賀春玲，張淑霞，嵇保中，劉曙雯

(1.河南科技大學林學院，河南洛陽 471003;2.南京林業(yè)大學森林資源與環(huán)境學院，南京 210037;3.南京中山陵園管理局，南京 210014)

釀貯蜂糧是膜翅目2萬多種花粉蜂較為普遍的習性。雌蜂筑好巢室后，一次性備足幼蟲一生所需的蜂糧，然后在蜂糧上產(chǎn)卵并封閉巢室，孵化出的幼蟲完全依賴蜂糧為食完成發(fā)育 (吳燕如，1965)。蜂糧 (Bee bread)也稱蜂面包、蜂巢花粉，是采粉蜂將花粉團卸落在巢房中，通過咬碎、吐蜜濕潤等行為對花粉團進行初步加工后，在微生物的作用下，封藏的花粉團經(jīng)過一定時間的發(fā)酵所形成的蜂花粉釀制產(chǎn)物 (嵇保中等，2006)。蜂糧中含有豐富的微生物資源，貯備的蜂糧在巢房中有一個復雜的微生物區(qū)系變化和生物化學變化過程 (袁耀東，1991;蘇松坤，2000)。Gilliam et al.(1989)從杏仁花粉、蜂花粉和1、3、6周蜂糧樣品中分離到芽孢桿菌屬的6種芽孢桿菌41個菌落和148株霉菌。蘇松坤等 (2001)從中國茶的手采花粉、蜂花粉和不同釀制時間的蜂糧樣品中分離出207個細菌菌落和9個屬131株霉菌。其中蜂糧中的微生物及其代謝產(chǎn)物能有效抑制蜂糧中雜菌的生長，在蜂糧的釀制過程中具有十分重要的作用 (Gilliam et al，1997;蘇松坤，2002)。

長木蜂Xylocopa tranquebarorum屬蜜蜂科Apidae木蜂屬Xylocopa的野生蜂類，與蜜蜂類似，它們采集芍藥 Paeonia lactiflora、虞美人 Papaver rhoeas、槐花Sophora japonica、云實Caesalpinia decapetala、薔薇Rosa spp、女貞Ligustrum lucidum等植物花粉制作蜂糧 (賀春玲等，2009)。羅祿怡(1992)報道長木蜂蜂糧在巢室內(nèi)能較長時期保持濕潤狀態(tài)不會霉變。賀春玲等 (2009)報道長木蜂蜂糧的醇提液 (70%)對枯草芽孢桿菌具有很強的抑制作用。關(guān)于長木蜂蜂糧的微生物群落變化規(guī)律、在釀制過程中的功能以及蜂糧長期保持的機制等問題國內(nèi)外未見報道。本文以芍藥花粉的長木蜂蜂糧為研究對象，初步研究長木蜂蜂糧在釀制過程中微生物的變化規(guī)律，同時篩選具有抑菌活性的微生物菌株，為揭示蜂糧釀制及長期保存過程中防腐機制和開發(fā)新的防腐資源奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試長木蜂

不同巢室中的越冬雌蜂、釀貯蜂糧盛期的雌蜂及長木蜂的幼蟲和蛹均采集于南京林業(yè)大學樹木標本園、南京中山植物園和南京情侶園花卉公園。

1.1.2 樣品的采集

2008年5月芍藥盛花期，在南京情侶園花卉公園采集芍藥花粉、芍藥長木蜂花粉、不同釀制階段的芍藥長木蜂蜂糧樣品。具體的采集方法見賀春玲等 (2010)。

手采芍藥花粉樣品:分為芍藥花未開放前采集的樣品和芍藥花已經(jīng)開放后的樣品，分別表示為花粉 (1)和花粉 (2)。

芍藥花未開放前樣品采集:在芍藥大蕾期，將花苞采下放入滅菌的采集袋中，帶回實驗室后在無菌操作臺上取出花粉放入滅菌的5 mL離心管中，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

芍藥花已經(jīng)開放后樣品的采集:在芍藥大蕾期，用細尼龍網(wǎng)袋套將花蕾罩上，待花開放后用滅菌的鑷子迅速取下花粉，放入滅菌的的5 mL離心管中，低溫帶回實驗室后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

