席焱海，薛敏濤，葉曉健，何海龍

目前臨床上對于結核病灶清除術后的骨組織缺損理想的治療策略就是設計具有促進骨缺損組織修復作用并且同時可以長效緩釋抗結核藥物的人工骨填充緩釋材料，這樣就可以在促進骨組織再生修復骨缺損的同時維持局部有效的抗結核藥物濃度，有助于骨移植物周圍骨組織再生的同時抑制局部結核桿菌的繁殖，從而避免局部結核病灶的復發(fā)，促進患者的康復［1］。本研究將磷酸三鈣生物陶瓷(tricalcium phosphate bioceramics，TPB) 人工骨支架與一定濃度的海藻酸鈉(sodium alginate ，SA) 、氯化鈣水溶液、抗結核藥利福平(rifampicine，RFP) 相混合，利用SA 在鈣離子作用下的自組裝特性制備成TPB/SA-RFP 抗結核藥物微球復合體，并將此復合體分別用聚乳酸(poly lactic acid，PLA) 、PLA 與羥基乙酸共聚物［poly (lactic-co-glycolic acid) ，PLGA］或聚乙內(nèi)酯［poly (ε-caprolactone) ，PCL］進行表面涂層化處理，從而最終制備出交聯(lián)可調(diào)式抗結核藥物緩釋型納米人工骨 TPB/SA-RFP/PLA(PLGA、PCL) 復合體。在對其骨修復活性進行測試之前，分別進行了復MTT 細胞毒性實驗、急性全身毒性實驗、皮內(nèi)刺激實驗及致敏實驗，并與對照組比較，對其生物安全性進行初步測試，以證實其安全可靠。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

TPB/SA-RFP/PLA(PLGA、PCL) 復合體制備：稱取質量百分比濃度為1 mg/mL 的SA 10 g，濃度為0.2%的RFP 5 g，氯化鈣10 g，TPB 50 mg(10 mm×5 mm×5 mm) 加入到500 mL PBS(pH 7.4) 溶液中混合靜止，48 h 后將該混合物取出晾干，然后加入到500 mL 濃度為5 mg/mL 的氯化鈣水溶液中1 min，即可制得TPB/SA-RFP 抗結核藥物微球復合體。然后將TPB/SA-RFP 抗結核藥物微球復合體和質量百分比濃度為5%的PLA、PLGA 或PCL 浸入500 mL的氯仿溶液中2 h，最后將其取出烘干，揮發(fā)除去溶劑，即可得到實驗材料。

1.2 實驗方法

1.2.1 TPB/SA-RFP/PLA(PLGA、PCL) 復合體MTT 細胞毒性的測定

制備實驗用浸提液。以MC-3T3 為實驗細胞，分別測定陰性對照組(單純TPB) 、陽性對照組(RFP 直接給藥) 、實驗組［TPB/SA-RFP/PLA(PLGA、PCL) 復合體］對MC-3T3 的毒性。用α-MEM 培養(yǎng)基在37℃、5% CO2環(huán)境下按材料表面積/溶液量(cm2/mL) =2.0(ISO 標準：0.5～6.0 cm2/mL) 的比例對各組材料進行浸提72 h，之后收集原始浸提液，然后用0.2 μm的微孔濾膜過濾除菌。以α-MEM 培養(yǎng)基作為稀釋液，將浸提液按比例逐步稀釋至實驗所需濃度(RFP 濃度) ，作為實驗用浸提液。各組RFP 濃度為：陰性對照組不含RFP;陽性對照組RFP 濃度有3 種，10 μg/mL、20 μg/mL 和40 μg/mL;實驗組3 種材料所含RFP 濃度均為1 mg/mL。

培養(yǎng)MC-3T3-E1 細胞(以上各組細胞培養(yǎng)制備過程相同) 。在50 mL α-MEM 培養(yǎng)液中培養(yǎng)MC-3T3-E1 細胞，待細胞長成單層后傳代，棄去培養(yǎng)液，加入0.25%的胰酶消化液，在37℃消化1～2 min，加入少量的α-MEM 培養(yǎng)液，反復吹打，使細胞分散均勻，制成細胞懸液，種植到96 孔板中培養(yǎng)24 h后移除培養(yǎng)基備用。

