張立英，劉紹霞#，趙國(guó)強(qiáng)，張國(guó)俊

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科鄭州450052 2)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室鄭州450001

肺間質(zhì)纖維化(pulmonary fibrosis，PF)是多種細(xì)胞因子及其網(wǎng)絡(luò)參與的疾病，以肺組織的慢性炎癥、膠原沉積、肺組織結(jié)構(gòu)重塑和慢性纖維組織增生為病理特征，患者最終可因呼吸功能衰竭而死亡［1］，其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。PF臨床預(yù)后差，特別是特發(fā)肺間質(zhì)纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)，確診后平均存活時(shí)間不超過3～5 a［2-3］。近 年 來(lái) 研 究［4-9］發(fā) 現(xiàn) 轉(zhuǎn) 化 生 長(zhǎng) 因 子-β1(transforming grow factor-β1，TGF-β1)和腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)與肺纖維化的發(fā)生發(fā)展有重要關(guān)系。作者利用RNAi技術(shù)構(gòu)建了靶向TNF-α的siRNA真核表達(dá)載體，并觀察該載體對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞TNF-α和TGF-β1表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 A549細(xì)胞(美國(guó)ATCC公司)，真核表達(dá)載pRNAT-U6.1(美國(guó)GenScript公司)，限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ、HindⅢ(New England Bio Lab公司)，DNA Marker DL2000(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)，T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶、4×dNTP、逆轉(zhuǎn)錄試劑和Real Time PCR試劑(TaKa-Ra公司)，脂質(zhì)體 Limpofectin 2000TM轉(zhuǎn)染試劑盒(Invitrogen公司)，質(zhì)粒提取、質(zhì)粒抽提和DNA膠回收試劑盒(QIAGEN公司)，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco公司)、胰蛋白酶(武漢博士德生物工程有限公司)。凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Syngene公司)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)。

1.2 TNF-α siRNA的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中人TNF-α(NM_000594)序列和 Clontech公司的RNAi Designer軟件，設(shè)計(jì)出針對(duì)TNF-α的siRNA特異靶序列和無(wú)關(guān)序列，兩端分別加入BamHⅠ、HindⅢ的酶切殘基，將上述2對(duì)序列標(biāo)記為siTNF和si-Con。siTNF-F 序列 為 5’-GATCCGGCAGTCAGAT CATCTTCTTTCAAGAGAAGAAGATGATCTGACTGCC TTTTTTA-3’，siTNF-R 序列為 5’-AGCTTAAAAAAG GCAGTCAGATCATCTTCTTCTCTTGAAAGAAGATGA TCTGACTGCCG-3’;siCon-F 序 列 為 5’-GATCCT TCTCCGAACGTCGCACGTTTCAAGAGAACGTGACAC GTTCGGAGAATTTTTTA-3’，siCon-R 序 列 為 5’-AGCTTAAAAAATTCTCCGAACGTCGCACGTTCTCTTG AAACGTGACACGTTCGGAGAAG-3’。均由博尚生物有限公司合成。

1.3 TNF-α siRNA真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定將siTNF和siCon退火成雙鏈，分別重組入載體pRNAT-U6.1，構(gòu)建成 pRNAT-U6.1-siTNF-α 和 pRNATU6.1-siCon重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選氨芐青霉素抗性克隆，用PCR鑒定后進(jìn)行DNA測(cè)序。

1.4 A549細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 將A549細(xì)胞置于DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)后鋪于6孔板中，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80%左右融合時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分別將脂質(zhì)體與pRNAT-U6.1-siTNF-α(siTNF-α 組)、pRNAT-U6.1-si-Con(siCon對(duì)照組)和 pRNAT-U6.1(pRNAT對(duì)照組)質(zhì)粒DNA按體積比為1∶3混合，另設(shè)未轉(zhuǎn)染對(duì)照組，室溫30 min形成DNA脂質(zhì)體復(fù)合物，分別將轉(zhuǎn)染液鋪于6孔板中，6 h后換液，48 h后熒光拍照觀察轉(zhuǎn)染情況，收集細(xì)胞置于－80℃冰箱備用。每組各設(shè)4個(gè)復(fù)孔。

1.5 A549 細(xì)胞 TNF-α 和 TGF-β1 mRNA 的 Real time PCR檢測(cè) 取收集的細(xì)胞，用RNA提取試劑盒提取總RNA，以其為模板，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，分別以TNF-α、TGF-β1和GAPDH上下游引物行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件:95℃5 min預(yù)變性;95℃50 s變性，56℃ 50 s，72℃ 60 s，共循環(huán) 30次;72℃延伸 5 min。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，記錄各CT值，換算成基因拷貝數(shù)，以 TNF-α、TGF-β1與 GAPDH 基因拷貝數(shù)的比值作為其相對(duì)表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 Real time PCR引物序列

1.6 A549 細(xì)胞 TNF-α 和 TGF-β1 蛋白表達(dá)的Western blot法檢測(cè) 取收集的細(xì)胞適量，用預(yù)冷的PBS漂洗3次，離心收集細(xì)胞，加入裂解液反復(fù)吹打。將所得樣品在水浴中用超聲細(xì)胞破碎儀處理，至溶液清澈無(wú)黏稠，離心取上清，按體積比1∶1加入樣品緩沖液，強(qiáng)力混勻，水浴、離心，取上清。然后經(jīng)過電泳、轉(zhuǎn)膜、雜交，鑒定膜上的特定蛋白，顯色拍照。結(jié)果用UMAX掃描儀Magic Scan成像系統(tǒng)采集圖像。以GAPDH為內(nèi)參，用Band scan軟件進(jìn)行分析，以目的基因與內(nèi)參條帶灰度值的比值代表達(dá)水平，每組均設(shè)4個(gè)平行對(duì)照。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0進(jìn)行分析，應(yīng)用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)比較各組細(xì)胞中TNF-α和TGF-β1 mRNA和蛋白表達(dá)的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn) α =0.05。

