駱 穎，張茂新，凌 冰

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲生態(tài)研究室，廣州 510642)

苦瓜Momordica charantia別名涼瓜、錦荔枝、賴葡萄，為葫蘆科苦瓜屬一年生草本植物，作為一種蔬菜作物廣泛種植于非洲和亞洲，具有抗糖尿病，抑菌等功效 (Grover and Yadav，2004;Beloin et al.，2005;Maurya，2009)。與其他葫蘆科作物相比，在其生長發(fā)育過程中很少被植食性昆蟲為害 (Yasui et al.，1998;Abe and Matsuda，2000)，表現(xiàn)出較強的抗蟲性 (Kumar et al.，1979;Mishraetal，2006)。大量的研究結(jié)果表明，苦瓜葉片提取物對多種害蟲有明顯的拒食、忌避產(chǎn)卵和抑制生長發(fā)育的作用，并從中分離鑒定出多種對昆蟲有生物活性的苦瓜素類化合物，如Momordicin I、II、Ⅳ和 3β，7β，25-三羥葫蘆烷-5，23二烯-19-醛-3-O-β-D-吡喃葡糖苷等，這些化合物是一類葫蘆烷型四環(huán)三萜類植物次生物質(zhì)，對昆蟲的作用方式主要是拒食、忌避產(chǎn)卵和抑制生長發(fā)育 (Chandravadana et al.，1983;陳宏等，1996;李紹勤等，2001;Boeke，2004;Mekuria et al.，2005，2006;凌冰等，2008，2009;向亞林等，2009)。

我們前期的研究結(jié)果表明，苦瓜葉乙酸乙酯萃取物對小菜蛾幼蟲有明顯的拒食和抑制生長發(fā)育活性 (凌冰等，2008;向亞林等，2009)，對美洲斑潛蠅成蟲的拒食和產(chǎn)卵忌避作用顯著 (凌冰等，2009)，對黃曲條跳甲也有明顯的拒食作用(楊舒媚等，2010)。駱穎等 (另文發(fā)表)測定了苦瓜葉乙酸乙酯萃取物對斜紋夜蛾實驗種群增長的抑制作用，發(fā)現(xiàn)苦瓜葉乙酸乙酯萃取物對斜紋夜蛾幼蟲的生長發(fā)育也有明顯的抑制作用。為了研究苦瓜葉乙酸乙酯萃取物及其活性化合物Momordicin II對斜紋夜蛾的作用機理，我們測定了苦瓜葉片乙酸乙酯萃取物及其活性化合物Momordicin II對斜紋夜蛾幼蟲中腸淀粉酶和蛋白酶活性的影響，旨在探索苦瓜植株的抗蟲機理，為尋找新的昆蟲拒食活性物質(zhì)，為合理利用苦瓜資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試昆蟲

斜紋夜蛾Spodoptera litura(Fabricius)由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院昆蟲生態(tài)研究室在人工氣候室內(nèi) ［T:(27±1)℃;RH:70% ～80%;L∶D=14∶10］用人工飼料飼養(yǎng)的種群。斜紋夜蛾人工飼料參照陳其津等 (2000)的方法配制。

1.1.2 供試藥品

苦瓜葉乙酸乙酯萃取物及其活性化合物Momordicin II均由本課題組提供。其他試劑均為市售的化學(xué)純試劑，水由SZ－93自動雙重純水蒸餾器制備 (上海亞榮生化儀器廠)。

1.2 試驗方法

1.2.1 苦瓜葉乙酸乙酯萃取物和Momordicin II混合飼料的配制

用丙酮分別配置不同濃度的苦瓜葉乙酸乙酯萃取物和Momordicin II藥液。將配制好的尚未凝固的人工飼料分別定量地放入保鮮盒內(nèi)，按飼料:藥液等于5∶1的比例，將藥液加入人工飼料中，以丙酮作對照。待各濃度的含藥混合飼料中的溶劑自然揮發(fā)并凝固后，放入冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 試蟲處理及酶液的制備

將大小一致的頭一天蛻皮成4齡的斜紋夜蛾幼蟲饑餓4 h后，以不同濃度苦瓜葉乙酸乙酯萃取物和Momordicin II配制的人工飼料喂養(yǎng)斜紋夜蛾4齡幼蟲，于處理后24 h、48 h和72 h，每處理挑取大小一致的試蟲在冰浴下迅速解剖出中腸，去圍食膜及食物殘渣，將整個中腸轉(zhuǎn)移到5 mL的組織勻漿器中，加4 mL 0.02 mol/L pH 8.0磷酸緩沖液，充分研磨后在4℃、4000 r/min條件下離心10 min，取上清液作酶液。

