蔣備戰(zhàn)，王佐林

(1.同濟(jì)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院牙體牙髓病學(xué)教研室，上海 200072;2.同濟(jì)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔頜面外科教研室，上海 200072)

Versican是細(xì)胞外基質(zhì)中大分子硫酸軟骨素蛋白聚糖家族的重要成員。研究表明，它是由一個(gè)核心蛋白和連接在其上的12～15條硫酸軟骨素多糖鏈構(gòu)成，其硫酸軟骨素多糖鏈有4-硫酸軟骨素(C4S)和 6-硫酸軟骨素(C6S)兩類。Versican的硫酸軟骨素多糖側(cè)鏈在不同的組織表達(dá)各異，甚至在機(jī)體發(fā)育的不同階段也會(huì)發(fā)生改變［1］。

此前的研究表明，Versican的核心蛋白在小鼠牙齒發(fā)育過(guò)程中呈特異性的時(shí)空表達(dá)模式，在牙胚的形態(tài)發(fā)生、細(xì)胞增殖與分化等方面起重要作用［2-4］，但有關(guān)其硫酸軟骨素多糖側(cè)鏈在牙胚發(fā)育過(guò)程中的時(shí)空變化尚不清楚，因此本次實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)方法，同時(shí)檢測(cè)Versican的核心蛋白及其硫酸軟骨素多糖鏈在小鼠磨牙牙胚發(fā)育過(guò)程中的時(shí)空變化，為更全面地了解Versican在牙胚發(fā)育過(guò)程中的的作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料

實(shí)驗(yàn)所用ICR孕鼠由上海生命科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。兔抗鼠多克隆Versican抗體由東京醫(yī)科齒科大學(xué)大學(xué)院Tamayuki Shinomura教授惠贈(zèng)，2B6(識(shí)別4-硫酸軟骨素)，3B3(識(shí)別6-硫酸軟骨素)購(gòu)自Seikagaku公司(日本東京)。SABC免疫組化試劑盒購(gòu)自美國(guó)DAKO公司，AEC顯色試劑盒購(gòu)自日本Nichirei公司，采用日本Olympus光學(xué)顯微鏡和數(shù)碼圖像采集系統(tǒng)采集圖片。

1.2 切片制備

以出現(xiàn)陰道栓當(dāng)日清晨定為胚胎發(fā)育的0 d(Embryonic Day 0，E 0 d)。分別取 E 11.5 d、E 12.0 d、E 13.5 d、E 15.0 d、E 16.5 d、E 18.5 d 的ICR孕鼠各三只，乙醚麻醉后斷頸處死并取胎鼠頭部，PBS清洗干凈后用新鮮配制的4%多聚甲醛(pH 7.4)固定24 h，系列乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，矢狀或冠狀切片，制成5 μm厚的組織切片，4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)

選擇制備好的石蠟切片，用SABC法進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)，即常規(guī)脫蠟至水，用酶消化法修復(fù)抗原，其中Versican用透明質(zhì)酸酶(25 mg/ml)37℃下消化1 h;2B6，3B3用硫酸軟骨素酶ABC(1 mU/μl)37℃下消化3 h，0.01 M PBS液漂洗后用1%H2O2封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。再經(jīng)PBS液漂洗，用1%牛血清白蛋白PBS緩沖液去除非特異性染色后滴加一抗，室溫孵育1 h，PBS漂洗后滴加二抗，室溫孵育15 min后PBS漂洗，AEC顯色，蘇木精復(fù)染，甘油封片，鏡檢拍照。

2 結(jié) 果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，自小鼠磨牙牙胚開(kāi)始發(fā)生(E 11.5 d)至成牙本質(zhì)細(xì)胞和成釉細(xì)胞開(kāi)始分化(E 18.5 d)的過(guò)程中，Versican之多糖鏈在牙源性上皮組織與牙源性間充質(zhì)組織中的表達(dá)隨著牙胚發(fā)育的進(jìn)程而發(fā)生動(dòng)態(tài)變化。