長木蜂幼蟲蟲糞和長木蜂制作的巢室隔板樣品采集:2008年5月中旬，在南京情侶園花卉公園的芍藥園附近采集捆綁的長木蜂筑巢枯竹，帶回實驗室后，在無菌操作間解剖取出幼蟲的蟲糞和巢室隔板放入滅菌的培養(yǎng)皿內(nèi)，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 培養(yǎng)基的配置

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 (簡稱NA)、改良LB培養(yǎng)基、改良MRS培養(yǎng)基 (pH4.5、pH6.5)、產(chǎn)芽孢培養(yǎng)基、酵母浸膏麥芽汁培養(yǎng)基、葡萄糖天門冬酰胺培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基的配置參見周德慶(1986)、凌代文 (1999)、黃秀梨 (1999)、東秀珠等 (2001)、楊潔彬 (1996)的方法進行。本實驗所用試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.4 指示菌株

測試細菌為金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus、大腸桿菌Escherichia coli、枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis;測試真菌為青霉菌Penicillium citrinum、黑曲霉菌Apergillus oryzae、根霉菌Rhizopus、毛霉菌Mucor、假絲酵母Candida sp.和啤酒酵母菌Saccharomyces cerevisiae;所有菌株均由南京林業(yè)大學森林資源與環(huán)境學院微生物教研室提供。細菌菌種在牛肉膏蛋白胨固體斜面培養(yǎng)基37℃下培養(yǎng)24 h，真菌菌種在PDA固體斜面培養(yǎng)基28℃下培養(yǎng)48 h，4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 長木蜂體表微生物的分離

采集不同時期帶有長木蜂筑巢的枯竹并帶回實驗室，在無菌操作間解剖取出越冬雌蜂、釀貯蜂糧盛期的雌蜂以及幼蟲、預蛹和蛹并稱重，然后分別放入5 mL滅菌離心管中，按照蟲體重量每克加入9 mL的無菌水，記為10－1;按照稀釋涂布分離法的稀釋方法 (周德慶，1986)稀釋至10－3、10－4濃度的稀釋溶液備用。

稀釋到10－3和10－4的稀釋液樣品分別吸取200 μL用涂棒均勻涂布在NA、改良LB培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基 (pH6.5、pH5.5和pH4.5)平板上，在28℃培養(yǎng)。隨時觀察并記錄菌株的生長情況，統(tǒng)計樣品中的菌落總數(shù)，然后用接種針挑取不同形態(tài)的菌落移入相應的培養(yǎng)基上純化、培養(yǎng)。每個樣地取不同巢室的蟲態(tài) (越冬雌蜂、釀貯蜂糧盛期的雌蜂以及幼蟲、預蛹和蛹)各3頭，每個樣品重復3次，3次的平均值為該樣品在各種培養(yǎng)基上的菌落數(shù)。

1.2.2 長木蜂幼蟲蟲糞和巢室隔板的微生物分離

在無菌操作間稱取幼蟲蟲糞和巢室隔板各0.3000 g于滅菌的10 mL離心管中，用無菌的玻璃棒將蟲糞和巢室隔板搗碎后，加入2.7 mL去離子水，充分搖勻，記為10－1;按照稀釋涂布分離法的稀釋方法 (周德慶，1986)稀釋至 10－3、10－4濃度的稀釋溶液備用。

稀釋到10－3和10－4的稀釋液樣品分別吸取200 μL用涂棒均勻涂布在NA、改良LB培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基 (pH4.5和pH6.5)平板上，在28℃培養(yǎng)。隨時觀察并記錄菌株的生長情況，統(tǒng)計樣品中的菌落總數(shù)，然后用接種針挑取不同形態(tài)的菌落移入相應的培養(yǎng)基上純化、培養(yǎng)。每個樣品重復3次，3次的平均值為該樣品在各種培養(yǎng)基上的菌落數(shù)。

