秦 偉 謝學(xué)軍 何 宇 李志英 李芳梅 楊宇琦 陳一兵王雪菁

糖尿病所致眼部并發(fā)癥是目前主要致盲原因之一。對糖尿病患者視功能障礙機理的積極探索已成為眼科界研究的熱點。目前研究主要集中在對糖尿病性白內(nèi)障、糖尿病視網(wǎng)膜病變等方面，對糖尿病導(dǎo)致視路神經(jīng)功能障礙的探討較少。故本研究擬從糖尿病大鼠視路神經(jīng)損害角度對補腎活血中藥復(fù)方防治實驗性糖尿病大鼠視功能障礙進行探討。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級SD大鼠160只，體重125～150 g，雌雄各半，由成都中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：04-11，檢疫后備用。

1.2 實驗藥物

補腎活血中藥復(fù)方（由生地黃、丹參等制成無糖沖劑，生藥含量4.05 g/g，由成都中醫(yī)藥大學(xué)制劑教研室制備）；鹽酸苯乙雙胍片（降糖靈，江蘇省金壇市制藥廠）；羥苯磺酸鈣膠囊（導(dǎo)升明，奧地利依比威大藥廠）；羧甲基纖維素（成都中醫(yī)藥大學(xué)制劑教研室提供）；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）（美國 Sigma公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物造模：將STZ溶于濃度為0.1 mol/L，pH=4.6的檸檬酸鈉緩沖液中，配制成1%的溶液備用（即質(zhì)量濃度0.01 g/ml，隨配隨用）。隨機選取20只SD大鼠作為正常對照組，其余大鼠按50 mg/kg的劑量左下腹皮下注射上述STZ溶液。造模后48 h，取已禁食12 h大鼠的尾靜脈血測定血糖，血糖濃度大于11.1 mmol/L者作為糖尿病模型大鼠，并開始計算病程。

1.3.2 動物分組及給藥：將糖尿病模型大鼠隨機分為陰性對照組、陽性對照Ⅰ組、陽性對照Ⅱ組、中藥高、中、低劑量組；未造模的正常同齡鼠作為正常對照組。正常對照組：20只，自由攝食飲水，不加任何處理。陰性對照組：20只，予中藥組等體積的0.5%羧甲基纖維素溶液灌胃，每日1次。陽性對照Ⅰ組：20只，相當(dāng)于成人劑量10倍的降糖靈混懸液（16.67 mg/kg）灌胃，每日1次。陽性對照Ⅱ組：20只，相當(dāng)于成人劑量10倍的降糖靈和導(dǎo)升明混懸液（166.67 mg/kg）灌胃，每日1次。中藥低劑量組：20只，相當(dāng)于臨床用藥量劑量5倍的補腎活血中藥復(fù)方（1.85 mg/kg），再加相當(dāng)于成人劑量10倍的降糖靈混懸液灌胃，每日1次。中藥中劑量組：20只，相當(dāng)于臨床用藥量劑量10倍的補腎活血中藥復(fù)方（3.70 mg/kg），再加相當(dāng)于成人劑量10倍的降糖靈混懸液灌胃，每日1次。中藥高劑量組：20只，相當(dāng)于臨床用藥量劑量15倍的補腎活血中藥復(fù)方（5.55 mg/kg），再加相當(dāng)于成人劑量10倍的降糖靈混懸液灌胃，每日1次。

1.3.3 光鏡標(biāo)本制作：用藥觀察6個月后，各組隨機取10只大鼠，脊椎脫臼法處死，迅速摘出眼球，開顱完整取出腦組織，立即放入10%中性甲醛溶液中固定，同時將該固定液注入玻璃體腔內(nèi)以及大腦縱裂中部。24 h后將固定的眼球取出，去除其眼前節(jié)和玻璃體，再放回原固定液中固定72 h后行石蠟包埋，連續(xù)切片，厚度為 4μm；按大鼠中樞神經(jīng)解剖定位〔1〕，切取視皮質(zhì)（visual cortex，VC）17區(qū)和外側(cè)膝狀體（external geniculate body，EGB），行石蠟包埋，連續(xù)切片，厚度為 4μm。

1.3.4 染色方法：Nissl小體采用甲苯胺藍-伊紅復(fù)染法染色。突觸素 I（synapsin I，Syn I）采用免疫組化SP法染色，其一抗為Syn I山羊抗鼠多克隆抗體，購自SANTA CROZ公司，二抗為抗山羊二抗SP試劑盒（與相應(yīng)陽性對照片均購自北京中山生物技術(shù)有限公司），DAB顯色，具體操作按說明書進行，同時設(shè)置陽性對照和用PBS代替一抗的陰性對照。

