李紅艷 農林玲 李麗婭 胡春萍 龐勇軍

類胡蘿卜素是一類天然的脂溶性色素，廣泛存在于自然界之中。其屬于萜烯類，所有類胡蘿卜素都是由一條共軛雙鍵的核心碳鏈，加上各自不同的末梢基團構成［1，2］。目前為止，自然界中已經確認的類胡蘿卜素至少有750多種［3］，其中常見于食物中的有50～60種，如β-胡蘿卜素、番茄紅素、葉黃素、玉米黃質、隱黃質等。流行病學調查顯示，蔬菜水果的攝入量與心血管疾病、眼科疾病、胃腸道疾病、神經退行性變以及部分癌癥的發(fā)生，呈負相關［4］。這一作用可能和蔬菜水果中富含的類胡蘿卜素和其他植物營養(yǎng)素有關。蝦青素為一種非維生素A原、廣泛存在于海產甲殼類動物和魚類中的天然類胡蘿卜素。動物實驗表明它有抑制腫瘤發(fā)生、增強免疫功能等多方面的生理作用［2，5，6］。本研究通過天然蝦青素對高脂鵪鶉模型體內脂代謝的調節(jié)及對由高脂誘發(fā)的血管和肝臟脂質過氧化損傷的影響及其相關機制，探討其最佳作用劑量標準，為其用于臨床相關疾病的防治提供理論依據和參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料 5%天然蝦青素粉劑(來源于雨生紅球藻)，購于陜西森弗生物技術有限公司。膽固醇(食品級)，購于安徽科寶生物工程有限公司。高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)測定試劑盒，由上海榮盛生物技術有限公司生產。超氧化物岐化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、還原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)測定試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。凱西萊(tioproin)，河南新誼藥業(yè)股份有限公司生產。辛伐他汀片(simvastatin)，杭州默沙東制藥有限公司生產。羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)，上海三浦化工有限公司產品。其他試劑為國產分析純。

1.2 動物分組及處理 雄性鵪鶉50只，5～6周齡，體重100～120 g，由桂林醫(yī)學院實驗動物中心［動物許可證號:scxk(桂)2007-0001］提供。每籠5只，動物房通風良好，光照12 h，濕度50%～60%，每天上、下午自動排風，自由飲食、飲水。鵪鶉隨機分為5組，對照組、高脂模型組、凱西萊與辛伐他汀聯用組(凱-辛聯用組)、蝦青素低劑量組、蝦青素高劑量組，每組10只。對照組喂飼基礎飼料;高脂模型組、凱-辛聯用組、蝦青素低、高2劑量組給予高脂飼料(1%膽固醇+14%豬油+6%花生油+79%基礎飼料)喂飼;高脂飼料喂養(yǎng)同時每天上午分別灌胃給予相應的藥物，蝦青素試驗前，先用蔗糖脂肪酸酯乳化，再溶于水配制成蝦青素乳化液;凱西萊及辛伐他汀用0.5%CMC-Na配置成混懸液;蝦青素低、高2劑量組分別按5、10mg/kg標準灌胃;凱-辛聯用組按10mg/kg凱西萊、1mg/kg辛伐他汀劑量標準灌胃;高脂模型組及對照組灌等體積蔗糖脂肪酸酯溶液。鵪鶉分籠飼養(yǎng)，自由飲水，實驗共7周。

1.3 血液及組織相關指標生物化學分析 5組鵪鶉均于實驗開始前及結束時獲取血液標本。禁食12 h頸靜脈取血4℃下放置1 h，3500 r/min離心15min，取血清按試劑盒方法測定總TC、TG、HDL-C、LDL-C、GSH-Px、SOD、iNOS 活性和 MDA 含量 。實驗結束后處死動物，留取肝臟作組織勻漿，測定各組動物肝組織勻漿中SOD、GSH-Px、iNOS活性、MDA及GSH的含量;同時取肝臟左葉部分(100mg)加抽提液(氯仿∶甲醇=1∶1)2ml勻漿，4℃下放置 12 h，3500 r/min，15min，取上清液，按上法測定肝中 TC、TG。

