王思明， 趙 雨， 張 惠， 陳 雨， 林艷玲， 連樹(shù)林

(1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥與生物工程研發(fā)中心，吉林長(zhǎng)春130117;2.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林長(zhǎng)春130117)

人參Panax ginseng C.A.Mey.為中國(guó)傳統(tǒng)中藥材，藥用歷史悠久。人參具有大補(bǔ)元?dú)?、?fù)脈固脫、補(bǔ)脾益肺、生津安神的功效［1］。人參生長(zhǎng)年限是影響和判斷人參品質(zhì)的重要因素之一。不同年生人參在藥理作用上有所差異［2］。酶是具有催化功能的蛋白，在植物生長(zhǎng)中起著催化和調(diào)節(jié)的作用。對(duì)不同年生人參中酶活力比較可反映其生理代謝水平。氧化還原酶和水解酶為國(guó)際酶學(xué)委員會(huì)(I.E.C)規(guī)定的六大類(lèi)酶中的兩類(lèi)。氧化還原酶是能催化底物發(fā)生氧化還原反應(yīng)的酶的總稱(chēng)，其中過(guò)氧化物酶 (POD)、過(guò)氧化氫酶 (CAT)、多酚氧化酶 (PPO)［3］和抗壞血酸過(guò)氧化物酶 (APX)是植物有氧呼吸作用三羧酸循環(huán)末端氧化系統(tǒng)中的關(guān)鍵酶，與活性氧代謝有關(guān)。水解酶是催化底物發(fā)生水解反應(yīng)的酶的總稱(chēng)，淀粉酶 (AMY)、酯酶(EST)、酸性磷酸酯酶 (ACP)和堿性磷酸酯酶(ALP)分別參與植物的糖代謝、脂類(lèi)代謝和磷代謝等。本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同年生人參中該8種酶進(jìn)行活力測(cè)定，為了解人參品質(zhì)與生長(zhǎng)年限的關(guān)系、確定采收期及質(zhì)量鑒定提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)用人參購(gòu)于吉林省撫松縣，經(jīng)長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室姜大成教授鑒定，均為五加科植物Panax ginseng C.A.Mey.，符合中國(guó)藥典2010年版一部的規(guī)定。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器 UV—2550紫外分光光度計(jì) (日本島津公司);AL204型電子天平 (上海梅特勒-托利多儀器有限公司);5804 R冷凍型臺(tái)式高速離心機(jī)(德國(guó)艾本德公司);DS2l型高速組織搗碎機(jī) (上海標(biāo)本模型廠)。

1.2.2 試劑 過(guò)氧化氫 (北京化工廠);焦兒茶酚 (天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所);抗壞血酸 (北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司);愈創(chuàng)木酚 (天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所);3，5-二硝基水楊酸(DNS)(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);酒石酸鉀鈉 (天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司);固藍(lán)B鹽(長(zhǎng)春鼎國(guó)生物有限公司);乙酸-α-萘酯 (國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);α-萘酚 (國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);對(duì)硝基苯磷酸二鈉 (PNPP)(上海晶純?cè)噭┯邢薰?。所用試劑均為分析純。

2 方法

2.1 樣品制備 將樣品洗凈后以料液比1∶4在已預(yù)冷的磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉緩沖液(pH7.4)中研磨，4℃浸提20 min后過(guò)濾，濾液以10000 r/min離心20 min后所得上清液即為粗酶液，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 過(guò)氧化物酶 (POD)活力測(cè)定［4］取磷酸鹽緩沖液150 mL，愈創(chuàng)木酚84 mL，加熱溶解，待冷卻后加入30%H2O257 μL，混合均勻后37℃預(yù)熱。取出3 mL混合液加入1 mL酶液，在470 nm處測(cè)定POD第0、1、2 min時(shí)的吸光度。POD活力以單位時(shí)間內(nèi) (1 min)每克樣品使A470變化0.01為1個(gè)酶活力單位。

2.3 過(guò)氧化氫酶 (CAT)活力測(cè)定［5］取酶液0.2 mL，磷酸緩沖液1.5 mL，蒸餾水1 mL，于37℃水浴預(yù)熱10 min后加入0.1 mol/L的H2O20.3 mL，在240 nm處測(cè)定CAT第0、1、2 min時(shí)的吸光度。CAT活力以單位時(shí)間內(nèi) (1 min)每克樣品使A240減少0.1為1個(gè)酶活力單位。

2.4 多酚氧化酶 (PPO)活力測(cè)定［6］取緩沖液1.5 mL，加入焦兒茶酚溶液1 mL，在37℃水浴鍋中預(yù)熱10 min，再加入0.5 mL酶液，于525 nm處測(cè)定PPO第0、30、60 s時(shí)的吸光度。PPO活力以單位時(shí)間內(nèi) (1 min)每克樣品使A525變化0.01為1個(gè)酶活力單位。