1.3.5 指標(biāo)陽性染色結(jié)果判定及其灰度測定：組織內(nèi)出現(xiàn)細顆粒狀、細絲狀棕黃色著色視為陽性染色。每張切片隨機選5個視野，采用Mias-2000型圖形分析儀（四川大學(xué)圖形圖像研究所提供）分別對視網(wǎng)膜、外側(cè)膝狀體（EGB）以及視皮質(zhì)（VC）17 區(qū)中Nissl小體、SynⅠ陽性染色物質(zhì)的灰度進行測量，求取每視野均值代表該切片的測量值。其平均灰度值越高，表示指標(biāo)的陽性染色越深，數(shù)量越多。

1.4 統(tǒng)計方法

實驗數(shù)據(jù)資料采用SPSS 15.0軟件包進行統(tǒng)計學(xué)處理，統(tǒng)計方法采用單因素方差分析，各項指標(biāo)結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。

2 結(jié)果

2.1 補腎活血中藥對糖尿病大鼠視路三級神經(jīng)元Syn I表達的影響

光鏡下見正常組大鼠視網(wǎng)膜、EGB、VC17區(qū)Syn I呈細顆粒狀/細絲狀結(jié)構(gòu)（類似于神經(jīng)絲蛋白）彌散分布于細胞之間，分布密集、數(shù)量多，呈深棕、棕黃色；陰性對照組大鼠上述三部位Syn I分布稀疏、數(shù)量少，呈棕黃或淺黃色；中藥治療組大鼠上述三部位的Syn I陽性染色又趨于密集，數(shù)量有所增多（圖1）。各實驗組大鼠視路三個部位Syn I的平均灰度值見表1。

圖1 補腎活血中藥對糖尿病大鼠視路神經(jīng)元Nissl小體表達的影響。①②正常組大鼠視路神經(jīng)元胞體中含有較多的呈藍色、顆粒狀及小塊狀的Nissl小體；③④⑤陰性對照組大鼠視視路神經(jīng)元胞體中Nissl.小體稀疏、數(shù)量少，呈淡藍色；⑥⑦⑧中藥高劑量治療組大鼠視路神經(jīng)元胞體中Nissl小體又趨于密集，數(shù)量有所增多。

表1 正常組及糖尿病各組大鼠視網(wǎng)膜、外側(cè)膝狀體、視皮質(zhì)中Syn I灰度值（）

表1 正常組及糖尿病各組大鼠視網(wǎng)膜、外側(cè)膝狀體、視皮質(zhì)中Syn I灰度值（）

注：與正常對照組比較，①P＜0.05，②P＜0.01；與陰性對照組比較，③P＜0.05，④P＜0.01；與陽性對照Ⅰ組比較，⑤P＜0.05，⑥P＜0.01；與陽性對照Ⅱ組比較，⑦P＜0.05，⑧P＜0.01。

Syn I灰度值視網(wǎng)膜 外側(cè)膝狀體 視皮質(zhì)正常對照組 10 104.76±3.56 96.28±6.83 85.78±9.14陰性對照組 10 89.16±6.24② 67.46±7.67② 74.24±10.28①陽性對照Ⅰ組 10 99.92±6.20④ 84.68±11.87①④ 86.97±9.82③陽性對照Ⅱ組 10 102.01±8.84④ 96.28±9.43④ 84.21±16.63中藥低劑量組 10 102.73±7.20④ 94.16±18.69④ 89.09±10.48④中藥中劑量組 10 103.06±8.05④ 104.20±8.00④⑥ 94.15±16.26④中藥高劑量組 10 103.82±3.33④ 106.44±11.78④⑥⑦ 103.21±16.39①④⑤⑧

2.2 補腎活血中藥對糖尿病大鼠視路三級神經(jīng)元Nissl小體的影響

光鏡下見正常組大鼠視網(wǎng)膜、EGB及VC17區(qū)的神經(jīng)元胞體中含有較多藍色的呈顆粒狀及小塊狀的Nissl小體；陰性對照組大鼠上述三部位Nissl小體稀疏、數(shù)量少，呈淡藍色；中藥治療組大鼠上述三部位的Nissl小體又趨于密集，數(shù)量有所增多（圖2）。各實驗組大鼠視路三個部位Nissl小體的平均灰度值度見表2。

3 討論

圖2 補腎活血中藥對糖尿病大鼠視路神經(jīng)元SynI表達的影響。①②正常組大鼠視網(wǎng)膜、EGB、VC17區(qū)Syn I呈細顆粒狀/細絲狀結(jié)構(gòu)（類似于神經(jīng)絲蛋白）彌散體稀疏、數(shù)量少，呈淡藍色；③④⑤陰性對照組大鼠上述三部位Syn I分布稀疏、數(shù)量少，呈棕黃或淺黃色；⑥⑦⑧中藥高劑量治療組大鼠上述三部位的Syn I陽性染色又趨于密集，數(shù)量有所增多。

