王金娜，王相晶，張友軍，王少麗*

溫室白粉虱Trialeurodes vaporariorum是世界范圍的災(zāi)害性害蟲，已報(bào)道的寄主植物超過900種(Kirk等，2000)。其以成蟲和若蟲吸取寄主植物汁液，使葉片褪色、變黃、萎蔫，并分泌大量蜜露，污染果實(shí)和葉片;更為重要的是傳播植物病毒病，如黃瓜黃化、番茄褪綠等，嚴(yán)重時(shí)可引起葉片干枯、植株死亡等。自20世紀(jì)70年代中期該蟲在我國北方地區(qū)爆發(fā)危害以來，一直是我國北方地區(qū)的主要害蟲 (朱國仁等，2006)。近幾十年來，北方地區(qū)菜田生態(tài)系統(tǒng)發(fā)生了深刻變化，特別是加溫溫室和塑料大棚蔬菜生產(chǎn)的迅速發(fā)展，為該害蟲提供了冬季繁衍的良好環(huán)境，形成蟲源基地，使得原本在露地不能越冬的害蟲有了大發(fā)生的可能;溫室、大棚和露地蔬菜生產(chǎn)緊密銜接、相互交錯(cuò)，使溫室白粉虱種群得以繁衍和周年發(fā)生，危害加重，在大型連棟溫室果菜上常猖獗成災(zāi)。目前溫室白粉虱仍是我國北方蔬菜生產(chǎn)的重要限制因子之一 (時(shí)玉娟等，2011)。

在我國北方地區(qū)，溫室白粉虱和煙粉虱Bemisia tabaci寄主重疊、危害習(xí)性相似，生活史相近，且同域混合發(fā)生，體型微小、外形相似而難以區(qū)分。雖然有文獻(xiàn)提出其外部形態(tài)或顯微鏡檢識(shí)別特征 (朱國仁等，2006;褚棟等，2008)，但是這兩種害蟲的外部形態(tài)上的快速區(qū)分對(duì)于非粉虱研究專業(yè)人士來說仍舊比較困難，而且由于粉虱類害蟲的形態(tài)特征常因環(huán)境條件、寄主植物差異等存在變異，尤其是異地采集保存在酒精中的粉虱類害蟲或者是保存不完整的標(biāo)本等，采用上面兩種方法根本無法鑒別。而DNA鑒定技術(shù)相對(duì)快速、準(zhǔn)確，對(duì)于樣品的保存相對(duì)簡(jiǎn)單，且與樣本的完整性與否無關(guān)，因此，很有必要發(fā)展其快速DNA鑒定技術(shù)。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，近年來分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展迅速，利用分子標(biāo)記技術(shù)只需要少量的DNA就可以快速準(zhǔn)確地鑒定出昆蟲種類，該類技術(shù)不僅可以檢測(cè)成蟲，對(duì)其它各蟲態(tài)亦具有同樣的檢測(cè)效能。以前有研究者采用擴(kuò)增測(cè)序mtCOI序列或者ITS2序列，并與已登錄在GenBank上的該基因序列一起構(gòu)建聚類樹，由聚類分析得知分析樣本與已知序列之間的親緣關(guān)系遠(yuǎn)近，進(jìn)而推斷出該基因的所屬種類 (Hinomoto et al.，2007;Ben－David et al.，2007;Ma et al.，2009;Liu et al.，2011)。但是該技術(shù)需要標(biāo)本在PCR擴(kuò)增之后進(jìn)行回收、克隆和測(cè)序，這樣會(huì)耗費(fèi)大量的財(cái)力和勞力。限制性片段長度多態(tài)性 (Restriction fragment length polymorphism，簡(jiǎn)稱RFLP)和單鏈構(gòu)象多態(tài)性 (Single－Stranded Confirmation Polymorphisms，簡(jiǎn)稱SSCP)等技術(shù)也通常被用來進(jìn)行昆蟲種類的分子鑒定，但是其過程復(fù)雜，需要酶切、擴(kuò)增或者擴(kuò)增、聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)合銀染方法等，需要花費(fèi)較長時(shí)間，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。還有研究者擴(kuò)增ITS區(qū)域片段結(jié)合限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，根據(jù)酶切片段長短來判斷種的差異 (Ma et al.，2009;Jeong et al.，2010)，但此種方法尚需要兩個(gè)操作步驟，且酶切結(jié)果受到多種因素影響而易出現(xiàn)切不開或者由于擴(kuò)增錯(cuò)配導(dǎo)致的酶切位點(diǎn)改變等現(xiàn)象。特征序列擴(kuò)增區(qū)域 (Sequence Characterized Amplified Regions，簡(jiǎn)稱SCAR)標(biāo)記技術(shù)是通過隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD)技術(shù)篩選出靶標(biāo)種特異片段，然后將目標(biāo)RAPD片段進(jìn)行克隆和測(cè)序，并根據(jù)此目標(biāo)片段兩端的堿基序列設(shè)計(jì)特異性引物;然后以該對(duì)特異性引物對(duì)基因組DNA片段再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增，進(jìn)而將與原RAPD片段相對(duì)應(yīng)的單一位點(diǎn)鑒別出來;SCAR標(biāo)記為共顯性遺傳，待檢DNA樣品間的差異可通過擴(kuò)增產(chǎn)物的有和無來顯示 (黎裕等，1999;Gupta et al.，2010)。與上述其它分子標(biāo)記方法相比，具有操作簡(jiǎn)便、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，可用于樣品的大規(guī)模檢測(cè)。