1.4 病理形態(tài)學觀察 將主動脈用10%甲醛固定，脫水石蠟包埋切片，HE染色，做病理切片檢查。

1.5 統(tǒng)計學分析應用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，2組比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 蝦青素對血脂及肝脂含量的影響 建模前5組血脂含量均無明顯差異(P ＞0.05);建模后鵪鶉血清中TG、TC、LDL-C和HDL-C含量較對照組顯著升高(P ＜0.05或 ＜0.01)，肝臟中TG和TC含量也較對照組顯著升高(P＜0.01)。蝦青素或凱西萊與辛伐他汀聯用干預后，鵪鶉血清中TG、TC、LDL-C及肝臟中TG和TC含量均較高脂模型組下降(P＜0.05或＜0.01)，而血清中 HDL-C含量均較高脂模型組升高(P＜0.01);低、高兩劑量蝦青素分別與凱-辛聯用組干預效果比較，低濃度的蝦青素干預效果弱于凱-辛聯用組(P＜0.05或＜0.01)，高劑量作用效果更為明顯。見表1。

表1 5組血脂和肝脂含量比較 n=10，mmol/L，

表1 5組血脂和肝脂含量比較 n=10，mmol/L，

注:與對照組比較，*P ＜0.05，#P ＜0.01;與高脂模型組比較，△P ＜0.05，☆P ＜0.01;與凱-辛聯用組比較，▲P ＜0.05，★P ＜0.01

血脂肝脂組別TG TC對照組 1.08 ±0.46 4.71 ±0.96 1.82 ±0.26 4.23 ±1.08 0.8 TG TC LDL-C HDL-C 2 ±0.38 0.25 ±0.14高脂模型組 6.76 ±0.66# 98.61 ±1.13# 7.34 ±1.32# 5.31 ±0.41* 2.20 ±0.99# 2.69 ±0.32#凱-辛聯用組 2.83 ±0.12＊☆ 52.94 ±2.79#☆ 4.66 ±1.98#☆ 9.78 ±1.75＊☆ 1.01 ±0.33#☆ 0.62 ±0.51#☆蝦青素低劑量組 3.31±0.39＊☆★ 75.62±4.88#☆★ 6.17±0.59#△▲ 8.69±1.42＊☆ 1.46±0.21#△★ 2.35±0.13#△★蝦青素高劑量組 3.03±0.55＊☆ 54.79±3.36#☆ 5.58±1.40#△ 10.14±0.13＊☆ 1.13±0.58#△ 0.80±0.43#☆

2.2 蝦青素對血清SOD、GSH-Px、iNOS活性及MDA含量的影響 高脂喂食后，鵪鶉血清 SOD、GSH-Px活性下降(P＜0.01)，而iNOS活性與 MDA 含量上升(P ＜0.01);蝦青素或凱西萊與辛伐他汀聯用干預后，血清SOD，GSH-Px活性有所上升(P ＜0.05或 ＜0.01)，iNOS活性與 MDA含量下降(P ＜0.01);低、高2劑量蝦青素分別與凱-辛聯用組干預效果比較，低濃度的蝦青素干預效果弱于凱-辛聯用組(P＜0.05或＜0.01)，高劑量作用效果更為理想。見表2。

表2 5組血清SOD、GSH-Px、iNOS活性及MDA含量比較 n=10，

表2 5組血清SOD、GSH-Px、iNOS活性及MDA含量比較 n=10，

注:與對照組比較，*P ＜0.01;與高脂模型組比較，#P ＜0.05，△P ＜0.01;與凱-辛聯用組比較，☆P ＜0.05，▲P ＜0.01

組別 SOD(U/ml) GSH-Px(U/ml) iNOS(U/ml) MDA(nmol/ml)93 ±16 756 ±13 15.2 ±2.7 12.4 ±1.8高脂模型組 22±7* 285±10* 237.0±1.6* 163.0±1.0*凱-辛聯用組 45±12△ 527±12△ 93.3±5.6△ 53.4±2.2△蝦青素低劑量組 32±9#☆ 449±9△▲ 126.5±3.9△▲ 83.3±3.6△▲蝦青素高劑量組 43±16△ 530±10△ 91.7±2.8△ 52.3±3.1對照組△

2.3 蝦青素對肝組織中SOD、GSH-Px、iNOS活性及MDA、GSH含量的影響 高脂喂食后，鵪鶉肝組織中SOD、GSH-Px活性及GSH含量顯著降低(P＜0.01)，而iNOS活性與MDA含量明顯上升(P＜0.01);蝦青素或凱西萊與辛伐他汀聯用干預后，肝組織中SOD，GSH-Px活性及 GSH含量上升(P ＜0.05或 ＜0.01)，iNOS活性與 MDA 含量下降(P ＜0.05 或 ＜0.01);低、高2劑量蝦青素分別與凱-辛聯用組干預效果比較顯示，低濃度的蝦青素干預效果弱于凱-辛聯用組(P ＜0.05或 ＜0.01)，高劑量作用效果更為理想。見表3。

