks long-term memory formation and retrieval of an inhibitory avoidance task.Eur J Neurosci，2003，17，897-902.

［6］P Goelet VF，Castelucci S，Schaecher，et al.The long and the short of long-term memory-a molecular framework.Nature，1986，322:419-422.

［7］J I Morgan，T Curran.Stimulus-transcription coupling in the nervous system:Involvement of the inducible proto-oncogenes fos and jun.Annual Review of Neuroscience，1991，14:42-451.