本研究通過對(duì)不同粉虱類害蟲的RAPD擴(kuò)增，找到溫室白粉虱的特異性擴(kuò)增條帶，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的SCAR標(biāo)記，來進(jìn)行溫室白粉虱的鑒定識(shí)別。同時(shí)，采用建立的該SCAR標(biāo)記檢測(cè)鑒定了采自田間不同省份的溫室白粉虱樣品。研究結(jié)果可為快速識(shí)別鑒定溫室白粉虱提供一種簡(jiǎn)單的方法，同時(shí)對(duì)于其田間該蟲的針對(duì)性防治具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試蟲

本研究中的溫室白粉虱試蟲由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所張桂芬研究員提供，寄主植物為甘藍(lán)。B型煙粉虱和Q型煙粉虱飼養(yǎng)于本課題組，寄主植物分別為甘藍(lán)和棉花，期間不接觸任何化學(xué)藥劑。其他作為對(duì)照的試蟲樣品分別采集于田間，柑綠粉虱2011年10月份采集于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院院內(nèi)菊花寄主上;螺旋粉虱和黑刺粉虱于2011年10月分別采集于海南儋州的番石榴寄主和?？诖笃骆?zhèn)福昌村的酸桔寄主上;ZJ－2型煙粉虱室內(nèi)酒精保存樣品由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所張桂芬研究員提供。

供試的田間溫室白粉虱種群分別采自云南、山西、山東、吉林、甘肅和青海地區(qū)的蔬菜作物上。該試蟲標(biāo)本在室內(nèi)首先采用形態(tài)鑒定法 (朱國仁等，2006)和復(fù)眼鏡檢法 (褚棟等，2008)鑒別為溫室白粉虱種群，然后用于本研究中SCAR分子標(biāo)記的檢測(cè)。

1.2 供試試劑

隨機(jī)引物采用Operon公司的RAPD通用引物系列，分別為OPA、OPB、OPC系列，每個(gè)系列分別包含20條引物。隨機(jī)引物和特異性引物分別由上海英竣生物工程公司合成和北京擎科生物工程公司合成。DNA序列測(cè)序委托北京擎科生物工程有限公司進(jìn)行。PCR擴(kuò)增中使用的聚合酶為2×Taq10 Master Mix(0.1U TaqE/μL)，購自北京奧賽博科技發(fā)展有限公司。試蟲的基因組DNA提取試劑盒和克隆試劑盒分別購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司和北京全式金生物技術(shù)有限公司。DNA標(biāo)準(zhǔn)Marker購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3 單頭粉虱成蟲DNA提取