2.5 抗壞血酸過(guò)氧化物酶 (APX)活力測(cè)定［6］分別取水浴預(yù)熱10 min后的緩沖液2 mL，1.8 mmol/L AsA 0.5 mL，酶液0.1mL，0.36 mmol/L H2O20.5 mL，在290 nm處測(cè)定APX第0、1、2 min時(shí)的吸光度。APX活力以單位時(shí)間內(nèi) (1 min)每克樣品反應(yīng)產(chǎn)生1 μmol AsA為1個(gè)酶活力單位。

2.6 淀粉酶 (AMY)活力測(cè)定［7］取酶液1 mL，加入1%淀粉溶液l mL于40℃水浴預(yù)熱5 min，加入DNS 2 mL，在沸水浴中加熱5 min，迅速冷卻后加蒸餾水定容至20 mL，以第一次水浴前加入DNS試劑作為對(duì)照，在540 nm處測(cè)定AMY的吸光度。根據(jù)麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)吸光度的麥芽糖含有量。AMY活力以單位時(shí)間內(nèi) (1 min)每克樣品催化反應(yīng)所得1 mg麥芽糖為1個(gè)酶活力單位。

2.7 酯酶 (EST)活力測(cè)定［8］將0.1moL pH6.5的磷酸緩沖溶液1 mL，酶液1 mL，蒸餾水1 mL混合為 A液。將 1.25 mol/L乙酸-α-萘酯溶液0.1 mL，0.25 mol/L的固藍(lán)B鹽溶液0.9 mL混合為B液。將A液與B液分別于40℃恒溫水浴下保溫10 min，取出后即刻混勻，在524 nm處測(cè)定EST第0、1、2、3 min時(shí)的吸光度。根據(jù)α-萘酚標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)吸光度的α-萘酚含有量。EST活力以單位時(shí)間 (1 min)內(nèi)每克樣品與底物反應(yīng)所得1 μg的α-萘酚為1個(gè)酶活力單位。

2.8 酸性磷酸酯酶 (ACP)活力測(cè)定［9］取PNPP 0.5 mL，乙酸緩沖液2.3 mL在37℃預(yù)熱10 min，加入酶液0.2 mL，37℃準(zhǔn)確保溫10 min，加入NaOH 2 mL終止酶反應(yīng)，以先加入NaOH后再加酶液作為空白，在405 nm處測(cè)吸光度。根據(jù)對(duì)硝基酚標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)吸光度的對(duì)硝基酚含有量。ACP活力以單位時(shí)間內(nèi) (1 min)每克樣品反應(yīng)產(chǎn)生1 nmol對(duì)硝基酚為1個(gè)酶活力單位。

2.9 堿性磷酸酯酶 (ALP)活力測(cè)定［10］取PNPP 0.5 mL，碳酸緩沖液1.5 mL在37℃預(yù)熱10 min，加入酶液0.5 mL，37℃準(zhǔn)確保溫5 min，加入NaOH 1 mL終止酶反應(yīng)，以先加入NaOH后再加酶液作為空白，在405 nm處測(cè)吸光度。根據(jù)對(duì)硝基酚標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)吸光度的對(duì)硝基酚含有量。ALP活力以單位時(shí)間內(nèi) (1 min)每克樣品反應(yīng)產(chǎn)生1 μmol對(duì)硝基酚為1個(gè)酶活力單位。

3 結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1，可看出4年生人參的8種酶活力均低于5、6、7年生人參。

表1 4、5、6、7年生人參8種酶活力值 (±s，n=3)Tab.1 Eight kinds of enzyme activity in 4，5，6，7 years old ginseng(x ±s，n=3)

表1 4、5、6、7年生人參8種酶活力值 (±s，n=3)Tab.1 Eight kinds of enzyme activity in 4，5，6，7 years old ginseng(x ±s，n=3)

生長(zhǎng)年限酶活力/(U·g－1)POD CAT PPO APX AMY EST ACP ALP 4年 738±33 16.6±1.6 106±13 252±12 404.4± 1.0 1.53±0.28 302.1±82.0 79.6±1.45年 2560±689 45.7±1.3 415±113 916±32 1320.9± 74.9 3.13±0.48 827.3±85.1 183.2±16.06年 2303±67 35.8±3.9 298±3 691±21 1132.0± 19.2 4.02±0.28 699.1±40.7 228.7±13.17年 2130±157 41.4±3.2 712±20 468±45 1603.8±400.8 3.33±0.181432.5±37.3 167.2±12.2

不同年生人參POD、APX活力由大到小為5年﹥6年﹥7年﹥4年 (如圖1);PPO、AMY、ACP活力由大到小為7年﹥5年﹥6年﹥4年 (如圖3、4);CAT、ALP、EST活力大小順序各不相同，如圖2、5、6。