表3 5組肝組織SOD、GSH-Px、iNOS活性及MDA、GSH含量比較 n=10，

表3 5組肝組織SOD、GSH-Px、iNOS活性及MDA、GSH含量比較 n=10，

注:與對照組比較，*P ＜0.01;與高脂模型組比較，#P ＜0.05，△P ＜0.01;與凱-辛聯用組比較，☆P ＜0.05，▲P ＜0.01

組別 SOD(U/mgpro) GSH-Px(U/mgpro) iNOS(U/mgpro) GSH(mg/gpro) MDA(nmol/mgpro)17.2 ±6.8 64 ±18 0.38 ±0.11 35 ±8 0.64 ±0.15高脂模型組 4.3±2.5* 16±6* 1.20±0.42* 19±5* 1.51±0.38*凱-辛聯用組 12.5±3.2△ 45±10△ 0.62±0.23△ 28±5△ 0.87±0.22△蝦青素低劑量組 7.3±2.8#▲ 25±10#▲ 0.88±0.14#☆ 22±6☆ 1.17±0.18#▲蝦青素高劑量組 13.6±5.6△ 43±14△ 0.56±0.39△ 27±8# 0.81±0.27對照組△

2.4 主動脈切片HE染色結果 對照組主動脈弓內膜完整無明顯變化。高脂模型組主動脈弓內膜見不同程度的斑塊隆起，斑塊中見大量的泡沫細胞。蝦青素低、高2劑量及凱-辛聯用組主動脈弓內膜斑塊形成均較高脂模型組有明顯的改善，且高劑量蝦青素改善效果更理想。見圖1。

圖1 鵪鶉主動脈內膜顯微鏡照片(HE×100)

3 討論

心腦血管疾病是嚴重威脅人類健康的疾病之一，有關病因及其防治措施一直受到人們的關注。動脈粥樣硬化(AS)的主要病變特征為動脈某些部位的內膜下脂質沉積，并伴有平滑肌細胞和纖維基質成分的增殖，逐步發(fā)展形成AS性斑塊。LDL-C在AS的發(fā)生發(fā)展中起著非常重要的作用，LDL促進AS的發(fā)生發(fā)展主要通過氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)的作用得以實現。研究表明，ox-LDL誘導血管平滑肌細胞(VSMC)的增生和凋亡［7］，VSMC位于血管中膜層，ox-LDL引起平滑肌細胞從血管中膜移行入內膜，并通過誘導巨噬細胞、血管內皮細胞及血小板細胞產生血小板源性生長因子(PDGF)和堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)，促進平滑肌增生，并分泌基質使血管內膜增厚［8－10］。內皮細胞對自由基和脂質過氧化作用非常敏感。LDL氧化過程中產生的過氧化脂質可以直接損傷內皮細胞。Ox-LDL可使內皮細胞對LDL的通透性增高，胞漿發(fā)生空泡變性，漿膜皺縮，甚至可使細胞最終壞死［11，12］。Ox-LDL 能促進細胞色素C從線粒體中釋放到細胞質中，損壞了線粒體膜，進而誘導內皮細胞的凋亡［13］。而高脂血癥可導致氧自由基及其他活性氧成分釋放增多，從而造成大量LDL被氧化，促進血管脂質過氧化損傷的進一步發(fā)展。血清中高密度脂蛋白(HDL)與心血管事件危險性呈負相關，被認為是一種保護性脂蛋白。HDL通過參與膽固醇的逆向轉運、拮抗LDL氧化、保護內皮功能等機制發(fā)揮其抗AS作用。在脂質代謝過程中，肝臟是重要的臟器，維持肝臟功能的正常，對脂質代謝，抑制過氧化損傷都有很重要的意義。本實驗用高脂飼料飼喂鵪鶉建立鵪鶉高脂血癥模型，與人類因膳食結構改變而形成的高脂血癥相似，對人類高脂血癥的研究具有指導意義。本研究結果顯示，蝦青素能有效降低血漿中TG、TC、LDL含量，顯著增加血漿中HDL含量;同時均能顯著降低肝中內源性TG、TC的合成量。以上結果表明，蝦青素具有較強的降脂功效，其對血脂和肝脂含量均有很好的調節(jié)作用。