1.2.3 芍藥花粉、芍藥長木蜂花粉和不同日齡的蜂糧樣品中微生物分離

稱取采集的芍藥花粉、新鮮芍藥長木蜂采集的花粉、1日、2日、3日、……10日、15日、20日、30日芍藥長木蜂蜂糧樣品各0.3000 g于滅菌的10 mL離心管中，加入2.7 mL去離子水，充分搖勻，記為10－1;按照稀釋涂布分離法的稀釋方法 (周德慶，1986)稀釋至10－3、10－4濃度的稀釋溶液備用。微生物分離培養(yǎng)方法同1.2.2。

不同日齡的蜂糧樣品:指長木蜂采集花粉蜜制作蜂糧完成后在蜂糧上產(chǎn)卵開始，記為1日齡，第2天記為2日齡，依此類推3日齡、4日齡……1.2.4 菌株的鑒定

1.2.4.1 細菌菌落形態(tài)鑒定

觀察菌落表面顏色、隆起度、質(zhì)地、邊緣光滑、粗糙、菌落直徑、干燥度、產(chǎn)芽孢有無和革蘭氏染色。

湖泊水體是OCPs的一個重要匯集地，具有流動性小、水交換周期長、對污染物的稀釋能力弱、生態(tài)系統(tǒng)相對較脆弱、生態(tài)平衡容易遭到破壞且不容易恢復等特點，所以較其他水環(huán)境更容易受到污染［20］。有機氯農(nóng)藥污染湖泊水體的途徑有地表徑流、大氣沉降和湖底沉積物的二次釋放。

1.2.4.2 放線菌菌落形態(tài)鑒定

插片培養(yǎng)法顯微鏡觀察菌絲形態(tài)、顏色、質(zhì)地、分枝、橫隔、孢子著生位置、孢子形狀、顏色、孢子絲形狀、顏色、氣生菌絲、基內(nèi)菌絲、菌絲顏色、質(zhì)地、孢子粉顏色、密度等。

1.2.5 抑菌活性菌株的初篩

指示細菌的抑菌活性:采用瓊脂塊法對所分離得到的菌株進行抑菌活性初篩。具體方法為將分離得到的菌株劃線培養(yǎng)與相應的培養(yǎng)基，在28℃培養(yǎng)2～5 d，用打孔器 (Φ=6 mm)將菌落打下并移至含有指示菌的營養(yǎng)瓊脂平板上，然后在28℃培養(yǎng)2～5 d，每個菌株重復3次，觀察其抑菌活性。

指示真菌的抑菌活性:采用平板對峙培養(yǎng)法，將分離到的菌株與指示真菌在PDA平板上進行對峙培養(yǎng)，用打孔器 (Φ=6 mm)將在PDA上活化的指示真菌打成菌柄塊，用接種針移入PDA平板中央，在距中央2 cm處涂分離菌株，27℃恒溫培養(yǎng)，待CK長滿皿時，測其抑菌帶的寬度。每菌株設3皿重復，不接待測菌的為CK。

1.3 數(shù)據(jù)采集與分析

采用多功能型全自動菌落/顯微圖像分析儀(杭州迅數(shù)科技有限公司生產(chǎn))進行數(shù)據(jù)采集;采用Microsoft Excel和SPSS Base Ver.13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 長木蜂體表微生物分離結(jié)果

采用 NA、改良 LB培養(yǎng)基、MRS(pH4.5)、MRS(pH5.5)、MRS(pH6.5)培養(yǎng)基對長木蜂雌蜂釀貯蜂糧盛期體表微生物狀況進行分離，結(jié)果見圖1(A)，由圖1(A)表明在5種培養(yǎng)基上分離到的微生物菌落數(shù)不同，在MRS4.5的培養(yǎng)基上分離到的菌落數(shù)量最多，為21176±5392個/g;在改良LB培養(yǎng)基上分離到得菌落數(shù)最少，為2400±1509個/g。通過菌落形態(tài)觀察和顯微形態(tài)觀察，發(fā)現(xiàn)在五種培養(yǎng)基上分離到的微生物主要有細菌、酵母菌和放線菌，其中在MRS培養(yǎng)基上分離到的菌落主要屬于乳酸菌和酵母菌。

圖1 長木蜂雌蜂在不同培養(yǎng)基 (A)和不同階段 (B)體表微生物菌落數(shù)量Fig.1 Microorganism colonies on body surface of female in different culture mmedium(A)and in different stages(B)X.tranquebarorum