測量吸光度，計算細胞存活率。取50 μL 實驗用浸提液及50 μL 的α-MEM 培養(yǎng)基加入MC-3T3-E1 細胞作為a 組;取100 μL 的α-MEM 培養(yǎng)基不加入浸提液及細胞作為b 組; 取100 μL 的α-MEM 培養(yǎng)基不加入浸提液直接加入MC-3T3-E1 細胞作為c組。本步驟中的3 組在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)7 d后，每孔加入20 μL的MTT 試劑，反應4 h 后每孔加入100 μL DMSO，反應10 min 后置入到酶標儀中，在490 nm 波長下檢測每孔的吸光度(A) ，每個標本重復6 次。計算活細胞的存活率(survival rate，SR) ，SR=(Aa-Ab) /(Ac-Ab) ×100%。最后轉化為相應的細胞毒性等級，標準為：0 級為≥100%;1 級為≥75%且＜100%; 2 級為≥50%且＜75%; 3 級為≥25%且＜50%;4 級為＞0%且＜25%;5 級為≤0%。

1.2.2 致敏實驗

選擇健康成年豚鼠19 只，其中實驗組9 只，陰性、陽性對照組各5 只，體重300～360 g。事先將1 g復合材料于生理鹽水中浸提72 h(37℃) ，獲材料浸液備用。實驗組在每只動物兩側肩胛骨內(nèi)緣處皮內(nèi)注射浸取液0.1 mL; 陰性對照組注射生理鹽水0.1 mL;陽性對照組注射2%二硝基氟苯0.1 mL。于注射完成即刻、注射后24 h、48 h 和72 h 觀察皮膚反應(見表1) 。陽性反應的動物數(shù)＞30%判定受試物為變態(tài)反應陽性。

表1 皮膚反應分類標準Tab.1 Skin reaction classification criteria

1.2.3 原發(fā)性皮膚刺激實驗

選擇健康新西蘭兔6 只，雌雄各3 只，體重2.0～2.5 kg。實驗前于兔脊柱兩側各選2 個面積為3 cm×3 cm 的備皮區(qū)(共12 片，6 片實驗組，3 片陽性對照組，3 片陰性對照組) ，間距10 cm。實驗前24 h 用8%的硫化鈉溶液脫毛。事先將1 g 復合材料制備成浸提液(同致敏實驗) 。濾紙充分吸附復合材料的浸提液至飽和，貼敷于消毒后的實驗部位;使用生理鹽水浸提后作為陰性對照;3.5%甲醛溶液作為陽性對照。固定貼敷24 h 后，移去貼敷物，用溫水清潔貼敷區(qū)并吸干，觀察移去貼敷物后24 h、48 h和72 h 皮膚的紅斑及水腫情況。計算原發(fā)刺激指數(shù)(primary stimulus index，PSI) ，參考表1 進行記分并評價。具體方法為：PSI =(24 h、48 h 和72 h 的紅斑、水腫總分) /注射點總數(shù)。＜0.5 分為無刺激;≥0.5 且＜2.0 分為輕度刺激;≥2.0 且＜5.0分為中度刺激; ＞5.0 且≤8.0 分為強刺激。

1.2.4 皮內(nèi)刺激實驗

采用健康新西蘭兔4 只，雌雄各2 只，體重2.0～2.5 kg。事先將1g 復合材料復合材料制備成浸提液(同致敏實驗) 。實驗前24 h 用8%的硫化鈉溶液將兔脊柱兩側各5 cm×25 cm 區(qū)域脫毛。實驗動物脊柱兩側旁開2.5 cm 縱線上各取10 個皮內(nèi)注射點，每點間距2 cm。一側注射復合材料浸提液0.2 mL，另一側注射生理鹽水0.2 mL 作為對照。注射后即刻、24 h、48 h 和72 h 觀察局部及周圍皮膚組織反應，并按表1 所列標準進行記分，再根據(jù)記分結果推算PSI 和平均原發(fā)刺激指數(shù)(average primary stimulus index，APSI) ，APSI =所有動物PSI 總和/動物數(shù)。