圖1 不同年生POD、APX活力Fig.1 POD and APX activity

圖2 不同年生CAT活力Fig.2 CAT activity

5年生人參以POD、CAT和APX活力最高，分別約是活力最低年生人參的3.47、2.75、3.63倍;6年生人參以ALP、EST活力最高，分別約是活力最低年生人參的2.87、2.63倍;7年生人參以PPO、AMY和ACP活力最高，分別約是活力最低年生人參的6.72、3.97、4.74倍。其中，7年生人參的PPO、ACP活力明顯高于其它年生人參。

4 討論

圖3 不同年生PPO活力Fig.3 PPO activity

圖4 不同年生AMY、ACP活力Fig.4 AMY and ACP activity

圖5 不同年生ALP活力Fig.5 ALP activity

圖6 不同年生EST活力Fig.6 E-ST activity

人參為多年生草本植物，通常3年開(kāi)花，5～6年結(jié)果，不同年生的人參其生長(zhǎng)發(fā)育規(guī)律存在差別。Soldati等［11］對(duì)生長(zhǎng)在日本和朝鮮的1～6年人參100多個(gè)樣品分析，發(fā)現(xiàn)人參皂苷的含有量隨生長(zhǎng)年限的增長(zhǎng)而不斷升高，第5年夏末趨于穩(wěn)定。肖新月［12］等對(duì)不同生長(zhǎng)年限的人參中8種主要皂苷成分的分析研究表明，隨著生長(zhǎng)年限增加，2～6年的全須參 (園參)中 Rg、Re、Rb、Rf、Rh、Rc含有量有所增加，可將5年生長(zhǎng)期看作是園參有效物質(zhì)積累到高限的轉(zhuǎn)折點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)從酶學(xué)角度觀察了人參生長(zhǎng)發(fā)育的特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)4年生人參中8種酶活力均小于5、6、7年生人參，說(shuō)明4年生人參的總體代謝水平低于5、6、7年生人參，處于形態(tài)建成快速生長(zhǎng)期，從5年開(kāi)始，生長(zhǎng)規(guī)律發(fā)生變化，人參中代謝水平趨于穩(wěn)定，可將5年生長(zhǎng)期看作是人參生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)折點(diǎn)。這與其它研究的觀點(diǎn)相符合，也說(shuō)明人參采收以5、6年生人參為主是有一定科學(xué)依據(jù)的。

POD、CAT和APX都是植物抗氧化系統(tǒng)的關(guān)鍵酶，參與植物的活性氧代謝，在對(duì)維護(hù)植物活性氧代謝平衡，保護(hù)其免受氧化毒害方面起到重要作用。5年生人參中該3種酶活力高，說(shuō)明其活性氧代謝水平高，植物呼吸作用強(qiáng)，也說(shuō)明5年生人參處于同化作用的高峰期。7年生人參中PPO活力較6年生人參活力顯著升高，可能與底物濃度變化有關(guān)。ACP與ALP是非特異性磷酸水解酶，可作用于多種底物，與植物中磷的代謝密切相關(guān)。7年生人參ACP活力的顯著升高和ALP活力的顯著下降說(shuō)明磷代謝途徑發(fā)生變化。EST是催化酯類(lèi)化合物水解的酶系，可以在水分子的參與下，將脂肪酸酯切割成酸類(lèi)與醇類(lèi)，從而為植物合成其它營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)提供中間產(chǎn)物。6年生人參的EST酶活力高于4、5、7年生人參，說(shuō)明它的酯類(lèi)化合物分解代謝快，也就是說(shuō)明6年生人參的營(yíng)養(yǎng)儲(chǔ)存形式發(fā)生了變化。

［1］幺寶金，趙 雨，楊世慧，等.人參總蛋白的提取工藝研究［J］.中藥材，2009，32(2):293-295.

［2］彭明勇，李 艷.人參不同生長(zhǎng)年限的藥理作用的比較［J］.中外醫(yī)療，2008，28:72，78.

［3］彭世清.植物多酚氧化酶的研究進(jìn)展［J］.熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，2000，85(3):61-65.

［4］ 張志安.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)［M］.北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2004.143-145.

［5］楊蘭芳，龐 靜，彭小蘭，等.紫外分光光度法測(cè)定植物過(guò)氧化氫酶活性［J］.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2009，20:364-366.

［6］ 范淑琴，梁淑文.現(xiàn)代植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指南［M］.北京:科學(xué)出版社，1999.316-318.

［7］ 郝建軍，康宗利，于 洋.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2007:104-106.

［8］侯明迪.植物酯酶法快速測(cè)定有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的研究［J］.食品科學(xué)，2002，23(7):111-115.

［9］ 王 琰.生物化學(xué)和臨床生物化學(xué)檢驗(yàn)［M］.北京:清華大學(xué)出版社，2005:151-153.

［10］俞建英.生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:255-258.

［11］Soldati F，Tanaka O.Panax ginseng:relation between age of plant and content of ginsenosides［J］.J Planta Med，1984，51(4):35l

［12］肖新月，尹繼飛，張南平.不同生長(zhǎng)年限的人參中8種主要皂苷成分的分析研究［J］.藥物分析雜志，2004，24(3):238-244.