在E 11.5 d，小鼠下頜第一磨牙牙胚開(kāi)始發(fā)育，表現(xiàn)為口腔上皮的局部增生，形成牙板，此時(shí)未能檢測(cè)到Versican核心蛋白(圖1A)，而4-硫酸軟骨素多糖鏈(C4S)在增厚的牙源性上皮以及基底膜所在區(qū)域強(qiáng)表達(dá)，但與基底膜緊鄰的牙源性間充質(zhì)組織中卻未能檢測(cè)到(圖1B)，而6-硫酸軟骨素多糖鏈(C6S)在牙源性上皮組織以及基底膜所在區(qū)域均未能檢測(cè)到，在深層的牙源性間充質(zhì)細(xì)胞表達(dá)也不明顯(圖1C)。

在E 12.0 d，小鼠下頜第一磨牙牙胚繼續(xù)發(fā)育，進(jìn)入蕾狀早期，在增生的牙板上皮以及基底膜區(qū)域Versican核心蛋白表達(dá)明顯，C4S的免疫染色與核心蛋白一致，而C6S在增生的上皮中無(wú)表達(dá)(圖2A，B，C)。

在E 13.5 d，小鼠下頜第一磨牙牙胚發(fā)育進(jìn)入蕾狀晚期，Versican核心蛋白在牙蕾中央的上皮細(xì)胞外基質(zhì)中表達(dá)明顯，于其緊鄰的間充質(zhì)細(xì)胞間也開(kāi)始有表達(dá)，C4S的表達(dá)與其基本一致，而C6S在牙蕾上皮中的免疫染色為陰性，在其深層的牙源性間充質(zhì)細(xì)胞區(qū)域開(kāi)始表達(dá)(圖3A，B，C)。

在E 15.0 d，小鼠下頜第一磨牙牙胚處于帽狀期，Versican核心蛋白在成釉器的星網(wǎng)狀層、牙乳頭、牙囊細(xì)胞間強(qiáng)表達(dá)，而在內(nèi)外釉上皮細(xì)胞間無(wú)表達(dá)。C4S在此時(shí)的表達(dá)與核心蛋白不完全一致，除在星網(wǎng)狀層細(xì)胞間有強(qiáng)表達(dá)外，開(kāi)始在緊鄰基底膜處折疊的牙乳頭細(xì)胞弱表達(dá)。而C6S在牙乳頭以及牙囊細(xì)胞間的表達(dá)與Versican的核心蛋白表達(dá)基本一致(圖4A，B，C)。

在E 16.5 d，小鼠下頜第一磨牙處于鐘狀早期，Versican核心蛋白及硫酸軟骨素多糖鏈的免疫組化檢測(cè)結(jié)果與E 15.0 d大致相同，但在未來(lái)牙尖形成區(qū)的牙乳頭間充質(zhì)細(xì)胞區(qū)域C4S有明顯表達(dá)。C6S的表達(dá)仍然局限于牙乳頭間充質(zhì)細(xì)胞與牙囊細(xì)胞，但其在C4S表達(dá)的間充質(zhì)細(xì)胞所在區(qū)域消失，C4S與C6S在牙乳頭組織中呈現(xiàn)互補(bǔ)的表達(dá)模式(圖5A，B，C)。

在E 18.5 d，小鼠下頜第一磨牙處于鐘狀晚期，Versican核心蛋白在成釉器中的表達(dá)與此前一致，而其在牙乳頭細(xì)胞的表達(dá)與此前的表達(dá)卻有不同，其在分化的成牙本質(zhì)細(xì)胞所在區(qū)域以及前期牙本質(zhì)中不表達(dá)，但在頸環(huán)周邊的表達(dá)卻很明顯。C4S的表達(dá)也發(fā)生改變，其在成釉器中的表達(dá)局限于星網(wǎng)狀層，在已經(jīng)分化成熟的成釉細(xì)胞、成牙本質(zhì)細(xì)胞所在區(qū)域不表達(dá)，而在前期成牙本質(zhì)細(xì)胞以及頸環(huán)內(nèi)側(cè)未分化的牙乳頭間充質(zhì)細(xì)胞表達(dá)明顯，在前期牙本質(zhì)所在區(qū)域表達(dá)較弱。C6S的表達(dá)在牙尖形成區(qū)域逐漸消失，在深層以及頸環(huán)內(nèi)側(cè)的牙乳頭間充質(zhì)細(xì)胞所在區(qū)域仍有表達(dá)，C4S與C6S的互補(bǔ)性表達(dá)也更加明顯(圖6A，B，C)。