2 結(jié)果

2.1 TNF-α siRNA真核表達(dá)載體的鑒定 siTNF和siCon退火產(chǎn)物均位于100 bp以下，與設(shè)計(jì)一致辭，見圖1。構(gòu)建的真核表達(dá)載體經(jīng)DNA序列測(cè)定，插入序列與設(shè)計(jì)序列完全一致。

圖1 siTNF和siCon退火產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.2 各組 A549 細(xì)胞中 TNF-α、TGF-β1 mRNA 和蛋白的表達(dá) 見圖2、表2。

圖2 各組A549細(xì)胞中TNF-α和TGF-β1蛋白的表達(dá)

表2 各組A549細(xì)胞中TNF-α、TGF-β1 mRNA 和蛋白表達(dá)量的比較

3 討論

有研究［4-5，8］報(bào)道多種細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)在肺部損傷和炎癥后的組織修復(fù)中發(fā)揮重要作用，尤其是肺泡巨噬細(xì)胞(AM)源性細(xì)胞因子，如IL-6、IL-8、TNF-α、單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP)、TGF-β1、血小板源生長(zhǎng)因子(PDGF)等，其中最主要的是 TGF-β1和TNF-α。TGF-β1已是公認(rèn)的致纖維化細(xì)胞因子，分泌過多時(shí)可啟動(dòng)纖維化，導(dǎo)致肺組織不可逆性損傷。TNF-α是一種前炎癥因子［10］，可誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞產(chǎn)生超氧化物，釋放溶酶體酶，介導(dǎo)細(xì)胞因子和炎癥因子的表達(dá)，促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖并產(chǎn)生大量膠原，還可誘導(dǎo)活化AM，使其分化和成熟，表達(dá)更多的細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)。肺泡上皮細(xì)胞上存在 TGF-β1和 TNF-α 合成位點(diǎn)［6-9］。這些都說(shuō)明它們和肺間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。有臨床研究［11］證實(shí)應(yīng)用TNF-α抗體治療肺間質(zhì)纖維化可改善患者的臨床癥狀及阻止肺功能的惡化。

作者在體外合成針對(duì)TNF-α的短發(fā)卡結(jié)構(gòu)的DNA序列，成功克隆入pRNAT-U6.1，構(gòu)建成siTNF-α真核表達(dá)載體。轉(zhuǎn)染人肺腺癌A549細(xì)胞后，以未轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染pRNAT-U6.1-siCon組和轉(zhuǎn)染pRNATU6.1組作為對(duì)照，排除了質(zhì)粒載體本身的干擾因素。Real Time PCR和Western blot結(jié)果均顯示，轉(zhuǎn)染pRNAT-U6.1-siTNF-α的 A549細(xì)胞與其余3組細(xì)胞比較，TNF-α和 TGF-β1 mRNA及蛋白表達(dá)均降低;而其余3組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。靶向TNF-α的siRNA真核表達(dá)載體構(gòu)建成功，該載體在沉默TNF-α基因表達(dá)的同時(shí)，還可降低TGF-β1基因的表達(dá)。該研究結(jié)果下一步利用RNAi技術(shù)干預(yù)肺間質(zhì)纖維化大鼠模型的研究和肺纖維化的基因靶向治療奠定了細(xì)胞水平上的基礎(chǔ)。

［1］Durcan N，Murphy C，Cryan SA.Inhalable siRNA:potential as a therapeutic agent in the lungs［J］.Mol Pharm，2008，5(4):559

［2］Barlo NP，van Moorsel CH，van den Bosch JM，et al.Idiopathic pulmonary fibrosis:description of a Dutch cohort［J］.Ned Tijdschr Geneeskd，2009，153:B425

［3］Zisman DA，Keane MP，Belperio JA，et al.Pulmonary fibrosis［J］.Methods Mol Med，2005，117:3

［4］Kang HR，Cho SJ，Lee CG，et al.TGF-beta 1 stimulates pulmonary fibrosis and inflammation via a bax-dependent，bid-activated pathway that involves matrix metalloproteinase-12［J］.J Biol Chem，2007，282(10):7723

［5］Yamasaki M，Kang HR，Homer RJ，et al.P21 regulates TGF-beta1-induced pulmonary responses via a TNF-alpha-signaling pathway［J］.Am J Respir Cell Mol Biol，2008，38(3):346

［6］Crestani B.Pathophysiology of idiopathic pulmonary fibrosis［J］.Bull Acad Natl Med，2010，194(2):343

［7］彭麗萍，左夢(mèng)華，遲寶榮.甲基強(qiáng)地松龍治療特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化前后TNF-α和IL-8的變化［J］.吉林大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2004，30(2):286

［8］李紅日，宋國(guó)維，崔小岱，等.急性肺損傷大鼠肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白A mRNA表達(dá)與支氣管肺泡灌洗液腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-8水平的相關(guān)性［J］.實(shí)用兒科臨床雜志，2010，25(16):1216

［9］袁曉梅，孫浩杰.銀杏達(dá)莫對(duì)特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化的作用［J］.西安交通大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2009，30(3):390

［10］Bahia MS，Silakari O.Tumor necrosis factor alpha converting enzyme:an encouraging target for various inflammatory disorders［J］.Chem Biol Drug Des，2010，75(5):415

［11］Vassallo R，Matteson E，Thomas CF Jr.Clinical response of rheumatoid arthritis-associated pulmonary fibrosis to tumor necrosis factor-a inhibition［J］.Chest，2002，122(3):1093