基因組DNA的提取采用DNA提取試劑盒(溶液型)(百泰克，北京)進(jìn)行，按照試劑盒說明書進(jìn)行，稍有改動(dòng)。具體操作如下:(1)將單頭煙粉虱置于滴有10 μL裂解液中的Parafilm膜上，以0.2 mL的PCR管底部作為勻漿器充分研磨，用另20 μL的裂解液清洗勻漿器2次，合并混勻;(2)以微量移液器移入1.5 mL離心管內(nèi)，加入2 μL蛋白酶K，混勻，55℃下水浴4 h或者過夜;(3)離心幾秒鐘，加入2.5 μL RNase，置于37℃烘箱15～30 min;(4)取出上述樣品，晾至室溫，加入蛋白沉淀液25 μL，漩渦振蕩器上高速震蕩25 s;(5)冰浴5 min，沉淀蛋白;室溫下13000 r/min離心5 min;小心吸取上清液到另一個(gè)新管中 (不要吸入沉淀);(6)加入等體積的異丙醇50 μL，顛倒混勻30次;(7)室溫下12000 r/min離心10 min，棄上清，加入1 mL 70%乙醇顛倒漂洗DNA沉淀，室溫下12000 r/min離心2 min，棄上清;(8)加入1 mL無水乙醇顛倒漂洗DNA沉淀，室溫下12000 r/min離心2 min，棄上清;(9)加入20 μL DNA溶解液，65℃下水浴60 min，溶解DNA，然后置－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 RAPD擴(kuò)增

以上述基因組DNA為模板，采用60條隨機(jī)引物分別進(jìn)行隨機(jī)擴(kuò)增，記錄篩選出來的特異條帶以及相應(yīng)擴(kuò)增引物，并對(duì)這些條帶進(jìn)行標(biāo)記。擴(kuò)增總體積為 20 μL，包含 10 μL 2 ×Taq10 Master Mix、1 μLDNA 模板、3 μL RAPD 引物 (10 mM)和6 μL ddH2O。PCR反應(yīng)程序?yàn)?首先進(jìn)行94℃預(yù)變性4 min，之后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，包括94℃變性1 min，37℃退火 50 s，72℃延伸 95 s，最后72℃延伸10 min。擴(kuò)增反應(yīng)在Biorad S－1000擴(kuò)增儀上進(jìn)行。程序結(jié)束后，分別取6 μL各樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，在1%瓊脂糖凝膠上電泳，并在凝膠成像系統(tǒng) (Biorad)上分析電泳結(jié)果。

1.5 特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的回收克隆

對(duì)RAPD擴(kuò)增結(jié)果中發(fā)現(xiàn)溫室白粉虱樣品中的特異性條帶進(jìn)行標(biāo)記。在瓊脂糖凝膠電泳上回收該特異性條帶，采用DNA純化試劑盒 (百泰克，北京)進(jìn)行純化，把該純化片段連接到pEASY－T1載體上，轉(zhuǎn)化到TOP10感受態(tài)細(xì)胞上，37℃條件下倒置培養(yǎng)過夜，挑取白色克隆，接入LB液體培養(yǎng)基中37℃過夜振蕩培養(yǎng)，最后采用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，采用通用引物M13正向和反向引物擴(kuò)增驗(yàn)證后，陽性質(zhì)粒送交北京擎科生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.6 SCAR引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增

