成都信息工程學(xué)院資源環(huán)境學(xué)院 譚顯東 段婭寧 王君君 羊依金

通過固態(tài)發(fā)酵技術(shù)將中藥渣轉(zhuǎn)變?yōu)榈鞍罪暳?，可以實現(xiàn)中藥渣的完全利用，所獲得的飼料產(chǎn)品適口性好，營養(yǎng)豐富，并且具有防病保健的功效（劉鳳梅等，2011；譚顯東等，2010、2008；秦嶺等，2008；王兵等，2007；楊威，2006）。

有研究認為，混菌發(fā)酵更具有優(yōu)勢，一方面，混菌發(fā)酵能夠充分利用不同菌株基因產(chǎn)物，完成單個菌種難以完成的復(fù)雜代謝作用；另一方面，酶促作用生成的糖立即被發(fā)酵糖的微生物所利用，因此有利于維持降解產(chǎn)物較低的濃度，消除降解產(chǎn)物對酶合成的阻遏作用和反應(yīng)終產(chǎn)物對酶的反饋抑制，縮短發(fā)酵過程（邱立友，2008；陳洪章和徐建，2004）。為了考察酵母菌的加入對康寧木霉發(fā)酵三七渣的影響，試驗采用康寧木霉/熱帶假絲酵母對其進行混菌發(fā)酵，分析其發(fā)酵動力學(xué)過程，并將混菌發(fā)酵過程與單菌發(fā)酵過程進行比較。

1 材料與方法

1.1 菌種康寧木霉（Trichoderma koningii 3.2774）由四川大學(xué)建筑與環(huán)境學(xué)院提供；熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）由河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院提供。

1.2 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯浸取液1.0 L，葡萄糖20.0 g，瓊脂15.0 g，pH自然，121℃滅菌20 min，用于康寧木霉的培養(yǎng)；土豆汁培養(yǎng)基：土豆汁1.0 L，葡萄糖20.0 g，pH自然，121℃滅菌20 min，用于熱帶假絲酵母的培養(yǎng)。除特別說明外，本試驗所用固態(tài)培養(yǎng)基組成為：過60目篩的三七渣 10.0 g， 固液比為 1∶2，（NH4）2SO40.5 g，KH2PO40.02 g，K2HPO40.025 g，MgSO40.005 g，NaCl 0.005 g。初始pH自然，121℃滅菌30 min，用于固態(tài)發(fā)酵試驗。

1.3 三七渣 三七渣由四川省某中成藥廠提統(tǒng)供，濕物料經(jīng)烘干、粉碎、過60目篩后置于干燥器中備用。本試驗所用藥渣中主要成分含量如下：淀粉33.13%，粗蛋白質(zhì)12.28%，真蛋白質(zhì)9.97%，還原糖0.35%。本文中若無特別說明，藥渣質(zhì)量均以絕干物料計量。

1.4 種子液 康寧木霉采用PDA平板培養(yǎng)基在30℃下恒溫培養(yǎng)3～3.5 d后刮下，將其制成濃度為2×107個/mL的孢子懸液；熱帶假絲酵母采用土豆汁培養(yǎng)基在30℃下恒溫培養(yǎng)約16 h，制成濃度為2×107個/mL的菌懸液。接種量定義如下：10 g三七渣培養(yǎng)基中接入1 mL菌懸液 （或孢子懸液），稱為10%的接種量，依此類推。

