劉春雨，彭寶淦，高春華，金 麗

亞甲藍(lán)作為一種氧化還原劑，臨床上曾廣泛用于高鐵血紅蛋白血癥和氰化物中毒的解毒藥物，但亞甲藍(lán)可用于神經(jīng)阻滯近年來也為人們所關(guān)注。有關(guān)亞甲藍(lán)的止痛作用機(jī)制，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為亞甲藍(lán)是一種鳥苷酸環(huán)化酶抑制劑，可通過影響脊髓內(nèi)的一氧化氮/ 環(huán)鳥核糖單磷酸鹽系統(tǒng)(NO2cGMP)的興奮性起阻斷痛覺傳導(dǎo)的作用，而非通過損害神經(jīng)髓質(zhì)來實(shí)現(xiàn)［1］。還有學(xué)者認(rèn)為亞甲藍(lán)為受氫體，其色素受氫后使無髓鞘神經(jīng)纖維著色，從而阻止了感覺神經(jīng)的傳導(dǎo)，加之其參與糖代謝，能促進(jìn)丙酮的繼續(xù)氧化，改善神經(jīng)阻滯，達(dá)到止痛目的［2］。所以亞甲藍(lán)能滅活長入椎間盤內(nèi)的神經(jīng)末梢或傷害感受器，就能打斷椎間盤源性疼痛的傳導(dǎo)通路［3］。但將亞甲藍(lán)應(yīng)用在硬脊膜外腔的安全性尚需進(jìn)一步探討。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察亞甲藍(lán)從小劑量到大劑量在不同時(shí)間段內(nèi)對硬脊膜的急性、亞急性反應(yīng)，為臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本次實(shí)驗(yàn)以正常5 月齡120 只清潔級Wistar 大鼠(北京科宇動(dòng)物養(yǎng)殖中心提供)為實(shí)驗(yàn)對象，雌雄不限，體重為240～260 g。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，120 只納入實(shí)驗(yàn)研究的Wistar 大鼠在年齡、體重等方面的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。

1.2 實(shí)驗(yàn)主要儀器及試劑

①VC-10(日本光電生物電放大器BP)，中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心提供;②微量注射泵SEN-3201，中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心提供;③電刺激器(BS)，中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心提供;④隔離器，中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心提供;⑤MED1401 Spike-Ⅱ(英國CED 公司)，中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心提供;⑥生物電信號采樣分析系統(tǒng)，中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心提供。

1.3 主要試劑

①亞甲藍(lán)注射液，山東華魯制藥有限公司，批號201106121;②青霉素鈉注射液，哈藥集團(tuán)制藥總廠，批號A2920118734;③利多卡因注射液，北京制華天制藥集團(tuán)總廠，批號CS345176332;④速眠新注射液，中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心提供，批號57890456。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法及分組

120 只大鼠隨機(jī)平均分為5 組，包括空白對照組、生理鹽水對照組、1%亞甲藍(lán)0.2 mL 組、1 mL 組和2 mL 組，每組24 只。5 組均包括4 個(gè)監(jiān)測時(shí)間點(diǎn)(30 min、2 h、24 h 及72 h)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)6 只。

分別用速眠新注射液腹腔注射麻醉，4 mL/kg。行氣管插管，大鼠俯臥位，暴露L3/L4/L5節(jié)段，切除棘突及椎板，顯微鏡下充分暴露L3/L4/L5脊髓硬膜外腔及神經(jīng)根，手術(shù)中避免損傷脊髓及神經(jīng)根，如不慎將脊髓及神經(jīng)根損傷的不納入本實(shí)驗(yàn)各組列中。在硬膜外腔及神經(jīng)根處注入相應(yīng)注射液。記錄各組各時(shí)間點(diǎn)L3～5神經(jīng)根誘發(fā)電位幅度、潛伏期、閾值變化。用于監(jiān)測注射后24 h 和72 h 2 個(gè)時(shí)間點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在第1 次麻醉暴露腰椎相應(yīng)節(jié)段后給藥，用青霉素鈉沖洗切口抗感染，然后逐層縫合切口，繼續(xù)飼養(yǎng)，恒溫保暖，供食供水，待到實(shí)驗(yàn)組相應(yīng)時(shí)間段后再次麻醉給行電生理上述各指標(biāo)檢測。4 個(gè)時(shí)間段分別在立體定位儀固定，拉起皮瓣，縫制油槽，內(nèi)充37°C 左右的液體石蠟油以防干燥。分別在大鼠的雙側(cè)L3～5后根神經(jīng)節(jié)近神經(jīng)纖維懸掛于雙極鉑金絲電極上，電刺激大鼠坐骨神經(jīng)，接地電極均置于皮下，分別記錄雙側(cè)L3/L4/L5脊神經(jīng)節(jié)誘發(fā)電位幅度、潛伏期、閾值的變化。刺激參數(shù):刺激時(shí)采用單個(gè)方波電刺激，延遲10 ms;持續(xù)時(shí)間1 ms。刺激開始時(shí)調(diào)整隔離器的旋鈕由大到小，當(dāng)動(dòng)作電位出現(xiàn)時(shí)加大刺激強(qiáng)度至1.5 倍閾值刺激持續(xù)10 s。每次刺激間隔時(shí)間不少于5 min，刺激3 次取平均值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 誘發(fā)電位幅度