機體內促氧化與抗氧化系統(tǒng)平衡的破壞，是導致各種自由基氧化損傷疾病產生的最重要的原因。動物體內自由基是機體氧化過程中釋放的一種活潑的有害物質，它在機體內肆意掠奪其他分子的電子，破壞重要生物大分子(如細胞酶、DNA、RNA、蛋白質等)的結構，使其喪失生理功能，從而導致細胞膜破壞、酶失去活性、基因受損、細胞變異，使體內重要組織臟器功能低下，導致各種疾病的發(fā)生。氧化應激過程中產生的超氧陰離子(O－2)、羥自由基(OH－)、過氧化氫(H2O2)直接充當細胞內信號分子或通過充當細胞膜或胞核受體的配體而調節(jié)多個類別的基因表達，包括黏附分子及化學趨化因子的表達增加，在As病變早期起著關鍵作用［14］。氧應激被認為是肝臟脂肪變發(fā)展為脂肪性肝炎的催化劑，氧應激與脂質過氧化損傷在脂肪肝的形成和發(fā)展過程中起重要作用，是脂肪肝受到第二次打擊進一步發(fā)展的重要因素。此外，高血脂時體內自由基產生和清除平衡被破壞，許多自由基清除劑(如SOD、CAT)活性降低，產生大量的脂質過氧化物(LPO)。因此，維持機體抗氧化系統(tǒng)的正常工作是防治自由基氧化損傷所致疾病的重要措施。SOD是一種廣泛存在于生物體內與細胞氧化代謝密切相關的蛋白質，是活性氧自由基的天然消除劑，是抗氧化酶系中最先與活性氧自由基結合的酶類。SOD能特異性結合體內超氧陰離子，且可與GSH-Px協(xié)同作用防止脂質過氧化及其代謝產物對機體的損害［15］，還可直接捕捉和清除超氧陰離子等自由基［16］，通過氫原子供體的作用阻斷或終止自由基連鎖反應鏈，從而阻止和抑制氧自由基反應和脂質過氧化反應的病理性加劇，起到抗氧化作用。GSH-Px能催化過氧化氫的還原反應，對由活性氧和羥自由基誘發(fā)的脂質過氧化物及過氧化氫有極強的清除能力，從而保護生物大分子和生物膜結構免受過氧化物損傷［17］。GSH是機體內一種重要的抗氧化小分子，其為一種三肽化合物;在GSH-Px的催化下，GSH可還原細胞內產生的過氧化物，與此同時，GSH被氧化成氧化型谷胱甘肽(GSSG);后者在谷胱甘肽還原酶(GR)催化下，再生成GSH。檢測體內GSH的含量可間接反映出GR活性的高低。一氧化氮(NO)是近年來逐漸明確的細胞信息分子，具有維持血管張力、調節(jié)血壓，抑制血管平滑肌細胞遷移、增生，抑制血小板聚集與白細胞對血管壁的黏附、調節(jié)影響心肌收縮與舒張功能的作用［18］。作為決定NO生成的酶，一氧化氮合酶(NOS)在體內廣泛分布，其中血管內皮細胞是最集中部位［19］。體內NOS存在3種異構體，根據其首次克隆時所在組織不同，分別命名為:內皮型NOS(eNOS)、神經型NOS(nNOS)、巨噬細胞誘導型NOS(iNOS)，其中eNOS和nNOS合稱為結構型NOS(cNOS)。研究認為，由cNOS催化產生的NO主要起生理信使作用，而由iNOS產生的NO主要參與免疫炎性反應和細胞毒作用。心血管疾病包括動脈粥樣硬化、心肌缺血、缺血再灌注損傷、充血性心衰等都與iNOS表達過量NO緊密相關［20］。在人動脈粥樣硬化主動脈的脂質條紋病變和粥樣硬化病變部位，iNOS在內皮細胞、平滑肌細胞及巨噬細胞中廣泛表達，蛋白修飾明顯增多并多存在于iNOS陽性部位。在動脈粥樣硬化的早期，斑點中就發(fā)現iNOS活化，由iNOS衍生的過量NO誘導的硝化應激又加重了動脈粥樣硬化［21］。有研究顯示由iNOS活性增加而致高濃度的NO產生，可抑制肝細胞蛋白質的合成、損傷DNA結構，直接抑制線粒體呼吸，使肝細胞內能量代謝障礙而引起肝細胞凋亡和壞死［21］;同時，高濃度NO與氧自由基反應生成超氧化亞硝基陰離子(ONOO－)，后者是蛋白和非蛋白巰基的強氧化劑，攻擊肝星狀細胞引發(fā)脂質過氧化連鎖反應。本實驗研究的天然蝦青素具有特殊的分子結構，體外實驗發(fā)現它是單線態(tài)氧的強淬滅劑;在雨生紅球藻活細胞內，它作為光保護劑和強抗氧化劑，能夠淬滅由強光和過度氧化產生的多種活性氧，防止活性氧對細胞的傷害。