1.2.5 急性全身毒性實驗

采用健康小鼠16 只，雌雄各8 只，體重為150～200 g。將動物隨機分為實驗材料組和對照組，每組8 只。實驗組動物由尾靜脈注射復合材料生理鹽水浸提液(制備過程同致敏實驗) ，劑量為50 mL/kg。對照組動物由尾靜脈注射的生理鹽水，劑量為50 mL/kg。于注射后24 h、48 h 和72 h 觀察所有動物的一般情況、中毒表現(xiàn)和死亡數(shù)量，并作記錄。實驗組和對照組小鼠如出現(xiàn)中毒表現(xiàn)則根據(jù)其癥狀程度記為無中毒、輕度中毒(輕度異常，但無運動減少、呼吸困難或腹部刺激癥狀) 、明顯中毒(有腹部刺激癥、運動減少、呼吸困難、眼瞼下垂、腹瀉等，體重通常下降至15～17 g) 、重度中毒(嚴重腹部刺激癥狀、發(fā)紺、震顫、衰竭、眼瞼下垂、呼吸困難等，體重減輕至＜15g) 和死亡。根據(jù)觀察結果作出評價。

2 結 果

2.1 MTT 細胞毒性實驗

MTT 細胞毒性實驗結果見圖1。陰性對照組7 d內(nèi)的生存率為100%，陽性對照組7 d 內(nèi)細胞存活率明顯比實驗組要低，其中PLA 為最佳的涂層材料。各浸提液濃度下，各樣品組分別與陰性對照組兩兩比較差異均無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05) 。細胞毒性等級：陰性對照組0 級; 實驗組1 級; 陽性對照組1 級。

圖1 MTT 細胞毒性實驗結果Fig.1 MTT cytotoxicity results

2.2 致敏實驗

3 組通過觀察動物在歷經(jīng)皮內(nèi)誘導、局部誘導和全身激發(fā)3 個階段后，實驗組動物皮膚反應與陰性對照組相同，未見動物出現(xiàn)過敏反應;陽性對照組動物全部出現(xiàn)過敏反應。

2.3 原發(fā)性皮膚刺激實驗

TPB/SA-RFP/PLA(PLGA、PCL) 復合體浸提液貼敷家兔皮膚未見紅斑，無水腫形成，說明該材料對家兔皮膚無刺激性(見表2) 。

表2 原發(fā)性皮膚刺激實驗結果Tab.2 Primary skin irritation test results

2.4 皮內(nèi)刺激實驗

TPB/SA-RFP/PLA(PLGA、PCL) 復合材料的浸取液背部皮內(nèi)注射后，在24 h、48 h 和72 h 均未發(fā)現(xiàn)局部出現(xiàn)嚴重皮內(nèi)反應，基本為無紅斑或微弱紅斑，少數(shù)有微弱水腫。對各個時間段結果進行記分，計算出PSI(見表3) ，并計算出APSI 為0.40。

2.5 急性全身毒性實驗

TPB/SA-RFP/PLA(PLGA、PCL) 復合材料的浸取液經(jīng)小鼠尾靜脈注射后24 h、48 h、72 h 進行觀察，實驗動物一般活動良好，生命體征正常，無急性反應甚至死亡等發(fā)生(見表4) 。延長觀察時間至2周，小鼠未見明顯異常。對照組小鼠同樣無不良反應出現(xiàn)。