空白組、鹽水對照組、亞甲藍(lán)0.2 mL 組、亞甲藍(lán)1 mL 組、亞甲藍(lán)2 mL 組在30 min、2 h、24 h、72 h 內(nèi)所引起脊髓L3～5脊神經(jīng)根誘發(fā)電位幅度指標(biāo)各組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05，見表1～3)。

2.2 誘發(fā)電位潛伏期

空白組、鹽水對照組、亞甲藍(lán)0.2 mL 組、亞甲藍(lán)1 mL組、亞甲藍(lán)2 mL 組在30 min、2 h、24 h、72 h 內(nèi)引起脊髓L3～5脊神經(jīng)根誘發(fā)電位潛伏期指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05，見表4～6)。

2.3 誘發(fā)電位閾值

空白組、鹽水對照組、亞甲藍(lán)0.2 mL 組、亞甲藍(lán)1 mL組、亞甲藍(lán)2 mL 組在30 min、2 h、24 h、72 h 內(nèi)引起脊髓L3～5脊神經(jīng)根誘發(fā)電位閾值指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05，見表7～9)。

表1 亞甲藍(lán)溶液對大鼠脊髓及L3 脊神經(jīng)根誘發(fā)電位幅度影響Tab.1 Effect of methylene blue solution on evoked potential amplitude of spinal cord and L3 spinal nerves in rat

表2 亞甲藍(lán)溶液對大鼠脊髓L4 脊神經(jīng)根誘發(fā)電位幅度影響Tab.2 Effect of methylene blue solution on evoked potential amplitude of spinal cord and L4 spinal nerves in rat

表4 亞甲藍(lán)溶液對大鼠脊髓L3 脊神經(jīng)根誘發(fā)電位潛伏期影響Tab.4 Effect of methylene blue solution on evoked potential latency of spinal cord and L3 spinal nerves in rat

表5 亞甲藍(lán)溶液對大鼠脊髓L4 脊神經(jīng)根誘發(fā)電位潛伏期影響Tab.5 Effect of methylene blue solution on evoked potential latency of spinal cord and L4 spinal nerves in rat

表6 亞甲藍(lán)溶液對大鼠脊髓L5 脊神經(jīng)根誘發(fā)電位潛伏期的影響Tab.6 Effect of methylene blue solution on evoked potential latency of spinal cord and L5 spinal nerves in rat

表7 亞甲藍(lán)溶液對大鼠脊髓L3 脊神經(jīng)根誘發(fā)電位閾值的影響Tab.7 Effect of methylene blue solution on evoked potential threshold value of spinal cord and L3 spinal nerves in rat

表8 亞甲藍(lán)溶液對大鼠脊髓L4 脊神經(jīng)根誘發(fā)電位閾值的影響Tab.8 Effect about Methylene blue solution on the evoked potential Threshold value of spinal cord and L4 spinal nerves in rat

表9 亞甲藍(lán)溶液對大鼠脊髓L5 脊神經(jīng)根誘發(fā)電位閾值的影響Tab.9 Effect about Methylene blue solution on the evoked potential Threshold value of spinal cord and L5 spinal nerves in rat