本研究結果顯示，鵪鶉高脂狀態(tài)下血清和肝組織中SOD、GSH-Px活性均較對照組有明顯的下降，iNOS活性均顯著高于對照組;而蝦青素能顯著增強此兩種抗氧化酶的活性，并且強烈抑制iNOS活性，從而有效緩解由高脂誘發(fā)的機體脂質過氧化損傷的程度。本研究通過鵪鶉高脂動物模型體內實驗觀察顯示，蝦青素具有很好的降脂功效;并對高脂誘發(fā)的血管及肝臟脂質過氧化損傷有明顯的抑制作用;高劑量蝦青素(10mg/kg)作用效果更為理想。

1 趙文恩.類胡蘿卜素抗氧化性質的研究.鄭州大學學報(工學版)，2003，24:38-46.

2 Stahl W，Sies H.Bioactivity and protective effects of natural carotenoids.Biochimica et Biophysica Acta，2005，1740:101-107.

3 Wieslaw IG，Kazimierz S.Carotenoids as modulators of lipid membrane physical properties.Biochimicaet Biophysica Acta，2005，1740:108-115.

4 Van Duyn MA，Pivonka E.Overview of the health benefits of fruit and vegetable consumption for the dietetics professional:selected literature.J Am Diet Assoc，2000，100:1511-1521.

5 Mayne ST.Beta-carotene，carotenoids，and disease prevention in humans.FASEB J，1996，10:690-701.

6 趙文恩，康保珊，焦鳳云，等.類胡蘿卜素的抗癌作用與基因表達的聯系.生物學雜志，2006，23:1-6.

7 Zhao GF，Seng JJ，Zhang H，et al.Effects of oxidized low density lipoprotein on the growth of human artery smooth muscle cells.Chin Med J，2005，118:1973-1978.

8 Vindis C，Escargueil-Blanc I，Uchida K，et al.Lipid oxidation products and oxidized low-density lipoproteins impair platelet-derived growth factor receptor activity in smooth muscle cells:implication in atherosclerosis.Redox Rep，2007，12:96-100.

9 Deng DX，Spin JM，Tsalenko A，et al.Molecular signatures determining coronary artery and saphenous vein smooth muscle cell phenotypes:distinct responses to stimuli.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2006，26:1058-1065.

10 Vindis C，Escargueil-Blanc I，Elbaz M，et al.Desensitization of plateletderived growth factor receptor-beta by oxidized lipids in vascular cells andatherosclerotic lesions:prevention by aldehyde scavengers.Circ Res，2006，98:785-792.

11 Hadi HA，Carr CS，Al Suwaidi J.Endothelial dysfunction:cardiovascular risk factors，therapy，and outcome.Vasc Health Risk Manag，2005，1:183-198.

12 Davignon J，Ganz P.Role of endothelial dysfunction in atherosclerosis.Circulation，2004，109:27-32.

13 Vasques E，Almeida AL，Noya V，et al.Impairment of endothelium-dependent aorta relaxation by phospholipid components of oxidized lowdensity lipoprotein.Endothelium，2006，13:1-8.

14 Lubos E，Handy DE，Loscalzo J.Role of oxidative stress and nitric oxide in atherothrombosis.Front Biosci，2008，13:5323-344.

15 Zhang YM，Ji LL.Isoflavones lowers blood lipid of atherosclerotic rat.Chin Prev Med，2005，6:124.

16 Alul RH，Wood M，Longoj，et al.Vitamin C protects low density lipoprotein from homocysteine mediated oxidation.Free Radic Biol Med，2003，34:881-889.

17 Sairam RK，Singh DV，Srivaatava GC.Changes in activities of antioxidant enzymes in sunflower leaves of different age.Biol Plant，2003，47:61-66.

18 Mayhan WG，Arrick DM，Sharpe GM，et al.Nitric oxide synthase-dependent responses of the basilar artery during acute infusion of nicotin.Nicotine Tob Res，2009，11:270-277.

19 Sabrane K，Kruse MN，Gazinski A.Chronic endothelium-dependent regulation of arterial blood pressure by atrial natriuretic peptide(ANP):role of nitric oxide and endothelin-1.Endocrinology，2009，150:2382-2387.

20 Cook S.Coronary artery disease，nitric oxide and oxidative stress:the“Yin-Yang”effecta Chinese concept for a worldwide pandemic.Swiss Med Wkly，2006，136:103-113.

21 李雋，曹治宸.NO在CCl4致大鼠肝纖維化中的氧化應激作用.解放軍醫(yī)學雜志，2006，31:234-236.