柳慶坤 秦杏坤 平會 劉曉松 李亞貞 趙建偉

骨關節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種慢性退化性關節(jié)疾病，50歲以上者多發(fā)，膝關節(jié)疼痛是最常見、最突出的癥狀，常使患者行走困難，活動受限，甚至致殘，嚴重影響日常生活［1］。臨床上對OA患者的治療，主要是緩減關節(jié)疼痛、改善關節(jié)功能，缺乏有效的方法控制和治療OA。隨著對OA的深入研究，人們逐漸認識到骨關節(jié)炎是由多種因素相互作用形成的，OA的生物學行為涉及到分子生物學、細胞生物學和機械力學等許多方面，目前普遍認為細胞因子在OA軟骨的破壞上起關鍵作用，而關節(jié)疼痛主要與局部P物質的作用有關［2］。有關亞硫酸鹽在炎癥反應中的作用已有報道，它是一種中性粒細胞抗微生物因子和參與炎癥反應的炎性介質［3］。而有關亞硫酸鹽在骨關節(jié)炎發(fā)病過程中的作用尤其是與關節(jié)疼痛的關系尚未見報道，因此，我們擬通過收集中重度膝關節(jié)炎患者的關節(jié)液，測定其SO2及P物質的含量變化，初步探討亞硫酸鹽對骨關節(jié)炎發(fā)病的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2008年8月至2010年8月我院骨科住院患者36例，男12例，女24例;年齡50～75歲，中位年齡63歲;病史1.5～26.3 年，平均10.5 年。納入標準［4］:(1)符合骨關節(jié)炎的診斷依據(jù)，分級標準為中重度;(2)至少6個月病史;(3)雙側膝關節(jié)炎者，以癥狀嚴重側入選;(4)無心血管、肝、腎等重要臟器病變;(5)排除活動性胃腸病變者及曾發(fā)生過消化性潰瘍或胃十二指腸出血病史;(6)排除類風濕關節(jié)炎、感染性關節(jié)炎等其他關節(jié)疾患。所有病例均為我科初診患者，就診時近6個月未使用其他止痛藥物、皮質類固醇藥物及具有消炎鎮(zhèn)痛作用的中藥制劑。

1.2 臨床分組及標本留取 所有患者均在無菌操作下抽取患側膝關節(jié)液，然后注射玻璃酸鈉注射液2ml(山東福瑞達醫(yī)藥集團)，1次/周，連續(xù)5周。第8周末隨訪患者并在無菌操作下抽取患側膝關節(jié)滑液。每次所取關節(jié)液至少2ml，所得標本3000 r/min，離心 10min，取上清液 200 μl，－70℃凍存。血清來自臨床常規(guī)生化檢測后剩余標本。根據(jù)患者病程共分為3組，每組36例:(1)急性期組:患者確診膝關節(jié)炎，分級為中重度，需行關節(jié)腔減壓治療;(2)恢復期組:經(jīng)5個療程的關節(jié)腔內注射玻璃酸鈉，第8周復查患者;(3)隨訪期組:經(jīng)治療后癥狀明顯好轉半年以上。3組一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)，具有可比性。

1.3 實驗方法

1.3.1 亞硫酸鹽含量測定:取關節(jié)液 100 μl，加入 70 μl硼氫化鈉，室溫孵育 30min，加入 5 μl mBrB，充分混勻，42℃孵育10min，然后加 40 μl高氯酸混勻，12400 × g，室溫離心 10min，取上清，加 10 μl Tris液(2.0 mol/L，pH 值 3.0)輕輕混勻，12400 ×g，室溫離心10min，留取上清液4℃避光保存。取標本 5 μl進樣分析，流動相 A:甲醇:乙酸:水(5∶0.25∶94.75，體積比，pH值3.4)，流動相B:甲醇。甲醇洗脫梯度:0～5min 5%;5～10min 35%;10～17min 45%;17.01～22min 100%;22.01～27min 5%。流速:1.0ml/min。激發(fā)波長392 nm，檢測波長479 nm。

標準曲線的測定:以Na2SO3作為標準品，稀釋為如下濃度:0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、2、4、6 μmol/L，按上述步驟處理后進行檢測，繪制標準曲線。見圖1。

圖1 亞硫酸鹽標準曲線

1.3.2 P物質、白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)和白介素-8(IL-8)的檢測:采用ELISA法檢測，試劑盒購自深圳晶美生物工程有限公司，嚴格按說明操作，根據(jù)標準曲線求出樣品中P物質、IL-1、IL-6和IL-8的含量。