表3 皮內(nèi)刺激實驗結果Tab.3 Intracutaneous reactivity test results

表4 急性全身毒性實驗結果Tab.4 Acute systemic toxicity test results

3 討 論

SA 是一種具有藥物制劑輔料所需的穩(wěn)定性、溶解性、粘性和安全性的天然有機高分子化合物，能夠作為釋放和包埋RFP 等藥物的載體，并被證實安全有效［2］。PLA、PLGA 及PCL 是典型的合成類可完全降解的高分子有機材料，其降解速度還與組織細胞的生長速度相適應，而且降解產(chǎn)物可參加體內(nèi)循環(huán)，最終以CO2和水的形式排出體外，對機體和環(huán)境無害，因此具有可靠的生物安全性，并且其具有良好的生物力學性能及易于加工成形等優(yōu)點，目前已廣泛用于生物醫(yī)用材料中［3］。本研究將上述材料復合加工并載入抗結核藥物RFP，制作成交聯(lián)可調(diào)式抗結核藥物緩釋型納米人工骨TPB/SA-RFP/PLA(PLGA、PCL) 復合體，其呈多孔結構、大小均勻、排列有序，有較低的結晶度，在體內(nèi)更易降解，該材料具有更好的化學穩(wěn)定性?？紤]人工骨復合材料屬于置入性生物材料，在體內(nèi)存留時間長，所用材料的安全性如何，是否對人體具有毒性、致癌致病性、致畸性或其他潛在危害，是必須關注的問題。一種醫(yī)用材料在正式投入生物體研究或臨床應用前，必須依照國家有關標準［4］，對其進行生物安全性評價。

生物安全性評價包括體外測試和體內(nèi)實驗。前者一般是以材料的浸提液為對象，測試其對組織細胞增殖、生長、分化等活動的影響，以MTT 細胞毒性實驗為代表［5］。這一方法被廣泛應用于細胞增殖和細胞毒性的檢測，目前己成為生物材料和醫(yī)療器械生物評價體系中最重要的指標之一，它能在短期內(nèi)檢出受試品對細胞新陳代謝的影響，對毒性物質有較高的敏感性。體內(nèi)實驗包括致敏實驗、原發(fā)性皮膚刺激實驗、皮內(nèi)刺激實驗、急性全身毒性實驗等，其中原發(fā)性皮膚刺激、皮內(nèi)刺激實驗可評價復合材料中可濾過性物質的毒性作用。由于生物材料中許多雜質對免疫系統(tǒng)的干擾劑量常低于其中毒劑量，這些實驗在雜質含量低、中毒癥狀不出現(xiàn)之前就可以誘出免疫反應癥狀。致敏實驗用于評價復合材料中是否具有潛在過敏原。急性全身毒性實驗是常選的生物學性能測試方法之一，國際標準化組織和我國國家標準［4-5］(GB16175) 都規(guī)定了相應的實驗方法。

本實驗研究結果表明實驗組7 d 生存率較陰性對照組稍低，但明顯高于陽性對照組，由此可以得出TPB/SA-RFP/PLA(PLGA、PCL) 復合體具有良好的的生物相容性，說明復合材料中除RFP 外的主體物質及輔料(如固化液等) 成分無毒性，并且通過材料合成后甚至能夠降低RFP 所產(chǎn)生的毒性。體內(nèi)實驗結果表明本實驗材料無毒性，無致敏性。

因此，交聯(lián)可調(diào)式抗結核藥物緩釋型納米人工骨TPB/SA-RFP/PLA(PLGA、PCL) 無MTT 細胞毒性，細胞相容性良好，并能夠降低RFP 直接給藥的生物毒性，不引起全身毒性反應、皮膚/皮內(nèi)刺激反應和急性過敏反應。

［1］伍衛(wèi)剛，鄭啟新，郭曉冬.利福平-異煙肼-控釋型載藥人工骨的實驗研究［J］.中國生物醫(yī)學工程學報，2010，1(1) ：137-143.

［2］肖海軍，薛鋒，何志敏，等.納米羥基磷灰石/羧甲基殼聚糖-海藻酸鈉復合骨水泥的性能［J］.中國組織工程研究與臨床康復，2011，15(38) ：7113-7117.

［3］季航宇，潘功茂，謝友揚，等.影像學測量鎖骨與周圍血管毗鄰關系：置釘?shù)陌踩珔^(qū)和危險區(qū)［J］.中國組織工程研究，2012，16(9) ：1593-1596.

［4］中國標準出版社第一編輯室.GB/T16175-1996 醫(yī)用有機硅材料生物學評價試驗方法［M］.北京：中國標準出版社，2003：9-16.

［5］Srivastava S，Gorham SD，Courtney JM.Screening of in vitro cytotoxicity by the adhesive film test［J］.Biomaterials，1990，11(2) ：133-137.