2.2 長木蜂蜂糧釀制過程中微生物菌落數(shù)量變化規(guī)律

采用 NA、改良LB培養(yǎng)基、MRS(pH4.5)、MRS(pH6.5)培養(yǎng)基對長木蜂雌蜂釀貯蜂糧過程中蜂糧微生物數(shù)量的變化情況進行培養(yǎng)分離 (圖2)。芍藥未開放之前的花粉樣品，在各培養(yǎng)基中均未分離到微生物菌落;在芍藥開花后采集的花粉樣品，在NA培養(yǎng)基上分離到的細菌菌落數(shù)量最多，改良LB培養(yǎng)基上分離的菌落數(shù)量少，而MRS(4.5)和MRS(6.5)培養(yǎng)基上未分離到菌落;芍藥長木蜂花粉在上述四種培養(yǎng)基上均分離到微生物菌落;長木蜂蜂糧的微生物菌落的變化規(guī)律，1日齡蜂糧中菌落數(shù)最多，2日齡開始下降，3日齡降至降低點，在4日齡階段微生物的菌落數(shù)出現(xiàn)一個低谷，然后升高;8～12日齡又出現(xiàn)一個小高峰，12日齡后，長木蜂蜂糧中微生物基本趨于穩(wěn)定狀態(tài)，由此可知，長木蜂蜂糧在釀制過程中內(nèi)部的微生物區(qū)系發(fā)生了很大變化。

2.3 長木蜂蜂糧中分離到的微生物菌株

采用 NA、改良 LB培養(yǎng)基、MRS(4.5)、MRS(6.5)培養(yǎng)基分別對手采芍藥花粉、芍藥長木蜂花粉和不同釀制時間的蜂糧樣品進行微生物分離，根據(jù)菌落的顏色、形態(tài)、革蘭氏染色以及培養(yǎng)時間的長短和培養(yǎng)基的不同，將分離的菌株進行純化，共分離菌株68株，其中細菌43株，酵母17株，放線菌8株。酵母菌株主要分離自MRS(4.5)和MRS(6.5)上，放線菌菌株主要分離自NA培養(yǎng)基上，蜂糧中的酵母菌主要來自長木蜂雌蜂的體表，雌蜂在釀貯蜂糧過程中添加到蜂糧中。

2.4抑菌活性菌株初篩

2.4.1對指示細菌的抑菌活性

采用瓊脂塊法對分離的68株菌株進行抑菌活性初篩。68株菌株中其中12株對指示細菌有抑制作用 (表1，圖版1)。分離的酵母菌菌株對細菌和真菌均沒有抑菌活性，分離的細菌菌株P(guān)T－1、NF－25、NF－26、NF－27、NF－28和NF－33對

圖2 長木蜂蜂糧釀貯過程中微生物數(shù)量的變化規(guī)律Fig.2 The dynamica changes of the amount of bacterial colonies during the process of brewing bee bread for X.tranquebarorum

指示細菌有明顯的抑制作用，對金黃色葡萄球菌有很好的抑菌活性;NF－11、NF－17、NF－18、NF－19、NF－32、NF－34屬于放線菌，對金黃色葡萄球菌有抑制作用，其中NF－32和NF－34對枯草芽孢桿菌也表現(xiàn)出很好的抑菌活性。

表1 從蜂糧中分離的菌株對指示細菌的抑菌活性Table 1 The antibacterial activity of strains separated form bee bread

2.7.2 對指示真菌的抑菌活性

篩選的68株菌株中，對指示真菌有抑菌活性的有10株 (表3)，抑菌活性較強的有3株，分別為NF－25、NF－32和NF－34，其中NF－34菌株對青霉菌、黑曲霉菌、毛霉菌均有很好的抑制作用，對啤酒酵母的抑制作用最強，抑菌圈直徑為33.45±2.57mm，但對假絲酵母抑制作用弱 (圖版7－1)。

表2 從蜂糧中分離的菌株對真菌的抑菌活性Table 2 The antibacterial activity of strains separated form bee bread to fungi