1.4 統(tǒng)計學分析應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 膝骨關節(jié)炎患者關節(jié)液中各因子含量變化 膝關節(jié)液中亞硫酸鹽含量在恢復期較急性期顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(t=12.975，P ＜0.01);而隨訪期關節(jié)液中亞硫酸鹽含量較恢復期雖然有所降低，但差異無統(tǒng)計學意義(t=1.683，P＞0.05)。P物質、IL-1、IL-6和IL-8在膝關節(jié)液中的含量變化與亞硫酸鹽基本一致，恢復期較急性期顯著降低(t值分別為16.901、14.960、12.089 和 13.264，P ＜0.01);但是，隨訪期 P物質和IL-1較恢復期進一步降低，差異有統(tǒng)計學意義(t值分別為6.659和 7.221，P ＜0.01);而 IL-6和 IL-8雖然也有降低，但差異無統(tǒng)計學意義(t值分別為2.354和1.352，P ＞0.05)。

表1 膝骨關節(jié)炎患者關節(jié)液中各因子含量變化

表1 膝骨關節(jié)炎患者關節(jié)液中各因子含量變化

注:與恢復期比較，*P ＜0.05

項目 急性期 恢復期 隨訪期亞硫酸鹽 (μmol/L)9.2 ±3.3 4.4 ±2.2 3.6 ±2.2 P物質(ng/L) 92±24* 72±19 60±16*IL-1(ng/L) 43±10* 23±9 10±6*IL-6(ng/L) 168±34* 120±19 106±21 IL-8(ng/L) 241±27*125±12 118±24

2.2 患者膝關節(jié)液中亞硫酸鹽和P物質的相關性分析 OA患者的膝關節(jié)液中亞硫酸鹽和P物質，具有相關性(r=0.804，P ＜0.05)。見圖2。

圖2 膝關節(jié)液中亞硫酸鹽與P物質水平相關性分析

3 討論

OA是一個復雜的多因子的關節(jié)退行性病變，其發(fā)病過程有多種機制參與。其中炎癥是主要的發(fā)病機制，通過改變細胞因子體系參與OA的發(fā)病過程［4－7］。而OA患者的關節(jié)疼痛除與軟骨下骨暴露和骨內壓增高有關外，主要與P物質有關［8］。關節(jié)滑膜阻止中的P物質是一種強致痛物質，可直接激活滑膜組織的痛覺感受器(C類纖維)，而且刺激巨噬細胞、中性粒細胞、內皮細胞，誘導這些細胞的吞噬作用、作用和血管的滲出。單核細胞受到P物質的刺激釋放IL-1和腫瘤壞死因子以及其他細胞因子，這些炎性介質又可激活成纖維細胞和軟骨細胞釋放膠原酶和蛋白酶，后者進入關節(jié)液中刺激骨膜和末梢神經(jīng)產(chǎn)生疼痛。國內已有學者通過測定輕、中、重度膝關節(jié)OA患者膝關節(jié)液中P物質與白介素1β的含量。發(fā)現(xiàn)OA組膝關節(jié)液中P物質和白介素1β濃度顯著高于對照組;滑液中白介素1β濃度與OA嚴重程度呈正相關，滑液中P物質與OA嚴重程度呈正相關，滑液中白介素1β與P物質濃度呈正相關。認為P物質和白介素1β與膝OA的發(fā)病和病情發(fā)展密切相關;且兩者在OA的發(fā)病及病情發(fā)展中可能發(fā)揮相互協(xié)同作用［2］。

近年來，有關氣體信號分子在OA發(fā)病過程中的作用已有報道，Cillero-Pastor等［9］研究發(fā)現(xiàn)一氧化氮(nitric oxide，NO)可通過調節(jié)線粒體功能降低OA患者滑膜細胞的活性。Whiteman等［10］通過檢測類風濕性關節(jié)炎、OA和健康志愿者的關節(jié)滑液中的硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)，發(fā)現(xiàn)三者血漿H2S無明顯差異，而類風濕性關節(jié)炎關節(jié)滑液中的H2S含量顯著高于骨關節(jié)炎和健康志愿者。由此可以看出，氣體信號分子在關節(jié)炎的發(fā)病過程中發(fā)揮一定的病理生理學作用。

本研究結果發(fā)現(xiàn)，膝關節(jié)液中亞硫酸鹽含量在恢復期較急性期顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);而隨訪期關節(jié)液中亞硫酸鹽含量較恢復期雖有所降低，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。P物質、IL-1、IL-6和IL-8在膝關節(jié)液中的含量變化與亞硫酸鹽基本一致，恢復期較急性期顯著降低。值得注意的是，隨訪期P物質和IL-1較恢復期進一步降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，這與文獻報道一致［2］。骨關節(jié)炎患者的膝關節(jié)液中亞硫酸鹽和P物質二者具有相關性，相關系數(shù)為0.804(P＜0.05)。進一步提示P物質與亞硫酸鹽參與了骨性關節(jié)炎的發(fā)病，且與骨關節(jié)炎患者的疼痛具有一定的相關性。

總之，內源性亞硫酸鹽在骨性關節(jié)炎的發(fā)病過程中發(fā)揮著一定的抗感染防御反應，同時也與局部的P物質協(xié)同引起關節(jié)的疼痛。但是，有關內源性亞硫酸鹽參與骨性關節(jié)炎的炎癥反應機制尚需進一步深入研究。

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