3 討 論

牙齒作為機(jī)體的一個(gè)器官與其他器官的生長(zhǎng)發(fā)育一樣是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，細(xì)胞外基質(zhì)在這一過(guò)程中起著重要作用［5-6］。近30年來(lái)，Versican作為細(xì)胞外基質(zhì)中大分子硫酸軟骨素蛋白聚糖在疾病發(fā)生與器官發(fā)育中的作用越來(lái)越受到關(guān)注［7］。Versican之硫酸軟骨素糖鏈可以與透明質(zhì)酸、CD44等相連接，在支持細(xì)胞，構(gòu)建細(xì)胞生存微環(huán)境發(fā)揮重要作用［8-9］。

研究證明Versican基因及蛋白在小鼠磨牙牙胚發(fā)育過(guò)程中呈特異性的時(shí)空表達(dá)，但有關(guān)其多糖側(cè)鏈的時(shí)空變化尚不清晰，為此本實(shí)驗(yàn)分別采用了識(shí)別其核心蛋白與硫酸軟骨素多糖鏈的抗體，用免疫組織化學(xué)的方法系統(tǒng)檢測(cè)了小鼠下頜第一磨牙牙胚發(fā)育過(guò)程中的Versican核心蛋白及其硫酸軟骨素多糖鏈的表達(dá)。結(jié)果表明Versican核心蛋白與其硫酸軟骨素多糖鏈的表達(dá)在牙胚的不同發(fā)育階段以及牙胚的不同組織結(jié)構(gòu)中呈特異性時(shí)空表達(dá)。Versican在成釉器發(fā)育過(guò)程中其多糖鏈為C4S，C6S從未在牙源性上皮組織中表達(dá);而在牙乳頭中Versican之多糖鏈在牙胚開(kāi)始發(fā)育時(shí)以C6S為主，隨后在未來(lái)牙尖形成區(qū)域及其緊鄰的牙乳頭間充質(zhì)細(xì)胞逐漸消失，取而代之的是C4S，且C4S與C6S在牙乳頭組織中呈特異性互補(bǔ)表達(dá)模式。

Versican核心蛋白在E 11.5 d的牙源性上皮與深層間充質(zhì)中均不表達(dá)，但可以清楚的檢測(cè)到C4S的強(qiáng)表達(dá)，而自E 12.0 d起Versican之核心蛋白與C4S在增生的牙蕾上皮組織中表達(dá)，并在隨后各期的成釉器星網(wǎng)狀層中均可檢測(cè)到，這種情況持續(xù)到E 18.5 d，結(jié)果與 Tsuyoshi Hikake［10］等報(bào)道部分相同。這提示Versican的多糖側(cè)鏈可能早于核心蛋白的表達(dá)，C4S在牙冠的形態(tài)發(fā)生中可能起著重要作用。

Versican在牙源性間充質(zhì)及其衍生組織中的檢測(cè)結(jié)果表明，其核心蛋白自E 12.0 d開(kāi)始在牙源性間充質(zhì)中表達(dá)，在隨后的 E 15.0 d，E 16.5 d，其在牙乳頭細(xì)胞聚集區(qū)強(qiáng)表達(dá)。此時(shí)Versican之多糖鏈以C6S為主，很少有C4S在牙乳頭間充質(zhì)的表達(dá)，而從E18.5 d起C4S在未來(lái)牙尖形成區(qū)域強(qiáng)表達(dá)，而C6S在相應(yīng)區(qū)域則消失，這提示C4S和C6S的特異性互補(bǔ)表達(dá)可能與牙尖的發(fā)育過(guò)程中的成釉細(xì)胞、成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化以及牙本質(zhì)基質(zhì)的形成密切相關(guān)。

綜上所述，Versican之硫酸軟骨素多糖鏈在牙胚不同發(fā)育階段以及不同組織中的硫酸化模式不同，C4S與C6S在牙齒發(fā)育過(guò)程中表現(xiàn)為很強(qiáng)的互補(bǔ)性，這種動(dòng)態(tài)的互補(bǔ)性改變可能與牙胚形態(tài)發(fā)生、細(xì)胞增殖與分化密切相關(guān)，具體機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

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