1.5 試驗方法

1.5.1 固態(tài)發(fā)酵法 康寧木霉純種發(fā)酵：取若干個容量為250 mL的錐形瓶，每個錐形瓶中裝入含10 g三七渣的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，將其高溫滅菌冷卻后接入1 mL康寧木霉孢子懸液，然后進行恒溫培養(yǎng)：培養(yǎng)溫度為30℃，培養(yǎng)時間為10 d。試驗開始后每隔12 h按次序取出其中的部分錐形瓶用于分析測試發(fā)酵培養(yǎng)物的pH、淀粉酶活、干重、淀粉含量、粗蛋白質(zhì)含量、真蛋白含量、還原糖含量、總糖含量?？祵幠久?熱帶假絲酵母混菌發(fā)酵：除了接種條件（先接入1 mL康寧木霉孢子懸液，恒溫培養(yǎng)24 h后再接入1 mL的熱帶假絲酵母菌懸液）與康寧木霉純種發(fā)酵過程有所區(qū)別外，其余過程均相同的；試驗結(jié)果為3個平行樣試驗結(jié)果的平均值。

1.5.2 分析方法 粗蛋白質(zhì)的測定：采用凱氏定氮法測定（張麗英，2010）；真蛋白質(zhì)的測定：發(fā)酵樣品先進行醇洗去除其中的無機氮 （胡艷麗和王克然，2007），再采用凱氏定氮法測定 （張麗英，2010）。還原糖、總糖的測定：采用3，5-二硝基水楊酸法（俞建瑛等，2005）；粗酶液的提取與酶活的測定：準確稱取1.00 g發(fā)酵培養(yǎng)物（濕基），將其溶于pH為4.6的50 mL 0.2 mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液中，在40℃恒溫空氣浴中振蕩浸提1 h，然后經(jīng)四層紗布過濾后，將濾液在5000 r/min條件下離心10 min，取上清液制成粗酶液，置于冰箱中待用。淀粉酶活力參照（陳毓荃2002）提供的方法進行測定；淀粉的測定：酸水解法（中華人民共和國衛(wèi)生部、中國國家標準化管理委員會，2009）。

2 結(jié)果與討論

2.1 真蛋白質(zhì)含量的動態(tài)變化 由圖1可知，發(fā)酵過程中發(fā)酵培養(yǎng)物真蛋白質(zhì)含量的變化大致可以分為三個階段：第一個階段：發(fā)酵0～24 h期間，真蛋白質(zhì)含量幾乎無變化；第二個階段：發(fā)酵24～72 h期間，真蛋白質(zhì)含量增長迅速；第三個階段：發(fā)酵72～192 h期間，真蛋白質(zhì)含量增長緩慢，特別是在168～192 h，真蛋白質(zhì)含量基本無變化。在發(fā)酵0～144 h期間，混菌發(fā)酵體系與單菌發(fā)酵體系的真蛋白質(zhì)含量基本相同；在發(fā)酵末期（156～192 h），單菌發(fā)酵體系的真蛋白質(zhì)含量比混菌發(fā)酵體系要高出近兩2百分點。

圖1 發(fā)酵培養(yǎng)物真蛋白質(zhì)含量的動態(tài)變化

2.2 產(chǎn)品收率的動態(tài)變化 由圖2可知，隨發(fā)酵時間的延長產(chǎn)品收率不斷下降。在發(fā)酵0～108 h期間，產(chǎn)品收率下降較快；在發(fā)酵156～192 h期間，產(chǎn)品收率幾乎不再變化，并且混菌發(fā)酵體系的產(chǎn)品收率比單菌發(fā)酵體系高出大約3個百分點。

2.3 還原糖和總糖含量的動態(tài)變化 由圖3可知，發(fā)酵過程中總糖含量不斷降低，還原糖含量先升高，到達峰值后又逐漸下降。混菌發(fā)酵體系還原糖含量先于單菌發(fā)酵體系達到峰值，并且混菌體系的峰值略高于單菌體系；在發(fā)酵12～84 h期間，混菌發(fā)酵體系的總糖含量低于單菌發(fā)酵系統(tǒng)，說明酵母菌的加入在發(fā)酵前期可以促進總糖的消耗，提高還原糖生成的速率。

2.4 pH的動態(tài)變化 由圖4可知，單菌發(fā)酵系統(tǒng)和混菌發(fā)酵系統(tǒng)的pH下降趨勢基本一致，但是在發(fā)酵36～72 h期間混菌發(fā)酵體系的pH明顯低于單菌發(fā)酵體系，這與發(fā)酵前期酵母菌對總糖代謝的促進作用相關(guān)。