基于特異性片段的序列測(cè)定結(jié)果，采用Primer 5軟件設(shè)計(jì)一對(duì)SCAR特異性引物 (Tv－F和Tv－R)。PCR反應(yīng)體系設(shè)定為20 μL，其中2×Taq10 Master Mix為10 μL，上游引物和下游引物分別為1 μL，DNA 模板為 1 μL，ddH2O 為 7 μL。SCAR－PCR反應(yīng)程序如下:94℃預(yù)變性3 min，之后進(jìn)行35個(gè)循環(huán) (94℃變性1 min，59℃退火45 s，72℃延伸1.5 min)，最后72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)方法同1.4所述。

1.7 SCAR引物的特異性和靈敏性檢驗(yàn)

采用B型煙粉虱、Q型煙粉虱、黑刺粉虱、螺旋粉虱、柑橘粉虱及ZJ－2型煙粉虱作為對(duì)照種，通過上述SCAR擴(kuò)增程序來驗(yàn)證溫室白粉虱該引物對(duì)的特異性。同時(shí)，將單頭溫室白粉虱成蟲的基因組DNA提取之后，采用ND－2000C測(cè)定基因組DNA的濃度，然后對(duì)該DNA依次進(jìn)行10倍梯度稀釋，以不同濃度 DNA為模板，檢驗(yàn)該SCAR引物擴(kuò)增的靈敏性。每個(gè)濃度分別檢測(cè)10頭個(gè)體。

1.8 SCAR引物對(duì)田間種群的驗(yàn)證

對(duì)2011年度采集自云南、山西、山東、吉林、甘肅、青海6個(gè)地區(qū)的粉虱類害蟲，采用形態(tài)法、復(fù)眼鏡法 (褚棟等，2008)鑒定為溫室白粉虱種群。采用設(shè)計(jì)的SCAR引物對(duì)這些種群的DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，驗(yàn)證引物對(duì)擴(kuò)增田間種群的特異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 RAPD擴(kuò)增及SCAR引物設(shè)計(jì)

在60條引物的RAPD隨機(jī)擴(kuò)增中，引物OPA－17對(duì)溫室白粉虱表現(xiàn)出很強(qiáng)的種的特異性，一條600 bp左右的DNA條帶在溫室白粉虱的DNA擴(kuò)增的凝膠圖譜中出現(xiàn)，且該特異性條帶很亮，且在檢測(cè)的24頭不同個(gè)體中均穩(wěn)定出現(xiàn)，重復(fù)性強(qiáng)，而在其他煙粉虱生物型或者其它粉虱種類中均未出現(xiàn)。圖1顯示了OPA－17對(duì)溫室白粉虱、B型煙粉虱和Q型煙粉虱的隨機(jī)擴(kuò)增圖譜。

圖1 引物OPA－17對(duì)不同粉虱類害蟲的RAPD擴(kuò)增圖譜Fig.1 RAPD amplification profiles of the different whitefly species with primer OPA－17

將溫室白粉虱的特異性序列進(jìn)行回收、克隆后進(jìn)行序列測(cè)定。序列測(cè)定結(jié)果表明溫室白粉虱的特異性擴(kuò)增片段長度為620 bp，GenBank登錄號(hào)為JQ690764。該基因序列在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)，未發(fā)現(xiàn)任何和該基因片段具有較高相似性的序列，說明該片段特異性很強(qiáng)。根據(jù)此測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)一對(duì)SCAR引物，上游和下游引物序列分別為:Tv－F(5'－TGA CCC ACA GAC AGA GTA－3')和 Tv－R(5'－CGA AAT CGC TGA CTA AAT－3')，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為412 bp。