3 結(jié)論與討論

3.1 培養(yǎng)基種類的選擇

沒有一種培養(yǎng)基或一種培養(yǎng)條件能夠滿足自然界中一切生物的生長，在一定程度上所有的培養(yǎng)基都是有選擇性的 (沈萍，2002)。我們參照蘇松坤 (2000)的細菌分離方法，對長木蜂蜂糧中的有益細菌進行分離，MRS培養(yǎng)基主要是分離乳酸菌的培養(yǎng)基，本實驗采用MRS(pH4.5)和MRS(pH6.5)培養(yǎng)基分離到大量的酵母菌菌落，而分離到的細菌菌落很少，分離結(jié)果與文獻報道不一致，具體原因還有待進一步研究。在NA培養(yǎng)基上，除分離到大量的細菌外，還分離到放線菌菌落，并且發(fā)現(xiàn)在放線菌菌落周圍可以抑制其它微生物的生長。由于分離微生物采用的是新鮮樣品進行分離，酵母菌和放線菌生長時間相對較長，由于取樣的限制，我們在分離過程中沒有補充專用酵母菌和放線菌的分離培養(yǎng)基，針對選擇的幾種培養(yǎng)基分離到的菌株進行了微生物群落的分析，可能還不能完全涵蓋長木蜂蜂糧微生物的全貌，在以后的研究中有待進一步改進。

3.2 長木蜂蜂糧中微生物的變化規(guī)律

本實驗結(jié)果表明，長木蜂蜂糧中細菌和酵母菌屬于優(yōu)勢菌株，在芍藥花粉中沒有分離到酵母菌，在芍藥長木蜂花粉中分離到酵母菌，然后隨蜂糧釀制時間的延長，細菌和酵母菌的數(shù)量劇增，3日齡酵母菌的數(shù)量下降，酸度降低，其變化趨勢與長木蜂蜂糧pH的變化趨勢基本一致 (賀春玲等，2010)。長木蜂蜂糧中也分離到乳酸菌，但在MRS(pH4.5)和MRS(pH6.5)上分離到的菌株數(shù)量較少，而在改良LB培養(yǎng)基上分離到得菌株較多，由此也可以看出長木蜂蜂糧中的乳酸菌與茶蜂糧中的乳酸菌菌株區(qū)系可能不同。乳酸菌是能從葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)生大量乳酸的細菌，是長木蜂蜂糧pH值降低的主要原因，本文通過采用BCG乳酸鑒定培養(yǎng)基初步對分離的有抑菌活性的細菌菌株進行乳酸菌鑒定，但具體屬于哪一種乳酸菌還需要進一步鑒定獲得。因此，對長木蜂蜂糧中乳酸菌的來源、分離培養(yǎng)培養(yǎng)基的選擇以及在蜂糧中擔負的抑菌活性功能均有待進一步研究。

3.3 長木蜂蜂糧中微生物來源

蜜蜂蜂糧中細菌主要來自花粉產(chǎn)地的生態(tài)環(huán)境、蜜蜂自身攜帶和蜂巢內(nèi)的部分細菌，在蜂糧釀制過程中，由于蜂巢環(huán)境和蜜蜂的作用，導致蜂巢中的細菌發(fā)生復雜的變化 (蘇松坤，2001)。長木蜂蜂糧中的微生物菌株主要來源于花粉產(chǎn)地的生態(tài)環(huán)境、長木蜂自身的攜帶和蜂巢內(nèi)部的環(huán)境。長木蜂營巢主要選擇直徑1.2～2.5 cm的枯竹上，雌蜂屬于獨棲性蜂類，多數(shù)越冬雌蜂在翌年的4月份另筑新巢，少數(shù)利用舊巢，但不論是利用舊巢或另筑新巢，對于舊巢和新巢中的蜂糧微生物培養(yǎng)結(jié)果看其區(qū)別不大，主要細菌和酵母菌;在不同地點采集的雌蜂，體表微生物分離結(jié)果均有酵母菌和放線菌，因此，酵母菌和部分放線菌可能屬于長木蜂雌蜂體表的共生菌，在長期進化過程中形成的，對蜂糧的保鮮有非常重要的意義，對于長木蜂體表微生物對蜂糧釀制過程中的保鮮作用還有待進一步研究。

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圖版1 NF－34菌株的抑菌活性Plate 1 The antibacterial activity of strain NF－34