2.5 淀粉酶活力的動態(tài)變化 由圖5可知，發(fā)酵初期（0～36 h），單菌和混菌發(fā)酵體系的淀粉酶活力均比較低，且差距不大；此后，單菌體系的酶活力均要高于混菌體系。原因可能是發(fā)酵初期，生物量相對較少，體系中的營養(yǎng)組分能夠同時滿足多種微生物生長的需要，但是到了發(fā)酵中后期，隨著生物量的增加，混菌體系中酵母菌會與康寧木霉競爭有限的營養(yǎng)物質(zhì)，從而在一定程度上影響康寧木霉的生長和產(chǎn)酶。

2.6 淀粉含量的動態(tài)變化 由圖6可知，在發(fā)酵60 h以后，單菌發(fā)酵體系的淀粉含量一直低于混菌發(fā)酵體系；由此說明在發(fā)酵中后期，與混菌發(fā)酵體系相比，單菌發(fā)酵體系更能促進淀粉的水解和利用，這與發(fā)酵中后期酵母菌與康寧木霉競爭營養(yǎng)物質(zhì)從而影響康寧木霉產(chǎn)酶相關(guān)。

3 結(jié)論

采用康寧木霉/熱帶假絲酵母混菌固態(tài)發(fā)酵三七渣生產(chǎn)蛋白飼料的動力學(xué)研究結(jié)果表明,與康寧木霉純種發(fā)酵相比，康寧木霉/熱帶假絲酵母混菌固態(tài)發(fā)酵三七渣生產(chǎn)蛋白飼料無明顯優(yōu)勢。在發(fā)酵前期，混菌發(fā)酵體系可以在一定程度上促進總糖消耗、提高還原糖生成的速率；在發(fā)酵中后期，單菌發(fā)酵體系的酶活力和真蛋白質(zhì)含量更高。

[1]陳洪章，徐建.現(xiàn)代固態(tài)發(fā)酵原理及應(yīng)用[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2004.65～69.

[2]陳毓荃.生物化學(xué)實驗方法和技術(shù)[M].北京：科學(xué)出版社，2002.83～86.

[3]胡艷麗，王克然.飼料中真蛋白的測定[J].河南畜牧獸，2007，28：31～32.

[4]劉鳳梅，譚顯東，羊依金，等.三七渣固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料[J].中國釀造，2011，2：67 ～ 70.

[5]秦嶺，王向東，潘朝智，等.多菌種混合發(fā)酵生脈飲藥渣生產(chǎn)蛋白飼料工藝條件優(yōu)化[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報，2008，4：122～128.

[6]邱立友.固態(tài)發(fā)酵工程原理及應(yīng)用 [M].北京：中國輕工業(yè)出版社，2008.23～25.

[7]譚顯東，王向東，黃健盛，等.中藥渣資源化技術(shù)研究進展[J].中成藥，2010，32（5）：847 ～ 849.

[8]譚顯東，王向東，楊平，等.康寧木酶固態(tài)發(fā)酵中藥渣制備蛋白飼料[J].四川大學(xué)學(xué)報（工程科學(xué)版），2008，4：71 ～ 76.

[9]王兵，王向東，秦嶺，等.中藥渣固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報，2007，4：77 ～ 82.

[10]楊威.黃苓藥渣固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)單細胞蛋白[J].哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2006，5：14 ～ 17.

[11]俞建瑛，蔣宇，王善利.生物化學(xué)實驗技術(shù)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005.138～140.

[12]張麗英.飼料分析及飼料質(zhì)量檢測技術(shù)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2010.53～56.

[13]中華人民共和國衛(wèi)生部，中國國家標準化管理委員會.GB/T 5009.9-2008.食品中淀粉的測定[S].北京:中國標準出版社，2009.