2.2 SCAR引物特異性和靈敏度檢驗(yàn)

采用我們?cè)O(shè)計(jì)的特異性SCAR引物對(duì)溫室白粉虱種群進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)以其它煙粉虱不同生物型或者其它粉虱種類作為對(duì)照種群，發(fā)現(xiàn)僅在溫室白粉虱中出現(xiàn)了一條412 bp的特異性條帶，而在作為對(duì)照的其它粉虱種類或煙粉虱生物型中均未出現(xiàn)任何條帶 (圖2)，隨后我們對(duì)該條帶回收克隆測(cè)序，發(fā)現(xiàn)與由RAPD擴(kuò)增到的特異性條帶中的對(duì)應(yīng)片段序列完全一致。經(jīng)ND－2000C測(cè)定，提取的單頭溫室白粉虱成蟲的基因組DNA濃度為5.3 ng/μL，依次進(jìn)行10倍梯度稀釋之后，發(fā)現(xiàn)DNA模板稀釋103倍時(shí)，仍可觀察到清晰的條帶，稀釋104～106倍時(shí)仍可觀察到擴(kuò)增條帶，但很微弱，稀釋107倍時(shí)完全不能擴(kuò)增到預(yù)期條帶(圖3)，表明該SCAR引物對(duì)具有很高的擴(kuò)增靈敏度，可以從皮克級(jí)濃度的基因組DNA中擴(kuò)增到預(yù)期條帶。

圖2 SCAR引物對(duì)溫室白粉虱及近緣種屬粉虱的SCAR－PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Amplification results of Trialeurodes vaporariorum and its related species using SCAR primers

圖3 SCAR引物對(duì)單頭溫室白粉虱成蟲DNA及其不同濃度下擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 Amplification results of single genomic DNA of Trialeurodes vaporariorum adult with different concentration

2.3 SCAR引物擴(kuò)增田間溫室白粉虱種群的特異性檢驗(yàn)

為了驗(yàn)證該SACR引物對(duì)溫室白粉虱田間種群鑒定的特異性和有效性，我們對(duì)采自云南、山西、山東、吉林、甘肅和青海田間的溫室白粉虱種群進(jìn)行SCAR擴(kuò)增檢驗(yàn)，結(jié)果表明在上述各地區(qū)的每頭成蟲試蟲中均出現(xiàn)了預(yù)期的412 bp的DNA片段，而水為模板的陰性對(duì)照中無任何條帶 (圖4)，說明所設(shè)計(jì)的溫室白粉虱SCAR引物對(duì)于田間種群同樣具有很強(qiáng)的擴(kuò)增有效性，可用于田間種群的驗(yàn)證和檢測(cè)。

3 結(jié)論與討論

圖4 溫室白粉虱SCAR引物對(duì)田間不同地區(qū)溫室白粉虱種群的擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 Amplification patterns of Trialeurodes vaporariorumcollected from different regions using SCAR primers

溫室白粉虱與煙粉虱都是世界范圍的災(zāi)害性害蟲，但由于兩種粉虱類害蟲的外形極為相似，寄主重疊、危害習(xí)性相似，生活史相近，且同域混合發(fā)生，隨著田間煙粉虱生物型逐漸由B型轉(zhuǎn)變?yōu)镼型為主，而煙粉虱的耐藥性遠(yuǎn)高于溫室白粉虱，因此明確二者在田間混合發(fā)生時(shí)的優(yōu)勢(shì)種類對(duì)于害蟲的針對(duì)性防治具有重要的意義。隨著分子生物學(xué)發(fā)展，害蟲不同種類的分子鑒定技術(shù)日益得到關(guān)注和發(fā)展。由RAPD擴(kuò)增出的特異性條帶轉(zhuǎn)化而來的SCAR標(biāo)記是一種十分穩(wěn)定的分子標(biāo)記，在應(yīng)用上具有操作簡(jiǎn)便快捷，結(jié)果可靠穩(wěn)定性高且價(jià)格低廉等特點(diǎn) (Kiran et al.，2010;Gupta et al.，2010;Cirillo et al.，2012)。近年來該項(xiàng)技術(shù)不斷被應(yīng)用于農(nóng)業(yè)重要害蟲種的特異性檢測(cè)中 (孟祥欽等，2010;張桂芬等，2010;Kang et al.，2012;Zhao and Wu，2012)。