表2 正常組及糖尿病各組大鼠視網(wǎng)膜、外側(cè)膝狀體、視皮質(zhì)中Nissl小體灰度值（）

表2 正常組及糖尿病各組大鼠視網(wǎng)膜、外側(cè)膝狀體、視皮質(zhì)中Nissl小體灰度值（）

注：與正常對照組比較，①P＜0.05，②P＜0.01；與陰性對照組比較，③P＜0.05，④P＜0.01；與陽性對照Ⅰ組比較，⑤P＜0.05，⑥P＜0.01；與陽性對照Ⅱ組比較，⑦P＜0.05，⑧P＜0.01。

Nissl小體灰度值視網(wǎng)膜 外側(cè)膝狀體 視皮質(zhì)正常對照組 10 113.80±9.40 87.17±4.63 82.12±9.98陰性對照組 10 98.54±6.95② 73.94±4.78② 74.62±4.81①陽性對照Ⅰ組 10 105.11±4.40①③ 76.67±7.30② 81.71±8.80③陽性對照Ⅱ組 10 108.17±5.85④ 80.29±3.40 83.68±7.35③中藥低劑量組 10 108.86±6.81④ 75.46±8.04② 77.94±7.81中藥中劑量組 10 110.85±11.43④ 75.52±8.44② 80.29±4.47中藥高劑量組 10 112.75±6.98④ 88.30±8.44④⑥⑦ 88.35±8.96④⑤

十二經(jīng)脈獨肝脈以本經(jīng)直接上連目系，輸肝所受藏之精血，目系得養(yǎng)則功能正常。腦為髓海，髓由精生，腎主藏精，而目系“上屬于腦”，故腎精充沛，則髓海豐滿，目系得養(yǎng)，而功能正常。消渴目疾多發(fā)于糖尿病中后期，久病傷腎，精血不足，肝腎同源，消渴日久，肝腎俱虛，精血虧虛，目系失養(yǎng)，則視物昏朦。此外，消渴日久，久病體虛，推動無力，必血行遲緩，留滯成瘀，正如《醫(yī)林改錯》所云：“元氣既虛，必不能達于血管，血管無氣，而成瘀血?！彼巍短绞セ莘健とh論》亦有“三痟者，……皆五臟津液枯竭，經(jīng)絡(luò)血澀，營衛(wèi)不行，熱氣留滯，遂成斯疾也”的記載。綜上，肝腎虛損，目系失養(yǎng)，瘀血內(nèi)停，阻滯目絡(luò)是糖尿病導(dǎo)致視路神經(jīng)元病理改變的基本病機；滋養(yǎng)肝腎、填精補血、調(diào)和陰陽，為治本之法，活血化瘀、調(diào)理氣血、開通玄府，以兼治其標(biāo)。

Nissl小體為神經(jīng)細胞體內(nèi)的特異性嗜色質(zhì)，各種類型神經(jīng)元中Nissl小體的形態(tài)、大小和分布均不相同，正常狀態(tài)下Nissl小體一般都有固定的形態(tài)；當(dāng)神經(jīng)元受到損傷時，Nissl小體即出現(xiàn)形態(tài)變化，甚至溶解〔2〕，因而人們常借助Nissl小體的形態(tài)來辨認或鑒定神經(jīng)元的存在、分布以及是否發(fā)生生理、病理改變〔3〕；Syn I是與突觸囊泡相連的磷蛋白，它是突觸小泡特異性的外膜膜蛋白，幾乎存在于所有神經(jīng)元與神經(jīng)內(nèi)分泌細胞，由于它特異性地定位于所有軸突終末的突觸小泡膜中，故被廣泛地用作神經(jīng)軸突終末特異性標(biāo)志物，以檢測突觸的密度和分布。本實驗中，陰性對照組大鼠視網(wǎng)膜、EGB及VC17區(qū)神經(jīng)元的Niss小體和Syn I的平均灰度值均較正常對照組明顯降低，表明在高血糖持續(xù)6個月后，糖尿病大鼠視路神經(jīng)組織存在退行性改變。Syn I除可作為神經(jīng)軸突終末特異性標(biāo)志物外，尚在突觸囊泡上參與通道的形成、囊泡泡膜的融合和神經(jīng)遞質(zhì)的釋放過程〔4〕，而神經(jīng)遞質(zhì)是神經(jīng)元實現(xiàn)功能的介質(zhì)。因此，筆者認為高血糖可致糖尿病大鼠視路神經(jīng)元突觸的密度和分布減少（軸突脫失），同時可能會引起調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)釋放功能的障礙，從而影響視路神經(jīng)的傳導(dǎo)功能，引起視功能障礙。在本實驗中，視網(wǎng)膜、EGB及VC17區(qū)中藥治療組中Niss小體及Syn I平均灰度值均高于陰性對照組（P＜0.01，P＜0.05），其中以中藥高劑量組最為明顯，表明補腎活血中藥能明顯減輕糖尿病大鼠視路三級神經(jīng)元的病理損害，其作用機制可能與補腎活血中藥在一定程度上改善了糖尿病大鼠視覺通路神經(jīng)細胞突觸的密度和分布（軸突再生），及其神經(jīng)遞質(zhì)釋放調(diào)節(jié)功能有關(guān)。

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