3 討 論

亞甲藍(lán)為強(qiáng)氧化的還原劑，在體內(nèi)的不同濃度變化會(huì)使其效果也有不同的作用。亞甲藍(lán)對血紅蛋白來說就有2 種不同的作用。首先亞甲藍(lán)在低濃度時(shí)6-磷酸-葡萄糖脫氫過程中的氫離子經(jīng)還原型三磷酸吡啶核苷傳遞給亞甲藍(lán)，使其轉(zhuǎn)變?yōu)檫€原型的白色亞甲藍(lán);白色亞甲藍(lán)又將氫離子傳遞給帶Fe3+的高鐵血紅蛋白，使其還原為帶Fe2+的正常血紅蛋白，而白色亞甲藍(lán)又被氧化為亞甲藍(lán)。亞甲藍(lán)的還原-氧化過程可反復(fù)進(jìn)行。其次亞甲藍(lán)在高濃度時(shí)，亞甲藍(lán)不能被完全還原為白色亞甲藍(lán)，因而起氧化作用，將正常血紅蛋白氧化為高鐵血紅蛋白。由于高鐵血紅蛋白易與CN-結(jié)合形成氰化高鐵血紅蛋白，但數(shù)分鐘后二者又離解，故僅能暫時(shí)抑制CN-對組織中毒的毒性。

自從亞甲藍(lán)首次在1876 年合成以來，已用于許多醫(yī)學(xué)領(lǐng)域［4］。除其他作用外，它還是一種神經(jīng)毀損劑，已成功用于治療皮膚瘙癢癥和急性骨折［5-8］，這種神經(jīng)毀損作用是治療椎間盤源性腰痛的理論依據(jù)。破壞神經(jīng)髓梢，起神經(jīng)阻滯作用。亞甲藍(lán)是一種化學(xué)性質(zhì)活潑的氧化還原劑，與神經(jīng)組織具有良好的親和力，對神經(jīng)產(chǎn)生不同程度的可逆性損害作用，直接阻礙神經(jīng)組織的電傳導(dǎo)，阻斷痛覺傳導(dǎo)，已被廣泛應(yīng)用于治療多種疼痛性疾?。?］。另外，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，亞甲藍(lán)作為鳥苷酸環(huán)化酶抑制劑，通過降低局部組織中的鳥苷酸濃度，阻斷緩激肽誘導(dǎo)的痛覺過敏，表明亞甲藍(lán)可以消除局部組織炎癥引起的痛覺過敏反應(yīng)［10］。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)［11-13］，椎間盤源性腰痛患者病理疼痛椎間盤的特征性改變是沿著由纖維環(huán)外層到髓核的裂隙形成由大量神經(jīng)纖維分布的血管肉芽組織條帶區(qū)。研究清楚地表明，在血管肉芽組織區(qū)域內(nèi)有豐富的P 物質(zhì)陽性神經(jīng)，局部炎癥可能刺激肉芽組織內(nèi)的疼痛感受器而產(chǎn)生疼痛。如果能夠毀滅這些肉芽組織內(nèi)的疼痛感受神經(jīng)纖維和神經(jīng)末梢，椎間盤來源的疼痛可能會(huì)減輕或緩解。

亞甲藍(lán)治療椎間盤源性腰痛時(shí)，亞甲藍(lán)順著髓核到纖維環(huán)外層的裂隙流出，到椎管內(nèi)硬膜外腔后是否會(huì)滲透到脊髓內(nèi)對脊髓神經(jīng)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。研究顯示亞甲藍(lán)注入腰椎硬膜外腔后主要是硬脊膜屏障作用發(fā)揮其功能，1%亞甲藍(lán)無法滲透過硬脊膜屏障。本實(shí)驗(yàn)中的0.2 mL、1 mL、2 mL 的1%亞甲藍(lán)分別注入L3/L4/L5節(jié)段硬膜外腔，在30 min、2 h、24 h、72 h 的時(shí)間段內(nèi)，將L3～5脊神經(jīng)根誘發(fā)電位幅度、潛伏期以及閾值的變化，與正常對照組及鹽水對照組相比無顯著性差異，用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)算相關(guān)統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。由此可推斷1%亞甲藍(lán)對腰椎脊髓及神經(jīng)根傳導(dǎo)功能沒有影響。

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