本研究篩選出來的溫室白粉虱的SCAR分子標(biāo)記特異性很強(qiáng)，可以將溫室白粉虱與我國常見的其他粉虱種類區(qū)分開來，如B型煙粉虱、Q型煙粉虱、浙江土著煙粉虱、黑刺粉虱、螺旋粉虱和桔綠粉虱等 (圖2)。而且，該SCAR標(biāo)記的靈敏度高，可以在單頭溫室白粉虱成蟲的基因組DNA濃度為5.3 ng/μL時(shí)稀釋1000倍后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，仍能成功檢出很強(qiáng)的、單一的預(yù)期特異性條帶 (圖3)，說明該SCAR引物可成功地從皮克級(jí)別的DNA樣品中檢測(cè)出溫室白粉虱的存在，這樣，在所采集樣品缺乏完整性或者少量存在時(shí)，也具有檢測(cè)的可行性，尤其是對(duì)于篩選可以捕食溫室白粉虱的天敵昆蟲時(shí)具有更重要的意義。同時(shí)，本研究中設(shè)計(jì)的SCAR標(biāo)記對(duì)于檢測(cè)室內(nèi)及田間的溫室白粉虱種群均表現(xiàn)出很強(qiáng)的特異性和適用性(圖4)，因此可直接用于田間溫室白粉虱種群的檢測(cè)。雖然褚棟等 (2004)提出一種用重復(fù)序列擴(kuò)增轉(zhuǎn)化而來的SCAR標(biāo)記，用于鑒別煙粉虱和溫室白粉虱，但文中采用的是試蟲群體DNA模板的提取和檢測(cè)方法，而且當(dāng)時(shí)我國僅在云南地區(qū)剛發(fā)現(xiàn)Q型煙粉虱出現(xiàn) (褚棟等，2005)，其余省市田間與溫室白粉虱同域發(fā)生的煙粉虱生物型均為B型。而目前，國內(nèi)大部分地區(qū)Q型煙粉虱已取代B型煙粉虱，成為國內(nèi)的主要的為害生物型 (潘慧鵬等，2010;Pan et al.，2011)，已有文獻(xiàn)中建立的SCAR分子標(biāo)記及煙粉虱其他生物學(xué)鑒定方法對(duì)于B型煙粉虱以外的其它不同生物型及其它近緣的不同粉虱類害蟲的特異性和靈敏度尚不得而知，而本研究結(jié)果全面有效地補(bǔ)充了上述研究中存在的缺陷和不足，且在不同地區(qū)的田間種群中全部得到了驗(yàn)證，穩(wěn)定性很強(qiáng)。

本研究中設(shè)計(jì)的SCAR引物分析譜帶單一，特異性強(qiáng)，價(jià)格低廉，操作簡(jiǎn)單，非專業(yè)人士也便于操作，對(duì)于樣品的保存及完整性要求不高，非常適宜應(yīng)用于定性檢測(cè)，該技術(shù)體系的建立，對(duì)溫室白粉虱的快速識(shí)別、及時(shí)檢測(cè)與監(jiān)測(cè)、針對(duì)性治理及對(duì)可能發(fā)生的外來入侵性煙粉虱害蟲的及時(shí)預(yù)警和發(fā)現(xiàn)等均具有重要意義。然而，實(shí)際檢測(cè)驗(yàn)證過程中所涉及的煙粉虱種類較多，該SCAR引物對(duì)國外的粉虱類害蟲的特異性還有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。孟祥欽等 (2010)篩選出一對(duì)西花薊馬的特異性SCAR分子標(biāo)記，該對(duì)引物不僅對(duì)不同蟲態(tài)的西花薊馬具有擴(kuò)增能力，而且在西花薊馬的寄主植物組織內(nèi)亦能檢測(cè)到了其卵的存在，而粉虱類害蟲把卵也產(chǎn)在葉片組織內(nèi)，該SCAR特異性引物由于其較高的擴(kuò)增靈敏性，因此也可能對(duì)溫室白粉虱的不同蟲態(tài)、寄主植物組織以及捕食該粉虱害蟲的天敵昆蟲具有特異性檢測(cè)能力，但這需要進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。

References)

Alessandra C，Stefania DG，Giovanni DB，Giovanni G，Umberto G，Marilena C，2012.A new SCAR marker potentially useful to distinguish Italian cattle breeds.Food Chemistry，130(1):172－176.