1.2.3 淀粉酶活性的測定

參考畢明娟等 (2010)的方法并略加改進。取A、B兩支試管，在A管中加入0.2 mL酶液和0.8 mL 1%淀粉溶液作為底物，37℃水浴保溫15 min，再加入3，5－二硝基水楊酸試劑1.0 mL，沸水浴5 min，用蒸餾水定容至5 mL，然后用UV300紫外分光光度計 (美國熱電公司)測定其在波長520 nm處的吸光值。B管中加入0.8 mL磷酸緩沖液代替酶液，其余操作同A管。試驗重復(fù)3次。根據(jù)A、B管吸光值差計算比活力，以每分鐘每毫克蛋白催化水解生成1 mg麥芽糖為1個單位 (U)。

1.2.4 蛋白酶活性的測定

參考潘科等 (2010)的酪蛋白水解比色方法。取A、B兩支試管，在A管中先加入酶液1 mL，再加0.5%酪蛋白溶液2.0 mL，37℃水浴保溫15 min后加入3 mL 10%三氯乙酸終止反應(yīng)，以4000 r/min離心10 min，取上清液2.0 mL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法測定其在波長680 nm處的吸光值。B管中加入1.0 mL磷酸緩沖液代替酶液，其余操作同A管，試驗重復(fù)3次。根據(jù)A、B管吸光值差計算比活力，以每分鐘每毫克蛋白催化水解生成1 μg酪氨酸為1個單位 (U)。

1.2.5 蛋白質(zhì)含量的測定

采用Bradford(1976)的考馬斯亮藍比色法。

1.3 數(shù)據(jù)分析方法

本文中，所有數(shù)據(jù)均以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，方差分析采用鄧肯氏新復(fù)極差檢驗法(Duncan's multiple range test，DMRT)。數(shù)據(jù)分析采用SAS system 9.0版軟件進行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦瓜葉乙酸乙酯萃取物對斜紋夜蛾幼蟲中腸消化酶活性的影響

2.1.1 對淀粉酶活性的影響

以含有0.04%和0.08%濃度的苦瓜葉乙酸乙酯萃取物的人工飼料喂養(yǎng)斜紋夜蛾4齡幼蟲，24 h、48 h和72 h后對中腸淀粉酶活力的影響見圖1。由圖1可以看出，0.04%和0.08%2個濃度處理后24 h和48 h，斜紋夜蛾幼蟲中腸的淀粉酶活性與對照相比差異不顯著，但72 h后，各處理的淀粉酶活性明顯降低，0.04%和0.08%濃度的苦瓜葉乙酸乙酯萃取物處理對斜紋夜蛾幼蟲中腸淀粉酶活性的抑制率分別為22.7%和23.0%。

圖1 苦瓜葉乙酸乙酯萃取物對斜紋夜蛾幼蟲中腸淀粉酶活性的影響Fig.1 Effect of ethyl acetate extracts from Momordica charantia leaves on activities of amylase activities of larvae of Spodoptera litura

2.1.2 苦瓜葉乙酸乙酯萃取物對斜紋夜蛾幼蟲蛋白酶活性的影響

以含有0.04%和0.08%濃度的苦瓜葉乙酸乙酯萃取物的人工飼料喂養(yǎng)斜紋夜蛾4齡幼蟲，24 h、48 h和72 h后對中腸蛋白酶酶活力的影響見圖2。由圖2可以看出，0.08%濃度處理24 h后，斜紋夜蛾幼蟲中腸的蛋白酶活性就明顯低于對照組，抑制率達50.9%;48 h和72 h后，抑制率分別為38.4%和40.6%。0.04%濃度處理在24 h后對蛋白酶活性的影響與對照相比差異不顯著，但48 h和72 h后，對蛋白酶活性的抑制作用明顯增強，抑制率達38.9%和39.3%。說明苦瓜葉乙酸乙酯提取物對斜紋夜蛾幼蟲中腸的蛋白酶活性有明顯的影響。從上述結(jié)果可以看出，苦瓜葉乙酸乙酯提取物對斜紋夜蛾幼蟲中腸蛋白酶活性的抑制作用大于對淀粉酶活性的抑制作用。

圖2 苦瓜葉乙酸乙酯萃取物對斜紋夜蛾幼蟲中腸蛋白酶活性的影響Fig.2 Effect of ethyl acetate extracts from Momordica charantia leaves on activities of protease activities of larvae of Spodoptera litura

2.2 Momordicin II對斜紋夜蛾幼蟲中腸消化酶活性的影響

2.2.1 Momordicin II對斜紋夜蛾幼蟲中腸淀粉酶活性的影響

以含有 0.05%、0.1%、0.2%、0.4%和0.6%濃度的Momordicin II的人工飼料喂養(yǎng)斜紋夜蛾4齡幼蟲，24 h、48 h和72 h后對中腸淀粉酶活力的影響見圖3。由圖3可以看出，各濃度Momordicin II處理24 h、48 h和72 h后，斜紋夜蛾幼蟲中腸淀粉酶的活性與對照相比雖然有所降低但差異不顯著，表明Momordicin II對斜紋夜蛾幼蟲中腸的淀粉酶活性無明顯的抑制作用。