Ben－David T，Melamed S，Gerson U，Morin S，2007.ITS2 sequences as barcodes for identifying and analyzing spider mites(Acari:Tetranychidae)．Experimental and Applied Acarology，41:169－181.

Chu D，Wang B，Zhang SH，Tao YL，Liu GX，2008.Rapid differentiation between Bemisia tabaci and Trialeurodes vaporariorum adults by microscopie examination of compound eyes.Entomological Knowledge，45(1):154－155.［褚棟，王斌，張四海，陶云荔，劉國霞，2008.一種快速鑒別煙粉虱與溫室白粉虱成蟲的方法－復(fù)眼鏡檢法.昆蟲知識(shí)，45(1):154－155］

Chu D，Zhang YJ，Cong B，Xu BY，Wu QJ，2004.Developing sequence characterized amplified regions(SCARs)to identify Bemisia tabaci and Trialeurodes vaporariorum.Plant Protection，(6):27－30.［褚棟，張友軍，叢斌，徐寶云，吳青君，2004.SCAR分子標(biāo)記鑒別煙粉虱和溫室白粉虱.植物保護(hù)，(6):27－30］

Chu D，Zhang YJ，Cong B，Xu BY，Wu QJ，2005.Identification for Yunnan Q－biotype Bemisia tabaci population.Entomological Knowledge，42:54－56.［褚棟，張友軍，叢斌，徐寶云，吳青君，2005.云南Q型煙粉虱種群的鑒定.昆蟲知識(shí)，42:54－56］

Cirillo A，Del Gaudio S，Di Bernardo G，Galano G，Galderisi U，Cipollaro M，2012.A new SCAR marker potentially useful to distinguish Italian cattle breeds.Food Chemistry，130(1):172－176.

Gupta VK，Sharma R，Jindal V，Dilawari VK，2010.SCAR marker for identification of host plant specific in whitefly，Bemisia tabaci(Genn.)．India Journal of Biotechnology，9(4):360－366.

Hinomoto N，Tran DP，Pham AT，Le TBN，Tajima R，Ohashi K，Osakabe MH，Takafuji A，2007.Identification of spider mites(Acari:Tetranychidae)by DNA sequences:a case study in northern Vietnam.International Journal of Acarology，33(1):53－60.

Jeong G，Kim H，Choi Y，Kim W，Park K，Bae S，Kim J，Choi J，2010.Molecular identification of two Trichogramma species(Hymenoptera:Trichogrammatidae)in Korea.Journal of Asia－Pacific Entomology，13(1):41－44.

Kang SY，Kim YH，Lee HJ，Kim BJ，Lim KJ，Lee SH，2012.Onestep identification of B and Q biotypes of Bemisia tabaci based on intron variation of carboxylesterase 2.Journal of Asia－Pacific Entomology，doi:10.1016/j.aspen.

Kiran U，Khan S，Mirza KJ，Ram M，Abdin MZ，2010.SCAR markers:A potential tool for authentication of herbaldrugs.Fitoterapia，81(8):969－976.

Kirk AA，Lacey LA，Brown JK，Ciomperlik MA，Goolsby JA，Vacek DC，Wendel LE，2000.Napompeth B.variation in the Bemisia tabaci s.1.species complex(Hemiptera:Aleyrodidae)and its natural enemies leading to successful biological control of Bemisia biotype B in the USA.Bulletin of Entomological Research，90:317－327.

Li Y，Jia JZ，Wang TY，1999.Types of molecular markers and their development.Biotechnology Information，15(4):19－22.［黎裕，賈繼增，王天宇，1999.分子標(biāo)記的種類及其發(fā)展.生物技術(shù)通報(bào)，15(4):19－22］

Liu QL，Cai JF，Chang YF，Gu Y，Guo YD，Wang XH，Weng JF，Zhong M，Wang X，Yang L，Wu KL，Lan LM，Wang JF，Chen YQ，2011.Identification of forensically important blow fly species(Diptera:Calliphoridae)in China by mitochondrial cytochrome oxidase I gene differentiation.Insect Science，18(5):554 －564.

Ma WH，Li XC，Timothy JD，Lei CL，Wang M，Benjamin AD，Robert LN，2009.Utility of mtCOI polymerase chain reaction－restriction fragment length polymorphism in differentiating between Q and B whitefly Bemisia tabaci biotypes，Insect Science，16(2):107－114.

Meng XX，Min L，Wan FH，Zhou ZS，Wang WK，Zhang GF，2010.SCAR marker for rapid identification of the western flower thrips，F(xiàn)rankliniella occidentalis(Pergande)(Thysanoptera:Thripidae)．Acta Entomologica Sinica，53(3):323－330.［孟祥欽，閔亮，萬方浩，周忠實(shí)，王文凱，張桂芬，2010.西花薊馬的SCAR分子檢測(cè)技術(shù).昆蟲學(xué)報(bào)，53(3):323－330］

Pan HP，Chu D，Ge DQ，Wang SL，Wu QJ，Xie W，Jiao XG，Liu BM，Yang X，Yang NN，Su Q，Xu BY，Zhang YJ，2011.Further spread of and domination by Bemisia tabaci(Hemiptera:Aleyrodidae)biotype Q on field crops in China.Journal of Economic Entomology，104(3):978－985.

Pan HP，Ge DQ，Wang SL，Wu QJ，Xu BY，Xie W，Zhang YJ，2010.Replacement of B biotype Bemisia tabaci by Q biotype B.tabaci in some areas of Beijing and Hebei.Plant Protection，36(6):40－44.［潘慧鵬，戈大慶，王少麗，吳青君，徐寶云，謝文，張友軍，2010.在北京和河北局部地區(qū)Q型煙粉虱取代了B型煙粉虱.植物保護(hù)，36(6):40－44］

Shi YJ，Zhang MX，Liu JE，Li XY，2011.Studies of non－polluted control technology for Trialeurodes vaporariorum on tomato in protected field in Rizhao city.China Fruit and Vegetable，(2):26－28.［時(shí)玉娟，張明欣，劉加娥，李曉英，2011.日照市保護(hù)地番茄溫室白粉虱無公害防治技術(shù)研究.中國果菜，(2):26－28］

Zhao YE，Wu LP，2012.RAPD－SCAR marker and genetic relationship analysis of three Demodex species(Acari:Demodicidae)．Parasitol Res.，110(6):2395－402.

Zhang GF，Wu X，Guo JY，Liu WX，Peng ZQ，Wan FH，2010.Establishment and application of a SCAR marker for rapid diagnosis of the spiraling whitefly，Aleurodicus dispersus Russell.Acta Phytophylacica Sinica，37(5):385－390.［張桂芬，吳霞，郭建英，劉萬學(xué)，彭正強(qiáng)，萬方浩，2010.螺旋粉虱SCAR標(biāo)記的建立與應(yīng)用.植物保護(hù)學(xué)報(bào)，37(5):385－390］

Zhu GR，Wu QJ，Zhang YJ，Xu BY，2006.Identification and control of two kinds of whiteflies on vegetables.China vegetables，(6):49－51.［朱國仁，吳青君，張友軍，徐寶云，2006.蔬菜上兩種粉虱的識(shí)別與防治.中國蔬菜，(6):49－51］