2.2.2 Momordicin II對斜紋夜蛾幼蟲中腸蛋白酶活性的影響

以含有 0.05%、0.1%、0.2%、0.4%和0.6%濃度的Momordicin II的人工飼料喂養(yǎng)斜紋夜蛾4齡幼蟲，24 h、48 h和72 h后對中腸蛋白酶活力的影響見圖4。由圖4可以看出，MomordicinⅡ?qū)π奔y夜幼蟲中腸的蛋白酶活力有明顯的影響，且隨著使用濃度的增加抑制作用也隨著增強。MomordicinⅡ處理24 h和48 h后，0.05%和0.10%濃度處理的蛋白酶活性與對照差異不顯著，而濃度為0.2%、0.4%和0.6%的Momordicin II處理24 h和48 h后，其蛋白酶活性均顯著低于對照，24h的抑制率分別為44.9%、53.1%和63.5%;48 h的抑制率分別為27.0%、31.9%和42.9%。處理72 h后，5個濃度處理蛋白酶活性均顯著低于對照，對蛋白酶活性抑制作用最強，各濃度處理的抑制率分別為 43.1%、40.2%、67.4%、71.8%和75.6%。說明Momordicin II對斜紋夜蛾幼蟲中腸的蛋白酶活性有顯著的抑制作用。

圖3 Momordicin II對斜紋夜蛾幼蟲中腸淀粉酶活性的影響Fig.3 Effect of Momordicin II on activities of amylase activities of larvae of Spodoptera litura

圖4 Momordicin II對斜紋夜蛾幼蟲中腸蛋白酶活性的影響Fig.4 Effect of Momordicin II on activities of protease activities of larvae of Spodoptera litura

3 結(jié)論與討論

本試驗研究結(jié)果表明苦瓜葉乙酸乙酯萃取物對斜紋夜蛾幼蟲中腸淀粉酶活性和蛋白酶活性均有一定的抑制作用，且對蛋白酶活性的抑制作用更明顯。斜紋夜蛾幼蟲取食了含有Momordicin II的人工飼料后，對蛋白酶活性的影響與苦瓜葉乙酸乙酯萃取物大體相同，但Momordicin II對淀粉酶活性的影響不明顯，說明苦瓜葉乙酸乙酯萃取物中還存在抑制斜紋夜蛾幼蟲中腸淀粉酶活性的其他活性物質(zhì)。

近年來，大量的研究結(jié)果表明，苦瓜葉片萃取物及其次生化合物對多種害蟲有明顯的拒食、忌避產(chǎn)卵和抑制生長發(fā)育的作用 (Chandravadana et al.，1983，1987;陳宏等，1996;Yasui，1998;Abe etal.，2000;李 紹勤 等，2001;Boeke，2004;Mekuria et al.，2005，2006;Kashiwagi et al.，2007;任立云等，2008;凌冰等，2008，2009;向亞林等，2009)。目前已從苦瓜葉片提取物中分離鑒定出多種對昆蟲有生物活性的苦瓜素類化合物，它們是苦瓜抗蟲的重要活性物質(zhì)，但有關(guān)這些化合物對昆蟲的作用機理研究尚未見報道。

MomordicinⅡ是苦瓜葉提取物中的最主要苦瓜素類化合物，生物活性測定結(jié)果表明MomordicinⅡ具有拒食作用，拒產(chǎn)卵作用和抑制生長發(fā)育的作用 (Yasui，1998;Mekuria et al.，2005;凌冰等，2008)。與楝科植物中的印楝素相同，均為四環(huán)三萜類化合物。印楝素對多種害蟲有拒食、觸殺、胃毒、抑制生長發(fā)育和影響卵巢發(fā)育的作用(Schmutterer，1990)，通過影響口器上厭食及其他化學(xué)感器產(chǎn)生初生拒食反應(yīng);通過抑制昆蟲中腸酯酶和脂肪體中蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、磷酸酶和葡萄糖酶的活性，降低昆蟲的取食率和對食物的轉(zhuǎn)化利用率形成次生拒食反應(yīng) (程東美等2007)。消化酶是由昆蟲中腸上皮細胞形成和分泌的，其活性直接影響昆蟲對食物中營養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收。其中，淀粉酶和蛋白酶是昆蟲最主要的消化酶。苦瓜葉乙酸乙酯萃取物和Momordicin II對斜紋夜蛾幼蟲生長發(fā)育及存活的影響可能與其抑制了幼蟲中腸內(nèi)的消化酶有關(guān)，淀粉酶和蛋白酶活性的顯著降低直接影響了斜紋夜蛾幼蟲對食物中淀粉、纖維素及蛋白質(zhì)等的消化和吸收，進一步抑制了斜紋夜蛾幼蟲對食物的攝取及維持其生理功能和生長發(fā)育需要的營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，因而影響了斜紋夜蛾的正常生長發(fā)育。

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